Какие питательные среды используются для выращивания стрептококков

Таблица 6 - Экология и патогенные свойства стрептококков

Лабораторная диагностика стрептококкозов

Ранее в род Streptococcus включали пиогенные стрептококки, энтерококки и молочнокислые стрептококки, которые в настоящее время отнесены соот­ветственно в самостоятельные роды Streptococcus, Еnterococcus и Lactococcus. В данном разделе рассматриваются вопросы лабораторной диагностики болезней, вызываемых видами родов Streptococcus и Еnterococcus.

Виды рода Streptococcus имеют клетки сферические или овальные, диа­метром 0,5-2 мкм, при росте в жидкой питательной среде клетки парные или в виде цепочек. Клетки грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, иногда имеют капсулу. Факультативные анаэробы, каталазоотрицательные, растут в диапазоне температур 25-45° С.

Вид стрептококка	Естественная среда обитания	Вызываемая патология
S. рneumoniае '	Верхние дыхательные пути	Септицемия, воспаление суставов, при подостром течении пневмония, воспаление кишечника у телят, ягнят, реже у поросят
S. руoqenes	Верхние дыхательные пути	Иногда маститы у коров, лимфан­гит жеребят
S. equi sudsp. equi	Миндалины лошадей	Лошади - маститы, мыт
S. equi sudsp . equisimilis	Вагина и кожа лошадей	Маститы, эндометриты лошадей
S. equi zooepidemicus	Слизистые и кожа свиноматок, овец, кур, вагина и кожа лошадей	Крупный рогатый скот - маститы и метриты; свиньи — септицемия и артриты у 1-3-недельных поросят; ягнята- пневмонии; птица — септицемия; лошади - аборты, маститы, пневмонии
S. agalactiae	Молочные каналы	Крупный рогатый скот, овцы, козы - маститы; собаки - септицемия щенков; кошки - маститы
S. dysagalactiae	Гениталии и носовая по­лость крупного рогатого скота, овец	Крупный рогатый скот - маститы, эндометриты; ягнята - полиартриты
S. dysagalactiae equisimilis	Вагина и кожа лошадей	Лошади - эндометриты, маститы
S. porcinus	Слизистые свиней	Свиньи - лимфадениты поросят
S. suis mun	Носовая полость, минда­лины свиней	Свиньи — артриты, менингиты, сеп­тицемия молодняка
S. uderis 2	Миндалины, вагина, ко­жа крупного рогатого скота	Крупный рогатый скот — маститы
S. canis	Слизистые, генитальный тракт плотоядных	Плотоядные - септицемия новоро­жденных, поражения гениталиев, кожи
S. bovis, S. equines 2	Кишечный тракт многих видов животных	Возбудители оппортунистических инфекционных болезней

Патогенные свойства и экология патогенных стрептококков представ­лены в табл. 6.

Энтерококки (Е. faecalis, E. faecium, E. durans) обитают в кишечном тракте многих видов животных, могут быть причиной оппортунистических инфекций и септицемии у кур, маститов коров, инфекций мочевого тракта у собак, эндокардитов у ягнят и крупного рогатого скота.

Лабораторная диагностика стрептококкозов основана на результатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование. Для исследования на стрептококковую инфекцию животных в лабораторию направляют кровь сердца, печень, селезенку, головной мозг и трубчатую кость. При пневмониях дополнительно берут кусочки легкого на границе здоровой и пораженной тканей, средостенные лимфатические узлы, при артритах - сино­виальную жидкость. Трупы мелких животных доставляют целиком. В случае маститов направляют секрет пораженной доли вымени, эндометритов — со­держимое влагалища, взятое при помощи стерильных тампонов.

Учитывая малую устойчивость возбудителя материал должен быть дос­тавлен не позднее 6 часов после гибели или убоя животного при условии транспортировки его в термосе со льдом (4-6°С). При более высокой тем­пературе срок доставки материала не должен превышать 2-3 часа.

Микроскопическое исследование исходного материала. Готовят мазки, окрашивают по Граму, при подозрении на наличие капсулообразующих стрептококков препараты окрашивают на капсулы по Ро­мановскому-Гимза, Ольту и др. Мазки из молока можно окрашивать по Граму, используя методы, нивелирующие присутствие жира и белка.

Клетки S. рneumoniае в окрашенных препаратах овальные или сфери­ческие, размером 0,5-1,25 мкм, обычно парные, причем соприкасающиеся стороны клеток уплощены, а наружные вытянуты и заострены (ланцето­видный диплококк). Также клетки могут располагаться одиночно, корот­кими цепочками, окружены капсулой.

Клетки S. equi сферической или овальной формы, размером
0,6-1,0 мкм, располагаются одиночно, парами, короткими цепочками, в мазках из гноя в виде длинных цепочек, имеют капсулу.

Клетки S. agalactiae (S. dysagalactiae) сферические, размером 0,6-
1,2 мкм, чаще располагаются в виде коротких или средней длины цепочек.

Клетки S. руoqenes сферические, размером 0,5-1,0 мкм, в виде корот­ких или длинных цепочек (в бульоне длинные цепочки). Энтерококки име­ют овальную форму, размер 0,6-2,0х0,6-2,5 мкм, располагаются пара­ми или короткими цепочками.

Результаты микроскопического исследования, с учетом полиморфизма бактерий на фоне лекарственной терапии, имеют ориентировочное диагно­стическое значение.

Культивирование. Стрептококки - факультативные анаэробы. Исследуемый материал вы­севают на кровяной, глюкозо-кровяной агар (кровь барана или крупного рогатого скота), глюкозо-сывороточный МПБ (рН 7,4-7,8). Контаминированный материал засевают на селективные среды: агар с антибиотика­ми, азидом натрия; образцы молока целесообразно высевать на среду Эд­варда для выявления гемолиза и гидролиза эскулина.

Для обнаружения энтерококков используют специальные селективные среды: молочно-полимиксиновая среда Калины, желчно-кровяной агар Беленького и др. Посевы инкубируют при 37-38° С в течение 24-
48 ча­сов.

Характер роста стрептококков на питательных средах. На глюкозо-кровяном агаре стрептококки в основном растут в виде мел­ких, прозрачных или слегка мутноватых колоний с ровными краями, как правило окруженных зоной гемолиза. Различают α- и β-гемолитические стрептококки.

Гемолиз типа α-: неполный гемолиз, часто с зеленоватым оттенком за счет перехода гемоглобина в метгемоглобин, далее обычно находится уз­кая зона β -гемолиза.

β -гемолиз - полный гемолиз эритроцитов. Отсутствие разруше­ния эритроцитов и гемоглобина обозначают как γ-гемолиз. Гемоли­тическая активность различных видов стрептококков представлена в табл. 7.

Глава 15. Стрептококки

К роду Streptococcus относятся: Streptococcus pyogenes (гемолитический) и Streptococcus pneumoniae (пневмококк). Впервые стрептококки были обнаружены Бильротом (1874), Л. Пастером (1879). Изучены они были Э. Розенбахом (1884).

Морфология. Стрептококки - это кокки, имеющие шаровидную форму. Диаметр каждого кокка в среднем 0,6-1 мкм, однако для них характерен полиморфизм: встречаются мелкие и крупные кокки, строго шаровидные и овальные. Стрептококки располагаются цепочкой, что является результатом деления их в одной плоскости. Длина цепочек разная. На плотной питательной среде цепочки обычно короткие, на жидких - длинные. Стрептококки неподвижны, не имеют спор (см. рис. 4) Свежевыделенные культуры иногда образуют капсулу. На ультратонких срезах видна микрокапсула, под ней расположена трехслойная клеточная стенка и трехслойная цитоплазматическая мембрана. Грамположительны.

Культивирование. Стрептококки - факультативные анаэробы. Растут при температуре 37° С и рН среды 7,6-7,8. Оптимальными средами для их выращивания являются среды, содержащие кровь или сыворотку крови. На плотных питательных средах колонии стрептококков мелкие, плоские, мутные, сероватого цвета. На агаре с кровью некоторые разновидности стрептококков образуют гемолиз. β-Гемолитические стрептококки образуют четкую зону гемолиза, α-гемолитические стрептококки образуют небольшую зеленоватую зону (результат перехода гемоглобина в метгемоглобин). Встречаются стрептококки, не дающие гемолиза.

На сахарном бульоне стрептококки растут с образованием пристеночного и придонного мелкозернистого осадка, бульон при этом остается прозрачным.

Ферментативные свойства. Стрептококки обладают сахаролитическими свойствами. Они расщепляют глюкозу, лактозу, сахарозу, маннит (не всегда) и мальтозу с образованием кислоты. Протеолитические свойства у них слабо выражены. Они свертывают молоко, желатин не разжижают.

Токсинообразование. Стрептококки образуют ряд экзотоксинов: 1) стрептолизины - разрушают эритроциты (О-стрептолизин обладает кардиотоксическим действием); 2) лейкоцидин - разрушает лейкоциты (образуется высоковирулентными штаммами); 3) эритрогенный (скарлатинозный) токсин - обусловливает клиническую картину скарлатины - интоксикацию, сосудистые реакции, сыпь и пр. Синтез эритрогенного токсина детерминирован профагом; 4) цитотоксины - обладают способностью вызывать гломерулонефрит.

Антигенная структура и классификация. У стрептококков обнаружены различные антигены. В цитоплазме клетки содержится видовой нуклеопротеидной природы антиген - единый для всех стрептококков. На поверхности клеточной стенки расположены протеиновые типовые антигены. В клеточной стенке стрептококков обнаружен полисахаридный групповой антиген.

По составу полисахаридной группоспецифической фракции антигена все стрептококки делятся на группы, обозначаемые большими латинскими буквами А, В, С, D и т. д. до S. Кроме групп, стрептококки разделены на серологические типы, которые обозначаются арабскими цифрами.

Группа А включает 70 типов. В эту группу входит большинство стрептококков, вызывающих различные заболевания у человека. Группа В включает в основном условно-патогенные для человека стрептококки. Группа С включает патогенные для человека и животных стрептококки. Группа D состоит из непатогенных для человека стрептококков, однако в эту группу входят энтерококки, которые являются обитателями кишечного тракта человека и животных. Попадая в другие органы, они обусловливают воспалительные процессы: холециститы, пиелиты и др. Таким образом, их можно отнести к условно-патогенным микробам.

Принадлежность выделенных культур к одной из серологических групп определяют с помощью реакции преципитации с групповыми сыворотками. Для определения серологических типов используют реакцию агглютинации с типоспецифическими сыворотками.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Стрептококки довольно устойчивы в окружающей среде. При температуре 60° С погибают через 30 мин.

В высушенном гное и мокроте они сохраняются месяцами. Обычные концентрации дезинфицирующих веществ губят их через 15-20 мин. Энтерококки значительно устойчивее, дезинфицирующие растворы убивают их только через 50-60 мин.

Восприимчивость животных. К патогенным стрептококкам чувствителен рогатый скот, лошади, собаки, птицы. Из лабораторных животных чувствительны кролики и белые мыши. Однако стрептококки, патогенные для человека, не всегда патогенны для экспериментальных животных.

Источники инфекции. Люди (больные и носители), реже животные или инфицированные продукты.

Пути передачи. Воздушно-капельный и воздушно-пылевой, иногда пищевой, возможен контактно-бытовой.

Заболевания могут возникать в результате экзогенного заражения, а также эндогенно - при активации условно-патогенных стрептококков, обитающих на слизистых оболочках зева, носоглотки, влагалища. Снижение сопротивляемости организма (охлаждение, голодание, переутомление и пр.) может привести к возникновению аутоинфекций.

Большое значение в патогенезе стрептококковых инфекций имеет предварительная сенсибилизация - как следствие ранее перенесенного заболевания стрептококковой этиологии.

При проникновении в кровяное русло стрептококки обусловливают тяжело протекающий септический процесс.

Заболевания у человека чаще вызывают β-гемолитические стрептококки серологической группы А. Они продуцируют ферменты патогенности: гиалуронидазу, фибринолизин (стрептокиназу), дезоксирибонуклеазу и др. Кроме того, у стрептококков обнаруживают капсулу, М-протеин, обладающие антифагоцитарными свойствами.

Стрептококки вызывают у человека различные острые и хронически протекающие инфекции, как с образованием гноя, так и не нагноительные, различающиеся по клинической картине и патогенезу. Нагноительные - флегмоны, абсцессы, раневые инфекции, ненагноительные - острые инфекции верхних дыхательных путей, рожистое воспаление, скарлатина, ревматизм и др.

Стрептококки часто вызывают вторичные инфекции при гриппе, кори, коклюше и других заболеваниях и нередко осложняют раневые инфекции.

Иммунитет. По характеру иммунитет - антитоксический и антибактериальный. Постинфекционный антимикробный иммунитет малонапряженный. Это объясняется слабой иммуногенностью стрептококков и большим количеством сероваров, не дающих перекрестного иммунитета. Кроме этого, при стрептококковых заболеваниях наблюдается аллергизация организма, чем объясняют склонность к рецидивам.

Профилактика. Сводится к санитарно-гигиеническим мероприятиям, укреплению общей резистентности организма. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение. Применяют антибиотики. Чаще используют пенициллин, к которому стрептококки не приобрели устойчивости, а также эритромицин и тетрациклин.

Значение стрептококка в этиологии ревмокардита. Патогенез ревмокардитов изучен недостаточно. Но в пользу роли стрептококка в развитии этого заболевания говорит ряд фактов:

1. У больных ревмокардитом из зева высевают В-гемолитический стрептококк.

2. Ревматизм часто возникает после перенесенной ангины, тонзиллитов, фарингитов, сенсибилизирующих организм.

3. В сыворотке крови больных обнаруживают антистрептолизин, антистрептогиалуронидазу - антитела к стрептококковым ферментам, токсинам.

4. Косвенным подтверждением роли стрептококка является успешное лечение пенициллином.

В последнее время в возникновении хронических форм ревмокардита придают значение L-формам стрептококка.

Профилактика обострений ревмокардита сводится к предупреждению стрептококковых заболеваний (например, весной и осенью проводят профилактический курс введения пенициллина). Лечение сводится к применению антибактериальных препаратов - пенициллина.

Значение стрептококка в этиологии скарлатины. Г. Н. Габричевский (1902) впервые высказал предположение о том, что гемолитический стрептококк является возбудителем скарлатины. Но так как стрептококки, выделяемые при других заболеваниях, не отличались от возбудителей скарлатины, то это мнение не всеми разделялось. В настоящее время установлено, что скарлатину вызывают стрептококки группы А, вырабатывающие эритрогенный токсин.

У переболевших возникает иммунитет - стойкий, антитоксический. Его напряженность определяют постановкой реакции Дика - внутрикожным введением эритрогенного токсина. У не болевших вокруг места введения возникают гиперемия и отек, что характеризуется как положительная реакция (отсутствие антитоксина в сыворотке крови). У переболевших такая реакция отсутствует, так как образовавшийся у них антитоксин нейтрализует эритрогенный токсин.

Профилактика. Изоляция, госпитализация. Контактным, ослабленным детям вводят гамма-глобулин. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение. Используют пенициллин, тетрациклин. В тяжелых случаях вводят антитоксическую сыворотку.

Цель исследования: выявление стрептококка и определение его серовара.

1. Слизь из зева (ангина, скарлатина).

2. Соскоб с пораженного участка кожи (рожа, стрептодермия).

5. Кровь (подозрение на сепсис; эндокардит).

Способы сбора материала

Глюкозо-сывороточный бульон. К свежему стерильному МПБ (рН 7,4-7,6) добавляют 10% нормальной инактивированной сыво­ротки крови лошади и 1% глюкозы. Сыворотку и глюкозу предпо­чтительнее стерилизовать фильтрацией.

Глюкозо-кровяной агар. К расплавленному МПА с температурой около 45°С добавляют 1% глюкозы и 5—10% стерильной дефибринированной крови барана или кролика. Приготовленный агар разли­вают в чашки Петри.

Среда Эдварда (пропись фирмы Oxoid, 1982). В 1 л дистиллирован­ной воды растворяют 10 г пептона, 10 г сухого мясного экстракта, 1 г эскулина, 5 г натрия хлорида, 0,0013 г кристаллвиолета, 0,33 г таллия сульфата и 15 г агара; устанавливают рН 7,4, Стерилизуют при 115° С 20 минут. К охлажденному до 45° С агару добавляют 5% стерильной дефибринированной крови овцы или крупного рогатого скота и разли­вают в чашки Петри. Среда обладает селективными свойствами. Используют для выде­ления S. agalactiae.

Кровяной агар с азидом натрия (пропись фирмы Oxoid, 1982). В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г триптозы, 3 г сухого мясного экстракта, 5 г натрия хлорида, 0,2 г азида натрия, 12 г агара; устанавливают рН 7,2, автоклавируют при 121°С 15 минут. К расплав­ленному агару с температурой 45°С добавляют 5% стерильной крови овцы, перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда предназначена для выделения патогенных стрептококков из материалов, контаминированных посторонней микрофлорой. Азид натрия подавляет рост многих грамотрицательных бактерий.

Селективная среда с антибиотиками (пропись фирмы Oxoid, 1982). В расплавленную и охлажденную агаровую среду добавляют 7% дефибринированной крови барана и антибиотики (на 1000 мл среды): налидиксовой кислоты - 7,5 мг, полимиксина В - 17000 ЕД, неомицина (или неомицина сульфата) - 2,12 мг. Каждый антибиотик пред­варительно растворяют в 20 мл стерильной дистиллированной воды, Готовую среду используют в течение 48 ч при хранении в холодиль­нике (4-8°С). На среде ингибируется рост стафилококков, синегнойной палоч­ки, энтеробактерий, клебсиелл и предотвращается роение протея. Если после засева на поверхность среды положить полоски фильт­ровальной бумаги (диски), пропитанные бацитрацином (10 ЕД), то можно дифференцировать стрептококки серогруппы А (чувствитель­ные к бацитрацину) от (3-гемолитических стрептококков других групп, устойчивых к бацитрацину (Streatmer et al., 1962).

Молочная среда с полимиксином по Калине (для энтерококков). К 85 мл расплавленного МПА с температурой 45°С добавляют 1,25 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета, 0,5 мл 10%-ного вод­ного раствора 2,3,5-ТТХ, 15 мл стерильного обезжиренного молока, 20-40 ЕД/мл полимиксина М. Среда, разлитая в чашки Петри, пригод­на для использования в течение 7—10 дней при условии хранения в хо­лодильнике (4°С). Типичные колонии энтерококков имеют округлую форму, ровные края, блестящую поверхность, диаметр 1,5-2 мм, крас­новатую окраску с зоной протеолиза на светло-голубом фоне.

Желчно-кровяной агар Беленького (для энтерококков). К 600 мл 3%-ного расплавленного МПА добавляют 400 мл нативной профиль­трованной желчи. Стерилизуют при 115°С 30 минут. К охлажденному до 45°С агару добавляют 5% дефибринированной крови и разливают по чашкам Петри. На среде растут энтерококки, но не растут гноерод­ные и оральные стрептококки.

Энтерококковая дифференциально-диагностическая среда. К 1000 мл расплавленного МПА, имеющего температуру 45-50°С, перед употреблением добавляют 0,1 г ТТХ (2,3,5-трифенилтетразолийхлорид), 12,5 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета, 0,1 кислоты, 20% обезжиренного молока, 1% глюкозы, 5% стерильной дефибринированной крови. Компоненты перемешива­ют и разливают по чашкам Петри. ТТХ и налидиксовую кислоту предва­рительно растворяют в небольшом количестве МПБ. Колонии S. faecalis вишнево-красного цвета, S. faecium — бесцветные или белого.

Щелочно-полимиксиновая среда Г. П. Калины (для энтерококков). Готовят отдельно три раствора.

Раствор 1: 23 мл МПБ, 1 г глюкозы, 0,5 г натрия хлорида, 2 г дрожжевого экстракта.

Раствор 2: 25 мл дистиллированной воды, 0,53 г Nа₂СО₃.

Раствор 3: 25 мл дистиллированной воды, 0,25 г двухосновного фосфата калия. Смеси стерилизуют раздельно при 112°С 12 минут.

После стерилизации все три раствора смешивают, устанавливают рН 10-10,2, добавляют воды до 100 мл, 1,6%-ного спиртового раство­ра бромтимолового синего, 200 ЕД/мл полимиксина М. Среду раз­ливают по 5 мл в пробирки.

Среда Эндо (фуксин-сульфитный агар с полимиксином и кристаллвиолетом для энтерококков). К расплавленной среде Эндо добавляют 200 ЕД/мл полимиксина М и 1,25 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета на 100 мл среды. Колонии энтерококков ярко-крас­ного цвета.

Желчно-цитратная среда (для энтерококков). К 100 мл МПА до­бавляют 20 мл дрожжевого автолизата, 100 мл желчи, 40 г цитрата натрия. Смесь кипятят на водяной бане, добавляют 0,1 г трифенилтетразолия хлористого и 200 ЕД/мл полимиксина М. Колонии энтеро­кокков розово-красного цвета.

Изобретение предназначено для накопления биомассы стрептококков. Среда содержит компоненты в следующем соотношении, г на 1 л дистиллированной воды: лимонная кислота 4,9-5,0, фосфорнокислый калий двухзамещенный 4,9-5,0, хлористый натрий 1,9-2,0 сернокислый магний 4,9-5,0, сернокислое железо 0,04-0,05, аспарагин 0,9-1,0, гликокол 0,9-1,0 и глицерин 30,0-31,0 мл. Среда обеспечивает хороший и бурный рост стрептококков с первого дня инкубирования и позволяет при 4-5-кратном пассировании и плотности посева 90-100 млн. микробных клеток (м.к.) в 1 мл среды стабилизировать и обеспечить максимальное накопление биомассы до 10-12 млрд. м.к. в 1 мл культуральной жидкости.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к разработке питательной среды для выращивания стрептококков.

Известно использование бульона Хоттингера и питательной среды для выращивания энтерококков, содержащей панкреатический гидролизат серопротеина или альбумина, полученных из отходов глобулинового производства (Бошьян Е.Г с соавт. А.С. N 1412283 и N 1418284, 1986 г.).

Недостатком является сложность технологического процесса приготовления питательной среды, трудности в ее стандартизации.

За прототип взята среда N 2 Курской биофабрики, используемая в биологической промышленности для выращивания микобактерий туберкулеза и состоящая из следующих компонентов в граммах на 1 литр дистиллированной воды: лимонная кислота - 10,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный - 5,0; лимоннокислый аммоний - 5,0; хлористый натрий - 0,5; сернокислый магний - 0,5; сернокислое железо - 0,05; сернокислый цинк - 0,1; хлористый кобальт - 0,002; глицерин - 50; аспарагин - 1,0; гликокол - 1,0.

Среда представляет собой солевые питательные растворы, отличающиеся высокими питательными свойствами для микроорганизмов.

Попытки использовать для выращивания стрептококков данную синтетическую среду не имели положительного результата. Пересеянная с мясо-пептонного бульона (МПБ) на жидкую синтетическую среду культура стрептококков не обеспечивала надлежащий рост микроорганизмов. В отдельных пробирках, флаконах, колбах рост биомассы стрептококков составлял не более 1 - 2 млрд. микробных тел в 1 мл, что неэффективно.

Цель предлагаемого изобретения - разработка среды для выращивания стрептококков с большим содержанием микробных тел в 1 мл культуральной жидкости, пригодной для промышленного культивирования стрептококков при производстве стрептококковых антигенов и вакцинных препаратов.

Разработанная среда содержит компоненты в следующем соотношении на 1 литр дистиллированной воды: лимонная кислота - 4,9 - 5,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный - 4,9 - 5,0; хлористый натрий - 1,9 - 2,0; сернокислый магний - 4,9 - 5,0; сернокислое железо - 0,04 - 0,05; аспарагин - 0,9 - 1,0; гликокол - 0,9 - 1,0 и глицерин 30,0 - 31,0 мл.

Результаты исследований показали, что при увеличении содержания в питательной среде хлористого натрия с 0,5 до 1,5; 2,0; 2,5 г обеспечивалось последовательное накопление биомассы стрептококков соответственно 2 - 2,5; 3 - 3,5; 3,5 - 4,0; 3,5 - 4,0 млрд. микробных тел в 1 мл культуральной жидкости. Дальнейшее, начиная с 2 - 2,5 г/л, увеличение содержания в питательной среде хлористого натрия не сопровождалось увеличением биомассы стрептококков.

Лучшие результаты по накоплению биомассы стрептококков, до 8 - 9 млрд. микробных тел в 1 мл культуральной жидкости были получены на вариантах сред при уменьшении количества лимонной кислоты с 10 г до 5 г. Дальнейшее уменьшение количества лимонной кислоты в питательной среде до 4,8 - 4,5 г/л не сопровождалось увеличением биомассы стрептококков.

Увеличение содержания в питательной среде сернокислого магния с 0,5 г до 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 5,5 г/л обеспечивало последовательное накопление биомассы стрептококков 4 - 4,5; 5 - 6; 6 - 7; 7,5 - 8; 8,5 - 9; 8,5 - 9 млрд. микробных тел в 1 мл культуральной жидкости. Дальнейшее, начиная с 5 - 5,5 г/л, увеличение содержания в питательной среде сернокислого магния не сопровождалось увеличением биомассы стрептококков.

Снижение в питательной среде глицерина с 50 до 30 мл не влияло ни на увеличение, ни на снижение интенсивности роста и накопления биомассы стрептококков. В то же время дальнейшее уменьшение содержания в питательной среде глицерина, начиная с 30 до 25 мл, сопровождалось снижением накопления биомассы стрептококков. Таким образом установлено, что оптимальное количество содержания глицерина в питательной среде определено в пределах 30 - 31 мл.

Следует отметить, что в ходе поисковых опытов нами не отмечено влияние на рост стрептококков хлористого кобальта, лимоннокислого аммония и сернокислого цинка, в связи с чем они были исключены из компонентов нового варианта среды.

Таким образом, использование данного варианта жидкой солевой синтетической питательной среды обеспечивало хороший и бурный рост стрептококков с первого дня инкубирования и позволяло при 4-5-кратном пассировании на ней микробов, при плотности посева до 90 - 100 млрд. микробных тел на 1 мл среды, стабилизировать и обеспечить максимальное накопление биомассы до 10 - 12 млрд. микробных тел в 1 мл культуральной жидкости.

По данным Панина А. Н. (Автореф. дис. д.в.н., Стрептококкозы свиней, 1992, 27 с. ), для приготовления вакцинного препарата накопление биомассы стрептококков не должно быть менее 4 млрд./см 3 . Следовательно, данный вариант солевой синтетической питательной среды вполне пригоден для использования в биологической промышленности при производстве стрептококковых антигенов.

Среду готовят путем последовательного растворения или предварительно смешанных компонентов в дистиллированной воде с последующей нейтрализацией аммиаком до pH 7,0 - 7,1 перед автоклавированием.

Среда для выращивания стрептококков, содержащая лимонную кислоту, фосфорнокислый калий двузамещенный, хлористый натрий, сернокислый магний, сернокислое железо, аспарагин, гликокол и глицерин, отличающаяся тем, что среда содержит компоненты в следующем соотношении, г на 1 л дистиллированной воды: Лимонная кислота - 4,9 - 5,0 Фосфорнокислый калий двузамещенный - 4,9 - 5,0 Хлористый натрий - 1,9 - 2,0 Сернокислый магний - 4,9 - 5,0 Сернокислое железо - 0,04 - 0,05 Аспарагин - 0,9 - 1,0 Гликокол - 0,9 - 1,0 Глицерин - 30,0 - 31,0 мл

Для выделения культур стафилококков обычно используют 5%-ный кровяной агар (кровь овцы, кролика, крупного рогатого скота). При исследовании образцов, содержащих постороннюю микрофлору, целесообразно использовать селективные среды.

Таблица 9. Дифференциальные признаки стафилококков, имеющих основное медицинское значение

Признак	S. aureus	S. epidermidis	S. saprophyticus
Anaerobius	Aureus
Наличие каротиноидного сегмента	–	±	–	+
Способность к росту в анаэробных условиях (тиогликолевая среда)	+	+	+	±
Рост на средах с 10% NaCI	+	+	± (слабо)	+
Рост при:
15°С	?	+	– (слабо)	+
45°С	–	+	+	±
Образование кислоты при ферментации углеводов в аэробных условиях:
ксилоза	–	–	–	–
арабиноза	–	–	–	–
раффиноза	–	–	–	–
сахароза	+	+	+	+
маннит	–	+	–	±
манноза	–	+	±	–
трегалоза	–	+	–	+
лактоза	–	+	±	±
галактоза	–	+	±	–
фруктоза	+	+	+	+
ксилит	–	–	–	±
Восстановление нитратов	–	+	+ (слабо)	–
Щелочная фосфатаза	+	+	+	–
Гиалуронидаза	+	+	+	?
Уреаза	?	±	+	+
Коагулаза (на сыворотке кролика)	+	+	–	–
Фибринолизин	?	±	±	?
Гемолитическая активность	+	+	– (слабо)	–
ДНКаза	+	+	– (слабо)	–
Чувствительность к новобиоцину (МИК >1,6 мкг/мл)	+	+	+	–

С целью дифференциации патогенных стафилококков от сапрофитных, а также от микрококков, используют среды, позволяющие одновременно определить один из признаков, характеризующих патоген­ные стафилококки. Приводим рецепты некоторых питательных сред.

Молочно-солевой агар

В 100 мл МПБ растворяют 6,5 г хлорида натрия, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,4, стерилизуют при 121°С 20 минут. Перед использованием агар расплавляют, охлаждают до 45°С, добавляют 10% стерильного обезжиренного молока и разливают по чашкам Петри. На этой среде определяют пигментообразование и способность к росту при наличии 6,5% хлорида натрия.

Лактозо-солевой бульон с фенолротом

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара. Устанавливают рН 6,8, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121°С 15 минут. При росте коагулазоположигельных стафилококков среда желтеет (тест на коагулазу положительный).

Теллурит-полимиксин-желточный агар Крисли

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г маннита, 20 г хлорида натрия, 2 г хлористого лития, 18 г агара. Устанавливают рН 7,3, стерилизуют 15 минут при 121°С. Перед использова­нием в среду добавляют 100 мл 30%-ной желточной эмульсии (на фи­зиологическом растворе), 0,4 мл стерилизованного фильтрацией 1%-ного водного раствора полимиксина М, 10 мл стерилизованного автоклавированием (121°С 15 мин) 1%-ного водного раствора теллурита натрия.

Среда Джиолиотта и Кантони

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 5 г дрожжевого экст­ракта, 5 г хлористого лития, 20 г маннита, 5 г хлористого натрия, 1,2 г глицина, 3 г пирувата натрия. Устанавливают рН 6,9, стерилизуют при 115°С 20 мин. Перед употреблением к среде добавляют 0,1 мл 1%-ного водного раствора теллурита натрия, стерилизованного фильтра­цией, При росте коагулазоположительных стафилококков наблюдается почернение среды или черный осадок.

Среда Бэрда-Паркера

К 90 мл основной среды с температурой 45°С добавляют 6,3 мл глицинового раствора, 1 мл раствора теллурита натрия, 5 мл эмульсии желтка, перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда пригодна к использованию в течение 28 дней (хранение при 4°С). Перед посевом на поверхность среды наносят 0,5 мл 20%-ного водного раствора пирувата натрия, стерилизованного фильтра­цией; распределяют по поверхности, подсушивают. Колонии коагула­зоположительных стафилококков черные, блестящие, с узкой серо-белой полосой и окружены прозрачной зоной.

Желточная эмульсия. Свежее куриное яйцо выдерживают в 0,001%-ном растворе HgCl₂. Соблюдая требования асептики, отделяют желток и эмульгируют его в 200 мл физиологического раствора.

Глициновый раствор. Глицин — 20 г, дистиллированная вода — 100 мл. Стерилизуют при 120°С 15 минут.

Раствор теллурита натрия. Теллурит натрия — 1 г, дистиллированная вода — 100 мл. Стерилизуют фильтрацией.

Желточно-солевой агар Чистовича

В расплавленный МПА с 10% хлорида натрия (рН 7,2), охлажденный до температуры 60°С, добавляют желточную эмульсию. После тщательного перемешивания питательную среду разливают в чашки Петри.

Среда Чаплина-Бернса

К 100 мл МПА добавляют 3,3 мл 0,1%-ного водного раствора кристаллического фиолетового и 5 г лактозы. Устанавливают рН 6,8. Стерилизуют автоклавированием (110°С 30 минут). Колонии патогенных стафилококков растут быстрее, чем непатогенных, и приобретают фиолетовый или оранжевый цвет.

Среда Чемпена (для выделения патогенных стафилококков)

Вариант 1: пептон — 1%, D-маннит — 1%, натрия хлорид — 7,5%, дрожжевой экстракт — 0,25%, двузамещенный фосфорнокислый ка­лий — 0,5%, агар-агар — 1,5%. Среду стерилизуют 90 минут при 110°С, устанавливают рН 7,0 и добавляют 10% стерильного обезжиренного молока (молоко способствует лучшему образованию пигмента).

Вариант 2: пептон — 1%, дрожжевой экстракт — 0, 25%, желатин — 3%, лактоза — 0,2%, D-маннит — 1%, натрия хлорид — 7,5%, двузамещен­ный фосфорнокислый калий — 0,5%, агар-агар — 1,5%. Стерилизуют 90 минут при 110°С, устанавливают рН 7,0.