Гост лабораторная диагностика бруцеллеза животных

– Олег Дмитриевич, чем продиктовано принятие нового ГОСТа?

– Если быть точным, то в действие введен ГОСТ 34105-2017 (Межгосударственный стандарт. Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Серологические методы). Его появление обусловлено не только внедрением в российскую ветеринарную диагностическую практику новых серологических тестов, в частности, реакции непрямой гемагглютинации, вариантов иммуноферментного и иммунохроматографического анализа, но и целесообразностью совершенствования диагностики – прежде всего повышения ее оперативности и специфичности.

Разрабатывать этот ГОСТ начинали одновременно с подготовкой по распоряжению Минсельхоза России новых Ветеринарных правил осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления ограничений, направленных на предотвращение возникновения, распространения и ликвидацию очагов бруцеллеза животных в России (далее – новые правила). Сейчас проект правил проходит стадию согласования различными ведомствами.

Разумеется, оценка диагностических титров серологических реакций при диагностике бруцеллеза в ГОСТе и новых правилах будет одинаковой. Поэтому считаю, что до выхода в свет этих правил ветеринарные диагностические лаборатории не должны переходить на работу по ГОСТ 34105-2017.

– Потому что между ГОСТом и действующими в настоящее время Ветеринарными правилами по борьбе с бруцеллезом (ВП 13.3.1302-96) сохраняются существенные различия.

– На какие положения стандарта вы хотели бы обратить внимание специалистов в первую очередь?

– К сожалению, несмотря на то, что ГОСТ34105-2017 согласовывался специалистами стран Евразийского экономического союза, в нем сохраняются недочеты.

– Одним из таких недочетов является предписание проводить дополнительное исследование образцов сыворотки в РИД и ИФА с ОПС-антигеном в случае выявления в группах животных, иммунизированных и не иммунизированных против бруцеллеза и положительно реагирующих по результатам серологических исследований в ряде реакций. Такое требование предусмотрено пп. 8.2, 8.3 и 8.4 данного ГОСТа в целях уточнения диагноза.

– Если речь идет об уточнении диагноза, то почему вы называете это недочетом?

– Дело в том, что, по состоянию на сегодняшний день, диагностические тест-системы для иммуноферментного анализа в рамках госзаказа выделяются в ограниченном количестве. Представители большей части ветеринарных диагностических лабораторий утверждают, что им такие тест-системы будут недоступны. Соответственно, непроведение серологического тестирования в ИФА, согласно ГОСТу, будет расценено представителями надзорных учреждений как нарушение.

С учетом разницы в диагностической чувствительности между РИД с ОПС-антигеном и ИФА с ОПС-антигеном исследование последним методом является принципиальным. В противном случае при выполнении серологического исследования только в РИД с ОПС-антигеном объективность его результатов может быть сомнительной.

Не буду вдаваться в подробности других имеющих принципиальное значение недочетов, отмечу лишь, что после их обсуждения и согласования с диагностическими ветеринарными лабораториями должно быть инициировано внесение изменений в ГОСТ 34105-2017.

– Какие ошибки чаще всего допускают при лабораторной диагностике бруцеллеза?

– О существенных ошибках мне неизвестно. К тому же мы не контролируем работу лабораторий. Однако, когда специалисты ряда лабораторий обращаются к нам, чтобы обсудить спорные результаты исследований, кажется, что некоторые из них не знакомы со всеми документами, регламентирующими диагностику болезни. Впрочем, большинство специалистов проявляют инициативу и демонстрируют познания, достаточные для диагностики болезни. Не менее важно и то, что они заинтересованы в получении объективных результатов.

– Какова сегодня эпизоотическая ситуация по бруцеллезу среди крупного и мелкого рогатого скота на территории России?

В период с 2013 по 2017 годы количество неблагополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота пунктов, остававшихся на конец года, составляло 30, 28, 22, 17 и 14. Число заболевших животных – 1,9; 2,5; 2,2; 1,22 и 1,01 тыс. голов.

– Можно утверждать, что динамика положительная?

– Система контроля бруцеллеза животных в стране несовершенна?

– Сложившуюся систему контроля бруцеллеза животных в Российской Федерации можно считать удовлетворительной. Однако это не исключает необходимости ее совершенствования. Прежде всего в части сокращения временных затрат при установлении диагноза за счет более широкого применения средств дифференциальной диагностики болезни, а именно реакции иммунодиффузии и иммуноферментного анализа с ОПС-антигеном, возможно, за счет сочетания средств диагностики.

Важным представляется проведение исследований и установление возможных, максимально ранних сроков серологического исследования вакцинированных животных, особенно мелкого рогатого скота, иммунизированного агглютиногенными вакцинами. В настоящее время этим никто не занимается.

Не стоит забывать, что самый эффективный способ оздоровления неблагополучного хозяйства предусматривает ликвидацию всего поголовья в таком хозяйстве. Однако данный способ не слишком широко применяется в нашей стране. (Должен отметить, что в проекте новых правил его применение регламентировано в большем количестве случаев, нежели в Ветеринарных правилах 13.3.1302-96.) Поэтому перед проведением вакцинации животных в рамках оздоровления путем вакцинации и последующих периодических серологических исследований особенно важно максимально полно удалять инфицированных особей из групп животных.

– В нынешних условиях это реально?

– Я бы сказал, что это возможно за счет введения животным неблагополучных по бруцеллезу хозяйств провоцирующих неагглютиногенных антигенов, в отличие от применяющихся вакцин, с последующим серологическим исследованием и удалением выявленных больных животных.

При этом не могу не отметить, что организации-производители, планировавшие выпускать такие антигены, зарегистрированные ими ранее в Российской Федерации, пока не справляются со своими планами и не понятно, справятся ли.

– Что препятствует повышению эффективности системы контроля бруцеллеза?

– На мой взгляд, совершенствование этой системы не представляется возможным без решения целого ряда задач. Во-первых, нужно создавать в регионах, неблагополучных по бруцеллезу, мясокомбинаты и бойни, обеспечивающие убой больных животных, что решает проблему неполного, несвоевременного и антисанитарного убоя. При этом следует компенсировать владельцам убыток. К сожалению, он неизбежен при изъятии больных животных, прежде всего в условиях ведения отгонного животноводства.

Во-вторых, следует запретить введение нетелей и ярок в стада и отары взрослых животных. В-третьих, нужно ограничить концентрацию поголовья в хозяйствах молочного направления, которые находятся на территориях, неблагополучных по бруцеллезу. В-четвертых, необходимо оперативно завершать реализуемую в стране программу идентификации (мечения) животных.

– Несложно предположить, что для решения этих задач требуются немалые финансовые вложения.

– Конечно, но если эти задачи не решить, то искоренить бруцеллез на территории нашей страны не получится.

– Лаборатория качества и стандартизации бактерийных лекарственных средств ВГНКИ как структурное подразделение Россельхознадзора разрабатывает образцы сыворотки, которая применяется для диагностики бруцеллёза. Соответствует ли она эталонным стандартам МЭБ?

– Более 30 лет тому назад в лаборатории была разработана Национальная стандартная сыворотка анти-Бруцелла абортус, активность которой составляет 1000МЕ агглютинирующих антител/см 3 . Сыворотка предназначена для стандартизации антигена для реакции агглютинации (РА), применяемой при серологической диагностике бруцеллеза. Периодически с интервалом в пять-семь лет лаборатория готовит очередную серию сыворотки взамен предыдущей. Каждая серия стандартизуется по международной эталонной сыворотке с использованием международного стандарта антигена, предоставляемых Международным эпизоотическим бюро.

Национальная стандартная сыворотка используется и для оценки активности антигенов для других серологических реакций. Но в этой части с учетом современных требований и рекомендаций МЭБ она нуждается в совершенствовании и в изменении ее статуса.

– В заключение расскажите, пожалуйста, о приоритетных задачах вашей лаборатории.

– Традиционно лаборатория выполняет регистрационные и сертификационные испытания, осуществляет инспекционный контроль сертифицированной продукции, а также лекарственный мониторинг и выборочный контроль качества образцов средств специфической профилактики и диагностики бруцеллеза животных. Наряду с этим предполагается выполнение научно-исследовательской работы, цель которой – разработка национальных стандартных образцов сыворотки anti-Brucella abortus для стандартизации антигенов для реакции агглютинации, реакции связывания комплемента, кольцевой реакции с молоком, метода поляризации флуоресценции и иммуноферментного анализа. В частности, речь идет о трех образцах сыворотки anti-Brucella abortus для непрямого ИФА, конкурентного ИФА и поляризации флуоресценции ИФА, стандартизированных по международным стандартным сывороткам с использованием международных стандартных антигенов бруцелл.

Разработка и применение национальных стандартных образцов сыворотки анти-бруцелла абортус для стандартизации бруцеллезных антигенов, используемых в разных серологических тестах, обеспечивает объективную оценку результатов диагностики бруцеллеза в стране, а также международную гармонизацию диагностического тестирования болезни.

– Олег Дмитриевич, чем продиктовано принятие нового ГОСТа?

– На какие положения стандарта вы хотели бы обратить внимание специалистов в первую очередь?

– Если речь идет об уточнении диагноза, то почему вы называете это недочетом?

– Какие ошибки чаще всего допускают при лабораторной диагностике бруцеллеза?

– Можно утверждать, что динамика положительная?

– Система контроля бруцеллеза животных в стране несовершенна?

– В нынешних условиях это реально?

– Что препятствует повышению эффективности системы контроля бруцеллеза?

– Несложно предположить, что для решения этих задач требуются немалые финансовые вложения.

– Конечно, но если эти задачи не решить, то искоренить бруцеллез на территории нашей страны не получится.

– В заключение расскажите, пожалуйста, о приоритетных задачах вашей лаборатории.

ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ (обзор литературы)

Бруцеллез (Brucellosis) – инфекционная болезнь, вызывающая первичный остросептический инфекционный процесс у половозрелых и особенно у беременных восприимчивых животных и первично латентный инфекционный процесс у неполовозрелого молодняка. Бруцеллезом заболевают все виды сельскохозяйственных животных.

На протяжении своей истории у этой болезни было много разных названий, в том числе мальтийская и средиземноморская лихорадка, а также волнообразная лихорадка (благодаря рецидивирующему характеру лихорадки, возникающей во время болезни).

Бруцеллы – мелкие (0,3—2 мкм) палочки с закругленными концами, овальной, шарообразной или палочковидной формы. При некоторых условиях окружаются капсулой, неподвижны, спор не образуют. Грамотрицательны. По Романовскому — Гимзе окрашиваются в слабо-фиолетовый цвет. В препарате чаще всего расположены беспорядочно. Культивируются в аэробных условиях при оптимальной температуре 36°С и рН 6,8—7,2. При температуре выше 45°С и ниже 6°С роста не наблюдается.

Бруцеллы проникают из внешней среды в организм через слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы, конъюнктиву, а также через поврежденную кожу.

Бруцеллы способны довольно долго сохраняться во внешней среде. В зависимости от температуры они живут в почве до 3—4 мес, в воде — 4—5 мес, на белье, загрязненном выделениями больного, в мясе — до 1 мес, в молоке — до 40 дней, в сливочном масле — 10—29 дней. При воздействии высокой температуры быстро гибнут: при 60°С через 30 мин, при кипячении почти моментально.Более устойчивы к низким температурам: при 5—8°С сохраняют жизнеспособность на протяжении 35 дней.

Из эпизоотологических данных учитывают благополучие местности по бруцеллезу, факты приобретения животных из других хозяйств. При клиническом обследовании животных обращают внимание на наличие абортов, задержание последов, эндометритов, а у самцов - бурситов, орхитов.

Для бактериологического исследования в лабораторию посылают: абортированный плод целиком с плодовыми оболочками или в исключительных случаях желудок плода с содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, паренхиматозные органы плода и плодовые оболочки. В крайнем случае, на исследование можно послать слизь и другие выделения из матки абортировавшего животного.Кроме того, в лабораторию направляют содержимое гигром (бурситов), абсцессов, влагалищную слизь, молоко.

Лабораторная диагностика бруцеллеза проводится согласно нормативным правовым и методическим документам, определяющим порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней.

Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание.

Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических антител в сыворотке крови животных в реакции агглютинации (РА) в пробирках, реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК), реакции иммунодиффузии с 0-полисахаридным антигеном (РИД), пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба - РБП) и в молоке коров - кольцевой реакции (КР) и других реакциях, утвержденных в установленном порядке.

При проведении плановых диагностических исследований животных на бруцеллез в благополучных по этой болезни зонах обычно применяют реакцию агглютинации (РА) или Роз бенгал пробу (РБП). При этом, особенно в весеннее время, при исследовании сыворотки крови отдельных незараженных и не вакцированных против бруцеллеза животных с бруцеллезными антигенами могут быть получены неспецифические результаты реакций. Обычно появление таких реакций обусловлено глубокой беременностью, стрессами, прививками против других болезней или носительством близкородственных в антигенном отношении грамотрицательных микроорганизмов (пастерелл, сальмонелл, кампилобактерий,иерсиний и др.), а также рядом других причин.

Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологическое, серологическое и молекулярно-генетическое) исследования материала и аллергических (у свиней) исследованих в хозяйствах.

Плановые серологические исследования являются основным методом выявления больных и подозрительных по заболеванию животных.

Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) проводят в случае аборта и при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, из хозяйств, благополучных по данному заболеванию.

При взятии проб крови, молока и патологического материала, а также проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.

Таким образом, учитывая эпизоотологические, клинические и патологоанатомические данные, окончательная диагностика осуществляется на основании лабораторных исследований.

Во всех случаях аборта проводят бактериологическое исследование плода (желудок) и ставят биопробу. Основной метод прижизненной диагностики бруцеллеза – серологический (РА, РСК, РДСК, РБП – розбенгалпроба и КР с молоком). Кроме того, у овец, коз и свиней используют аллергическую пробу. Бактериологические исследования проводят в случае аборта или появления других признаков бруцеллеза..

При постановке диагноза исключают кампилобактериоз, хламидиоз, инфекционный эпидидимит, лептоспироз, сальмонеллез, незаразные болезни с симптомами аборт.

Список используемых источников

Асонов Н.Р. Микробиология.:учебник / Н.Р. Асонов - М.: Колос, 2017. - 352 с.

Воронин Е.С. Ветеринарная микробиология и иммунология.:учебник / Е.С. Воронин - М.: КолосС 2013 – 671 с.

Кисленко, В.Н. Ветеринарная микробиология и иммунология :учебник / Кисленоко В.Н., Н. М. Колычев. - М. : КолосС - Ч.2: Иммунология 2012. – 115 c.

Филдс Б.Н. Вирусология:учебник / Б.Н. Филдс - Москва, 2011. – 492 с.

4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических

антител в сыворотке крови животных с помощью реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции

связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК),

пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба - РБП) и в молоке

коров - кольцевой реакции (КР).

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).

4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при

диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей,

собак, пушных зверей и животных других видов.

4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от

больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА

и РСК и дату изготовления;

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием

или полученная в лаборатории;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Приложение N 2, п. 6);

раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей,

верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и

антигена используют фенолизированный (0,5-процентный) физиологический раствор хлорида

натрия (0,85-процентный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов - 5-процентный

и оленей - 10-процентный фенолизированный раствор хлорида натрия (см. Приложение N 2, п. 1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации.

Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:

при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак - 1:25, 1:50, 1:100 и

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов - 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

пушных зверей и морских свинок - 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или

групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках

первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота,

лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл

соответствующего раствора хлорида натрия, получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови

овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего

раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок

берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5).

Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда

штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего,

четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из

пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго

и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках

третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления

переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда - в пятый. Из пробирок

пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные

разведения одновременно 10 сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными

сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего

устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим

раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке

удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50,

1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества

сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты

реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей)

или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток

овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена,

разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения

сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят

с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;

с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками

осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 - 38 °С на 16 - 20 часов, затем выдерживают

при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в

крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) - полное просветление жидкости, микробные тела

осели на дно пробирки в виде "зонтика", при легком

встряхивании "зонтик" разбивается на хлопья и

а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) - неполное просветление жидкости и хорошо выраженный

"зонтик" (75% агглютинации);

++ (2 креста) - просветление жидкости, "зонтик" умеренно выражен

+ (1 крест) - едва заметное просветление жидкости, "зонтик"

слабо, при встряхивании заметно небольшое

хлопьев или комочков (25% агглютинации);

- (знак минус) - просветления жидкости и образования "зонтика" не

наступило, на дне пробирки виден "пунктик" осевших

микробов антигена, при легком встряхивании

За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла

агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц

(ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME,

1:200 - 200 ME и т.п.).

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности,

соответствующие 0 (нулю), 25, 50 и 75% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем

в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного

физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания

пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по

0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50

и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой пробирке просветление отсутствует.

Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате

одновременно с основной реакцией.

Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем

сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.

При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие

агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений,

исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации.

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного

рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME - международных единиц

антител), коз, овец, буйволов, оленей и собак - с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских

свинок - с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.

Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с

сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с

сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.

При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного

исследуют повторно через 3 - 4 недели.

На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет

получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая

оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр)

сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах

(например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или

более - "положительная 100 ME"; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более -

"сомнительная 50 ME").

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его

годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакция длительного

связывания комплемента на холоде (РДСК).

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного

рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо

РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике

инфекционного эпидидимита баранов.

4.3.2. Компоненты реакций и их подготовка к работе:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная

от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике

или полученная в лаборатории.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной

бане в день постановки реакции: для РСК - при 60 - 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов

и мулов - при 64 - 65 °С, буйволов - при 62 - 64 °С в течение 30 мин., свиней - при 60 - 62° в течение

50 мин.); для РДСК сыворотки крови животных всех видов - при 63 - 64 °С в течение 30 мин.;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре,

указанном предприятием, его изготовившим (см. Приложение N 2, п. 6);

комплемент - сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4%

борной кислоты или лиофильно высушенная). При использовании в качестве комплемента свежей

или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента

проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. Приложение N

Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на

этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для

проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну

пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для

титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при плюс 2 - 4 °С;

гемолитическая сыворотка (гемолизин) - для РСК в удвоенном титре, для РДСК - в утроенном.

Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой

новой серии (см. Приложение N 2, п. 5);

эритроциты барана - 2,5-процентная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе

для РСК и 3-процентная для РДСК (см. Приложение N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и

гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в

термостате при 37 °С в течение 15 - 20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь

физиологический раствор - 0,85-процентный раствор химически чистого хлорида натрия в

дистиллированной воде рН = 7,3 - 7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и

кальция (см. Приложение N 2, п. 2).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции

и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

¦ Комплемент в разведении ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦ - ¦ -

¦ Гемолизин в рабочем титре ¦ 0,2 ¦ - ¦ 0,2 ¦ - ¦ -

¦ Антиген в рабочем титре ¦ 0,4 ¦ - ¦ - ¦ 0,4 ¦ -

¦ Эритроциты (2,5% или 3%) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2

¦ Физиологический раствор ¦ - ¦ 0,6 ¦ 0,6 ¦ 0,2

¦ водяная баня 10 минут при 37 -

¦ Результат: гемолиз полная задержка

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и

4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента.

Реакцию проводят в водяной бане при 37 - 38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента -

сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).

Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической

системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных,

которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.

Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл

физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и разливают по 0,2 мл в

два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в

возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой

пробирке) количество физиологического раствора.

После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл

антигена в рабочем разведении, а во второй ряд - по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки

ставят в водяную баню при 37 - 38 °С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл

гемолитической системы, встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 мин., после чего

Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной

Читайте также: