Антимикробной активностью в отношении стрептококков
В настоящее время группа макролидов насчитывает более десяти различных антибиотиков. Все они имеют определенное структурное сходство с эритромицином, отличаясь от него по количеству атомов углерода в лактонном кольце и характеру боковых цепей. Макролиды можно классифицировать по химической структуре и по происхождению.
Химическая классификация предполагает разделение препаратов на 3 группы, в зависимости от числа атомов углерода в лактонном кольце - 14-, 15- и 16-членные, причем 15-членные препараты правильнее называть не макролидами, а азалидами, так как в кольцо включен атом азота (рис. 1).
Рис. 1. Классификация макролидов
В последнее время все большее внимание уделяют характеру сахаров, составляющих боковые цепи, так как они, например, определяют действие макролидов на синегнойную палочку.
По происхождению макролиды подразделяются на природные, полусинтетические и пролекарства. Последние представляют собой эфиры, соли и соли эфиров природных макролидов, которые характеризуются улучшенным вкусом, большей кислотоустойчивостью и более высокой и стабильной биодоступностью при приеме внутрь по сравнению с исходными продуктами, выпускаемыми в виде оснований.
Структурные особенности различных макролидов предопределяют прежде всего (1) различия в их фармакокинетических характеристиках, (2) особенности антибактериальной активности, (3) переносимости и (4) возможности взаимодействия с другими лекарствами. В то же время все макролидные антибиотики обладают одинаковым механизмом антимикробного действия и имеют в целом близкие спектры активности. Механизмы развития резистентности микрофлоры к ним также являются близкими, но тем не менее есть различия между 16-членными и другими макролидами.
Антимикробное действие макролидов обусловлено нарушением синтеза белка на этапе трансляции в клетках чувствительных микроорганизмов. Молекула антибиотика способна обратимо связываться с каталитическим пептидил-трансферазным центром (P-site) рибосомальной 50S-субъединицы и вызывать отщепление комплекса пептидил-тРНК (представляющего собой растущую пептидную цепь) от рибосомы. При этом нарушается цикличность последовательного присоединения пептидной цепи к пептидил-трансферазному центру (P-site) и акцепторному аминоацил-тРНК-центру (A-site) 50S-субъединицы, то есть ингибируются реакции транслокации и транспептидации (рис. 2). В результате приостанавливается процесс формирования и наращивания пептидной цепи. Связывание макролидов с 50S-субъединицей возможно на любой стадии рибосомального цикла [1,2]. Выявлено, что 14- и 16-членные макролиды отличаются по особенностям связывания с различными доменами пептидил-трансферазного центра (рис. 3).
Рис. 2. Механизм синтеза белка в рибосоме микробной клетки.
(M - точка приложения действия макролидов)
По P. Vanuffel, C. Cocito (1996) [2]
Связывание с 50S-субъединицами рибосом характерно также для таких антибиотиков, как линкосамиды*, стрептограмины** и хлорамфеникол. Несмотря на то, что по особенностям связывания с доменами пептидил-трансферазного центра данные антибиотики отличаются от макролидов, при одновременном назначении между ними возможна конкуренция и ослабление антимикробного эффекта [4].
ВИР-S - виргиниамицин-S; ЭРИТ - эритромицин; ВИР-М - виргиниамицин-М; СПИР - спирамицин; ЛИН - линкомицин
Рис. 3. Участки связывания различных антибиотиков с 50S-субъединицей рибосомы.
По M.Di Giambattista и соавт. (1987) [3]
* К линкосамидам относятся линкомицин и клиндамицин.
** Стрептограмины - новый класс антибиотиков, имеющих некоторое структурное сходство с макролидами. Наиболее перспективным является комбинированный препарат хинупристин/дальфопристин (Synercid ® ), обладающий in vitro высокой активностью против множественнорезистентных штаммов стафилококков и ванкомицинрезистентных E.faecium.
Характер антимикробного действия макролидов обычно является бактериостатическим. Тем не менее в определенной степени он зависит от концентрации антибиотика в очаге инфекции, вида микроорганизма, фазы его развития и степени микробной обсемененности. В высоких концентрациях (в 2-4 раза превышающих МПК) и особенно в отношении тех микроорганизмов, которые находятся в фазе роста, макролиды могут оказывать бактерицидное действие. Подобным образом они действуют на b -гемолитический стрептококк группы А, пневмококк, менингококк, возбудителей коклюша и дифтерии [5,6]. В то же время против золотистого стафилококка макролиды в большинстве случаев проявляют бактериостатический эффект.
Микробиологическая активность макролидных антибиотиков in vitro зависит от ряда факторов, во-первых, от рН среды. При этом изменение активности может быть связано не с нарушением химической структуры макролидов, а с их ионизацией в условиях повышенной кислотности, следствием чего является снижение проницаемости через цитоплазматическую мембрану бактерий. Поскольку макролиды являются слабыми основаниями, их активность возрастает в щелочной среде (рН 5,5-8,5), так как при этом они меньше ионизируются и лучше проникают внутрь микробной клетки [7]. Оптимальный эффект эритромицина, кларитромицина и особенно азитромицина проявляется при рН > 7,5, в то время как при рН 7,5 и наименее - при рH b -гемолитических стрептококков и пневмококков (использовали среду АГВ с 5% дефибринированной человеческой крови) диаметры зон подавления роста вокруг дисков с мидекамицином на среде АГВ не отличаются от полученных на агаре Мюллер-Хинтон. При тестировании штаммов гемофильной палочки на средах, приготовленных на основе АГВ (шоколадный агар, агар с дрожжевым экстрактом и факторами Х и V), диаметры зон значительно отличались от полученных на НТМ.
Таким образом, необходимо проведение дальнейших исследований, направленных на изучение возможности использования отечественной среды АГВ вместо агара Мюллер-Хинтон для определения чувствительности различных бактерий к современным макролидам, разработку критериев интерпретации результатов, а также стандартных методик тестирования микроорганизмов со сложными питательными потребностями.
В большинстве случаев отмечается полная перекрестная резистентность к макролидным антибиотикам. Поэтому на практике обычно определяют чувствительность грамположительных микроорганизмов (стрептококков и стафилококков) только к одному антибиотику из группы макролидов - обычно к эритромицину. Однако в отношении штаммов стафилококков, обладающих индуцибельной резистентностью к эритромицину, связанной с метилированием 23S фрагмента 50S-субъединицы рибосом, 16-членные макролиды (джосамицин, спирамицин, мидекамицин) проявляют активность in vitro и считаются возможной альтернативой в клинической практике. Для определения типа резистентности к макролидам у стафилококков (индуцибельный или конститутивный) используют диско-диффузионный тест для выявления антагонизма между линкомицином и эритромицином in vitro - специфического признака индуцибельного типа резистентности к макролидам, линкосамидам и стрептограминам (MLSB-тип резистентности). В этом случае штамм считается резистентным к 14- и 15-членным макролидам, но чувствительным к 16-членным макролидам и линкосамидам. В случае конститутивного типа MLSB резистентности штаммы стафилококков резистентны ко всем без исключения макролидам и линкосамидам.
В приложении I-II приведена суммарная информация по определению чувствительности к макролидным антибиотикам диско-диффузионным методом. Приведенная информация в основном соответствует стандартам NCCLS 1997 года, часть данных приведена из Доклада комитета по антибиотикам Французского общества микробиологов (SFM) в 1996 году.
Эритромицин, являющийся "золотым стандартом" среди антибиотиков класса макролидов, обладает высокой активностью прежде всего против грамположительных кокков, таких как b -гемолитический стрептококк группы A (S.pyogenes), пневмококк (S.pneumoniae), золотистый стафилококк (S.aureus), исключая метициллинорезистентные штаммы последнего.
Кроме того, он хорошо действует на возбудителя коклюша (B.pertussis), дифтерийную палочку (C.diphtheriae), моракселлу (M.catarrhalis), легионеллы (Legionella spp.), кампилобактеры (Campylobacter spp.), листерии (Listeria spp.), хламидии (C.trachomatis, C.pneumoniae), микоплазмы (M.pneumoniae), уреаплазмы (U.urealyticum).
Эритромицин умеренно активен против гемофильной палочки (H.influenzae), боррелий (B.burgdorferi) и некоторых бактероидов, включая B.fragilis. В то же время он практически не действует на грамотрицательные бактерии семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. и Acinetobacter spp., поскольку не проникает через оболочку клеток данных микроорганизмов [24].
Другие макролиды, имея в целом сходство по спектру и выраженности антимикробной активности с эритромицином, обладают некоторыми отличительными особенностями. С практической точки зрения представляет интерес сопоставление их эффекта в отношении следующих категорий микроорганизмов [25]:
-
1) активность против быстро размножающихся пиогенных кокков, чувствительных, как правило, к b -лактамным антибиотикам (особенно бензилпенициллину) и эритромицину: стафилококков, стрептококков, энтерококков, гонококков и анаэробных кокков;
-
2) активность против грамотрицательных бактерий, резистентных к бензилпенициллину и эритромицину, таких как Enterobacteriaceae и Pseudomonas spp.; к этой категории может также быть отнесен H.influenzae, поскольку вопрос о его чувствительности к эритромицину остается дискутабельным, а также грамотрицательные анаэробы;
-
3) активность против внутриклеточных возбудителей, вызывающих инфекции, при которых традиционно назначаются эритромицин или тетрациклины: Chlamydia spp., Mycoplasma spp., U.urealyticum, Campylobacter spp., Legionella spp.;
-
4) активность против микроорганизмов, борьба с которыми с помощью антибактериальных препаратов остаётся затруднительной, и поэтому есть все основания оценить эффект новых макролидов; представителями такой микрофлоры является токсоплазмы (T.gondii) и атипичные микобактерии;
-
5) активность против микроорганизмов, не входящих ни в одну из перечисленных групп.
Действия отдельных макролидных антибиотиков на быстро размножающиеся пиогенные кокки не имеет принципиальных различий (табл. 1).
Таблица 1. Активность макролидов против пиогенных кокков (МПК50, мг/л)
По J.D. Williams, A.M. Sefton (1993) [25]
|
Обращает на себя внимание превосходство азитромицина над другими препаратами по активности против N.gonorrhoeae. Наиболее слабым действием на гонококк обладает диритромицин.
В отношении S.aureus (чувствительного к метициллину) наилучший эффект проявляет кларитромицин, несколько слабее действует эритромицин и азитромицин, а наименее выраженной активностью обладает джосамицин и спирамицин. Ни один из макролидов практически не действует на штаммы S.aureus, устойчивые к эритромицину [26].
Коагулазонегативные стафилококки обладают примерно одинаковой чувствительностью к эритромицину, диритромицину и миокамицину [27,28]
Кларитромицин превосходит другие макролиды по действию на S.pyogenes, второе место по эффективности занимает эритромицин. Согласно данным Bauernfeind (1993), кларитромицин проявляет также наиболее выраженный, по сравнению с другими препаратами, эффект против стрептококков группы В (S.agalactiae) [26].
Все препараты обладают примерно равноценным по выраженности действием против пневмококка. Согласно некоторым данным, 16-членные макролиды - спирамицин и джосамицин - могут действовать на штаммы пневмококка, резистентные к пенициллину и эритромицину [29].
Активность макролидов против зеленящих стрептококков, выделенных у больных с нейтропенией в период с 1988 по 1994 год, в целом оказалась низкой, особенно в отношении пенициллинрезистентных штаммов (табл. 2), что ставит под сомнение рекомендации об их применении у таких пациентов для профилактики бактериемии [30].
Таблица 2. Активность макролидов против зеленящих стрептококков, выделенных у пациентов с нейтропенией.
По F. Alcaide и соавт. (1995) [30]
|
S - штаммы, чувствительные к пенициллину; I - штаммы, умереннорезистентные к пенициллину;
R - штаммы, резистентные к пенициллину
Энтерококк проявляет наибольшую чувствительность к спирамицину, а наименее чувствителен к рокситромицину, азитромицину и джосамицину. Однако это не имеет большого клинического значения, так как макролиды при лечении инфекций, вызванных энтерококками, не применяется.
Против анаэробных кокков наиболее активными являются кларитромицин, азитромицин, джосамицин и спирамицин, а наименее - диритромицин.
Метициллинорезистентные штаммы S.aureus устойчивы к любым макролидам [19,26]
Азитромицин превосходит другие макролиды по действию на грамотрицательные бактерии, в частности, по активности против H.influenzae, M.catarrhalis (табл. 3) и P.multocida. Ампициллинорезистентные штаммы H.influenzae могут быть несколько более устойчивыми к макролидам, чем ампициллинчувствительные [26].
Таблица 3. Активность макролидов против грамотрицательных микроорганизмов (МПК* in vitro)
По J.D. Williams (1993), A.M. Sefton (1993) [25], A. Bauernfeind (1993) [26], J.F. Desnottes (1996) [31]
|
* для B.fragilis указаны значения МПК50, для других микроорганизмов - диапазон МПК
Все макролиды, кроме диритромицина, активны против Bacteroides spp. В отношении B.fragilis умеренной активностью обладают эритромицин, кларитромицин, азитромицин, и джосамицин. Рокситромицин и спирамицин действует на него слабо, а к диритромицуну B.fragilis полностью устойчив.
Микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. и Acinetobacter spp. обладают природной устойчивостью к макролидам.
Азитромицин является наиболее активным среди макролидных антибиотиков против C.jejuni - МПК90 его равна 0,5 мг/л. Величины МПК90 эритромицина, кларитромицина и рокситромицина составляют 4,4 и 16 мг/л соответственно. Никаких различий в действии макролидов на хинолончувствительные и хинолонрезистентные штаммы кампилобактера не установлено [32]. Кларитромицин превосходит другие макролиды по действию на L.pneumophila и H.pylori [33,34].
Макролиды обладают довольно высокой активностью против хламидий, микоплазм и уреаплазм (табл. 4). Исключение составляют генитальные микоплазмы (M.hominis), в отношении которых наиболее отчетливой микробиологической активностью обладает только мидекамицин (миокамицин). Кларитромицин проявляет наиболее сильный среди других препаратов эффект против C.trachomatis. Диритромицин и мидекамицин слабо действуют на C.psittaci.
Таблица 4. Активность макролидов против внутриклеточных возбудителей (МПК in vitro)
Антагонистическое действие пробиотических лактобактерий в отношении патогенных стрептококков различных
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
доктор медицинских наук, профессор Суворов Александр Николаевич
доктор медицинских наук, профессор
доктор медицинских наук
Защита диссертации состоится 24 ноября 2008г. в 13 часов на заседании диссертационного совета ДМ при ГУ Научно-исследовательский институт РАМН Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт РАМН Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.
Ученый секретарь Диссертационного совета,
доктор медицинских наук
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Заболевания, этиологически связанные с патогенными стрептококками и энтерококками, представляют в настоящее время одну из серьезных медицинских, социальных и экономических проблем здравоохранения. Стрептококки относятся к наиболее распространенным возбудителям бактериальных инфекций человека. Патогенные стрептококки, такие как S. pyogenes, S. agalactiae и S. pneumoniae, ассоциированы с тяжелыми формами острых и хронических инфекций. В то же время стрептококки других видов и энтерококки, персистирующие у лиц с иммунодефицитами, нередко являются причиной нозокомиальных инфекций (Schouten M. A. et al., 1999; Shankar N. L. et al., 2001).
Несмотря на высокую природную чувствительность стрептококков к антибиотикам некоторых классов, в ряде случаев антимикробная терапия ими может быть ограничена аллергическими проявлениями и развитием тяжелых форм дисбиозов. Кроме того, в последние десятилетия неуклонно растет распространенность антибиотикоустойчивых штаммов (Bass J. W. et al., 1991; Yang J. H. et al., 1996; Traub W. H. et al., 1997). Указанные проблемы диктуют необходимость не только рационального применения антибиотиков, но и сочетания их с безвредными средствами, обладающими антибактериальным и противовоспалительным действием. Использование с лечебно-профилактической целью пробиотических молочнокислых бактерий (лактобацилл и энтерококков) является одним из перспективных направлений подобного решения проблемы оздоровления населения. Пробиотические препараты на основе живых лактобацилл и энтерококков относятся к числу наиболее употребляемых вследствие их высокой антагонистической активности в отношении патогенной микрофлоры.
Пробиотики чаще используют для лечения и профилактики заболеваний, связанных с различными формами нарушения качественного и количественного состава нормальной микрофлоры желудочно-кишечного и урогенитального трактов. В связи с этим антагонистическая активность молочнокислых бактерий изучена в большей степени в отношении микроорганизмов, ассоциированных с дисбиотическими состояниями. В то же время данные об антибактериальном действии пробиотических молочнокислых бактерий в отношении патогенных стрептококков и энтерококков встречаются редко и, как правило, представляют собой сообщения об активности метаболитов лактобактерий в отношении отдельных штаммов стрептококков и энтерококков (Ross K. F. et al., 1993; Upton M. А. et al., 2001; Tagg J. R. et al., 2003). Кроме того, эти исследования носят качественный характер, так как доза антагониста, ингибирующая рост индикаторных энтерококков, не определялась. Таким образом, антимикробное действие пробиотических молочнокислых бактерий в отношении стрептококков и энтерококков остается недостаточно изученным. Это составляет определенную проблему, так как широкое применение лечебно-профилактических средств на основе живых молочнокислых бактерий требует четкого обоснования использования определенных доз препаратов в терапевтических и профилактических целях.
Анализ антимикробной активности пробиотических препаратов затруднен отсутствием единых стандартных подходов, которые могли бы быть использованы для оценки и сравнения антагонистического действия различных штаммов молочнокислых бактерий в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Известно, что антагонизм лактобацилл и энтерококков обусловлен продукцией метаболитов (органических кислот, перекиси водорода, лизоцима и др.) и бактериоцинов ( и др., 2002). Однако механизмы регуляции их синтеза, а также влияние на жизнеспособность и морфофункциональные свойства стрептококков и энтерококков остаются недостаточно освещенными.
Приведенные данные свидетельствует о высокой актуальности исследований, касающихся особенностей антимикробного действия пробиотических штаммов, разработки методов изучения ингибирующей активности лактобактерий и создания условий для максимального проявления активности пробиотиков в отношении возбудителей инфекций человека, в том числе обусловленных патогенными стрептококками и энтерококками.
Цель исследования – изучить особенности антагонистического действия пробиотических штаммов лактобацилл и энтерококков в отношении патогенных стрептококков.
1. Изучить антагонистическую активность живых культур пробиотических молочнокислых бактерий (лактобацилл и энтерококков) в отношении штаммов стрептококков различных серологических групп и энтерококков, выделенных от больных с различными формами инфекции.
2. Оценить ингибирующее влияние супернатантов культур пробиотических молочнокислых бактерий на рост индикаторных штаммов стрептококков и энтерококков.
3. Изучить факторы микробного антагонизма пробиотических молочнокислых бактерий, используя молекулярно-генетические и биохимические методы.
4. Подобрать условия, способствующие повышению антагонистической активности пробиотических штаммов в системе in vitro.
Впервые предложен метод, позволяющий качественно и количественно оценивать антагонизм молочнокислых бактерий против патогенных стрептококков. Изучено антимикробное действие пробиотиков в отношении 50 штаммов стрептококков и энтерококков, установлены штаммовые, а в случае стрептококков и групповые, отличия по чувствительности к антагонистическому влиянию лактобацилл и энтерококков. В штамме Enterococcus faecium L3 впервые показана экспрессия генов, кодирующих синтез бактериоцинов (энтероцинов А и В), а также факторов регулирующих их синтез. На примере бактериоциногенного штамма E. faecium L3 продемонстрировано, что добавление в питательную среду искусственно синтезированных специфичного пептида-индуктора, повышающего уровень экспрессии бактериоцинов, а также его аналогов, приводит к значительному увеличению ингибирующей активности пробиотика.
Практическая значимость работы
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Штаммы стрептококков различных серологических групп и энтерококков обладают индивидуальной чувствительностью к антагонистическому действию пробиотических молочнокислых бактерий.
2. Низкомолекулярные пептидные фракции, выделенные из супернатанта E. faecium L3, способны подавлять рост патогенных стрептококков.
3. Штамм E. faecium L3 содержит гены трехкомпонентной сигнальной системы, ответственной за синтез бактериоцинов, с которыми связана антимикробная активность данного штамма.
4. Искусственно синтезированные пептиды-индукторы и их гомологи повышают антимикробную активность бактериоциногенных штаммов молочнокислых бактерий.
Личный вклад диссертанта
Основная часть исследований выполнена лично автором. Ряд микробиологических экспериментов проведен совместно с к. м.н. (ГУ НИИЭМ РАМН) и к. в.н. (СПбГАВМ). Выделение антимикробных пептидов из супернатанта энтерококков выполнялось при консультации сотрудников Отдела общей патологии и патофизиологии ГУ НИИЭМ РАМН к. б.н. , к. б.н. , к. б.н. Цветковой микроскопия ультраструктуры стрептококков выполнена д. б.н., проф. (, СПб). Пептиды-индукторы синтезированы к. х.н. (, СПб).
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 167 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, общее заключение, выводы, список литературы. Текст диссертации иллюстрирован 36 рисунками и 15 таблицами. Список литературы включает 180 источников, из них 19 отечественных и 161 зарубежных.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Антагонизм молочнокислых бактерий в отношении патогенных стрептококков изучали с использованием модифицированного метода двухслойного агара ( и др., 2004), определяя при этом минимальную ингибирующую дозу антагониста (МИКА).
Антимикробное действие продуктов, секретируемых пробиотическими бактериями в жидкую среду, изучали посредством турбидометрического метода, наблюдая за изменениями оптической плотности (ОD640) растущих индикаторных культур при добавлении к ним супернатантов молочнокислых бактерий и полученных из них пептидных экстрактов.
Для определения способности лактобактерий продуцировать перекись водорода использовали методику, основанную на взаимодействии этого химического соединения с йодистым калием с последующим выделением йода, дающего с крахмалом синее окрашивание (ГОСТ , 1986).
Удаление метаболитов с молекулярной массой менее 1 kDa из супернатантов культур лактобактерий выполняли посредством диализа, используя диализные мембраны Spectra/Por MWCO 1000 (США).
Пептидный экстракт из супернатанта культуры E. faecium L3 получали путем преципитации 70% сульфатом аммония. Осадок, полученный после центрифугирования преципитированной суспензии, подвергали диализу (диализные мембраны Spectra/Por MWCO 1000, США). Содержимое диализного мешка фильтровали через мембрану Amicon PM (10000 MW, США) и концентрировали с помощью центрифугирования под вакуумом на установке Speed Vac Concentretor CS 18 (Savаnt Instruments Harvegetul 1993, США).
Концентрацию белка определяли по методу Флореса (Flores R., 1978).
Выделение и очистку низкомолекулярных катионных пептидных фракций культуры E. faecium L3 выполняли путем избавления пептидного экстракта от анионных примесей с помощью хроматографической колонки, заполненной карбоксиметилцеллюлозой CM 52 (Whatman, Англия), и последующего разделения фракций по молекулярной массе путем гельфильтрации на колонке с использованием Bio-Gel P10 (Bio-Rad). Антимикробную активность пептидных фракций определяли с помощью метода радиальной диффузии (Lehrer R. I. et al., 1991).
Анализ молекулярной массы пептидов, входящих в состав фракций, проводили с использованием электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (Shagger H. et al., 1987).
Конструирование ДНК праймеров для ПЦР осуществляли с помощью программы PRIMER3 (http://www-genome. wi. mit. edu/cgi-bin/primer/primer3_www. cgi).
Анализ геномов лактобактерий на присутствие генов бактериоцинов выполняли путем выделения у бактерий ДНК и последующей постановки полимеразной цепной реакции. Экспрессию генов бактериоцинов в штамме E. faecium L3 подтверждали, используя метод обратной транскрипции.
Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерных программ Microsoft Excel и STATISTICA for Windows. Связь между категориями переменных анализировали с помощью t-критерия Стьюдента (сравнение средних значений в группах). Различия считали статистически значимыми при доверительном интервале 95% (p
Читайте также: