Методические рекомендации по лабораторной диагностике легионеллеза
1.1. Настоящие методические рекомендации предлагают методику проведения лабораторной диагностики легионеллеза на основе выявления антигена легионелл иммунохроматографическим методом.
1.2. Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации, в лабораториях других организаций, осуществляющих лабораторную диагностику заболеваний верхних и нижних дыхательных путей.
1.3. Предлагаемый метод выявления бактерий Legionella pneumophila серогруппы 1 в клиническом материале согласуется с международными стандартами ВОЗ и Европейской рабочей группы по легионеллезу.
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения.
ПЦР - полимеразная цепная реакция.
Нозокомиальный легионеллез - инфекционное заболевание легионеллезной этиологии, возникшее в период пребывания в лечебно-профилактической организации (ЛПО) или в течение 10-ти дней после выписки из него, а также связанное с процедурами, проводимыми в ЛПО любого типа.
Спорадический легионеллез - случаи легионеллеза, не связанные с пребыванием или получением процедур в лечебно-профилактической организации, а также с поездками и путешествиями.
По данным официальной статистики, среди населения Российской Федерации ежегодно регистрируется до 20 случаев легионеллезной инфекции. Однако современные исследования показывают, что удельный вес этой нозологической формы в общей структуре внебольничных пневмоний занимает порядка 6 - 14 %. Время диктует необходимость более подробного изучения эпидемического процесса заболевания, которое уже приобрело определенное социальное значение, поражая людей во время путешествий, общественных мероприятий, дома и на работе.
В клинической картине заболевания отсутствуют патогномоничные симптомы. Подозрение на легионеллезную этиологию инфекции возникает в случаях тяжелого течения внебольничной пневмонии при наличии следующих факторов риска: теплое время года, возраст старше 40 лет, мужской пол, путешествие (отдых с выездом, командировка) внутри страны или за рубеж, совпадающее со сроком инкубационного периода (от 2 до 10 дней до начала заболевания), работа в туристических или гостиничных комплексах, занятость на строительных или земляных работах, наличие вредных привычек (курение, алкоголь, наркомания), наличие сопутствующих заболеваний, в первую очередь: диабет, сердечно-сосудистые заболевания, заболевания, сопровождаемые курсом гормональной или (и) интенсивной иммуносупрессивной терапии.
Легионеллез является серьезной инфекцией, часто приводящей к инвалидизации. Летальность в случаях позднего и неадекватного лечения может достигать 20 %. Поэтому своевременная диагностика патологии приобретает особое значение, как для выбора соответствующей терапии и прогноза течения заболевания, так и для определения причинно-следственной связи формирования эпидемических очагов, организации адекватных санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий.
Метод выявления антигена легионелл в клиническом материале является иммунохроматографическим тестом для быстрого и достоверного подтверждения диагноза легионеллезной инфекции, вызванной Legionella pneumophila серогруппы 1. Растворимый антиген выявляется в моче больных начиная с третьего для болезни и может быть обнаружен в течение нескольких последующих месяцев (до 1 года).
Метод основан на взаимодействии кроличьих антител к Legionella pneumophila серогруппы 1, нанесенных на нитроцеллюлозную мембрану с растворимым антигеном возбудителя, выявляемым в достаточно высокой концентрации во время заболевания в моче больного. Кроличьи антитела связаны с красителем, обеспечивающим визуализацию реакции в течении 15 - 30 мин после нанесения образцов мочи на нитроцеллюлозную мембрану.
Метод входит в международный стандарт (стандарт ВОЗ) диагностики легионеллеза и является базовым. В настоящее время в более 90 % случаев окончательный диагноз внебольничной легионеллезной инфекции в мире устанавливается данным методом. Положительные результаты могут быть дополнены с помощью бактериологического или серологических методов.
Указанный тест используется только для исследования образцов мочи. Для других образцов (сыворотка крови, другие биологические жидкости), которые могут содержать антиген легионелл, метод не является достоверным. Метод в данной модификации также не может быть использован для исследования образцов окружающей среды.
Техническое оснащение для диагностики легионеллеза иммунохроматографическим методом включает:
1) набор реагентов (стандартные, зарегистрированные в установленном порядке в Российской Федерации):
- тест-кассеты, содержащие мембрану с нанесенными иммобилизованными в виде отдельных полосок кроличьими антителами к антигену Legionella pneumophila серогруппы 1 и козьими антителами против IgG кролика в комбинации с конъюгатом, содержащим кроличьи антитела к антигену Legionella pneumophila серогруппы 1, конъюгированные с окрашенными частицами;
- реагент А - на основе цитратно-фосфатного буфера с Твином-20 и азидом натрия;
- тампоны на палочке для отбора образца мочи пациента;
- положительный контрольный тампон, содержащий термоинактивированные L. pneumophila, высушенные на тампоне;
- отрицательный контрольный тампон, не содержащий L. pneumophila;
2) часы или таймер;
3) стандартный пластиковый контейнер для забора образцов мочи.
Образцы мочи для исследования помещают в стандартные пластиковые контейнеры и хранят при комнатной температуре (15 - 30 °С) не более 24 ч после забора перед постановкой реакции. В случае необходимости образцы могут храниться при температуре 2 - 8 °С до 14 дней или при -20 °С в течение длительного времени для первичного или повторного исследования. В качестве консерванта может быть использована борная кислота.
Образцы мочи можно пересылать в герметично упакованных контейнерах при температуре 2 - 8 °С или замороженными. Перед постановкой реакции с использованием быстрых тестов для выявления антигена легионелл в моче охлажденные или замороженные образцы мочи оставляют в лаборатории до достижения комнатной температуры.
Для проведения теста тампон на палочке погружают в образец исследуемой мочи, вынимают и помещают в тест-устройство. Затем добавляют реагент А из прилагающейся пластиковой капельницы. Устройство закрывают, с тем чтобы привести исследуемый образец в контакт с тест-полоской.
Результаты учитываются спустя 15 мин и интерпретируются по наличию или отсутствию визуально различимых окрашенных линий от розового до пурпурного цвета.
Положительный результат включает выявление двух окрашенных линий в зоне чтения как результата тестирования пациента, так и контрольной линии, в то время как отрицательный результат дает только одну окрашенную контрольную линию. Отсутствие окрашенной контрольной линии вне зависимости от наличия или отсутствия окрашенной линии в зоне чтения результата пациента свидетельствует о недействительности теста.
Контроль качества постановки реакции
Появление окрашенной линии от розового до пурпурного цвета в зоне контрольной линии может рассматриваться в качестве внутреннего контроля надлежащей постановки (проведения) теста. В случае наличия капиллярного потока эта линия всегда проявляется на полоске.
Исчезновение фоновой окраски конъюгата в зоне чтения результата анализа пациента предоставляет возможность осуществления отрицательного контроля процедуры постановки теста. Цвет фона в зоне чтения результата теста должен стать от слабо розового до белого в течение 15 мин после постановки и не должен мешать чтению результата теста.
Негативный (отрицательный) образец дает одну окрашенную линию от розового до пурпурного цвета. Эта контрольная окрашенная линия расположена в верхней половине окна чтения результатов, указывая Образец на предположительно отрицательный результат. Наличие этой контрольной линии свидетельствует о том, что процедура постановки теста прошла корректно (правильно), но антиген L. pneumophila серогруппы 1 не был обнаружен.
Положительный образец дает две окрашенные линии от розового до пурпурного цвета. Это значит, что антиген был выявлен. Исследуемые образцы с низкими уровнями антигена могут давать слабо окрашенную линию в области чтения результата образца. Любая видимая линия в этой зоне свидетельствует о положительном результате теста.
В случае отсутствия видимых линий или при наличии одной видимой линии в зоне чтения результата образца результат теста считается недействительным. Недействительный тест должен быть повторен.
Рекомендуемое заключение по результату.
Положительный результат на наличие антигена L. pneumophila серогруппы 1 в моче позволяет сделать вывод о наличии текущей или недавно перенесенной инфекции, вызванной данным возбудителем.
Отрицательный результат на наличие антигена L. pneumophila серогруппы 1 в моче позволяет сделать вывод об отсутствии недавней или текущей инфекции, вызванной L. pneumophila серогруппы 1.
Отрицательный результат теста не исключает возможность инфекции, вызванной другими серогруппами L. pneumophila или другими видами Legionella species. Хотя практически все крупные эпидемические вспышки внебольничных пневмоний легионеллезной этиологии и около 90 % спорадических случаев легионеллеза вызваны Legionella pneumophila серогруппы 1, при отрицательных результатах теста следует применить бактериологический метод или ПЦР для исследования отделяемого респираторного тракта, бронхоскопии или биопсии больных. При нозокомиальном (внутрибольничном) легионеллезе вероятность этиологической роли других серогрупп Legionella pneumophila и других видов Legionella species повышается.
2. Постановление Правительства Российской Федерации от 24 июня 2000 г. № 554 «Об утверждении положения о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации и Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормированию).
7. European Guidelines for Control and Prevention of Travel associated Legionnaires Disease, 2002.
8. Legionella and the prevention of Legionellosis. WHO guidelines. 2007.
1.1 . Настоящие методические указания устанавливают методику проведения лабораторных исследований объектов окружающей среды по выявлению в них бактерий Legionella pneumophila - возбудителя болезни легионеров.
Проведение мониторинга объектов окружающей среды на наличие Legionella pneumophila позволит определить степень их контаминации возбудителем и дать оценку эффективности принимаемых мер в целях профилактики болезни легионеров и обеспечения безопасности здоровья населения.
1.2 . Методические указания предназначены для применения в лабораториях учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации, осуществляющих контроль за объектами окружающей среды; в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право осуществления контроля безопасности объектов окружающей среды на наличие возбудителя болезни легионеров.
1.3 . Методические указания являются обязательными:
• в ходе проведения противоэпидемических мероприятий и при эпидемиологическом расследовании возможных эпидемических вспышек и спорадических случаев болезни легионеров.
2.10 . European Guidelines for Control and Prevention of Travel associated Legionnaires Disease, 2002.
2.11 . ISO 1998.ISO 11731:1998 Water Quality-detection and enumeration of Legionella.
2.12 . Legionella and the prevention of Legionellosis. - WHO guidelines. 2006.
L egionella pneumophila - грамотрицательная бактерия, возбудитель острых тяжелых пневмоний с высоким процентом летальных исходов (5 - 10 %) и респираторных заболеваний. В природных условиях легионеллы обитают повсеместно в пресноводных водоемах, преимущественно в некультивируемой форме, и паразитируют в амебах и других простейших, не представляя серьезной опасности для человека. Размножение легионелл активно идет в теплой воде в диапазоне температур 25 - 45 °С, хотя их выделяют и из холодной воды.
Высокие адаптивные способности легионелл позволяют им успешно колонизировать искусственные водные системы - системы охлаждения и кондиционирования, градирни, компрессорные устройства, джакузи, фонтаны, медицинское оборудование и др. Условия для размножения легионелл в искусственных водных системах более благоприятны, чем в естественных, что приводит к накоплению в них возбудителя в высокой концентрации. Легионеллы активно колонизируют синтетические и резиновые поверхности промышленного, водопроводного, медицинского оборудования с образованием биопленок, в которых легионеллы значительно более устойчивы к действию дезинфицирующих веществ. В состав естественных биопленок помимо легионелл входят бактерии рода Pseudomonas , Klebsiella , Acinetobacter и др. Важная роль в персистенции легионелл в биопленках принадлежит амебам в которых легионеллы активно размножаются перед образованием сложных биопленок в ассоциации с другими микроорганизмами.
Эпидемические вспышки и спорадические случаи болезни легионеров преимущественно выявляют в местах общественного назначения: у посетителей и персонала гостиниц; торговых, спортивных и выставочных комплексов; промышленных предприятий, больниц, учреждений; круизных судов и др. Фактором передачи служит водный мелкодисперсный аэрозоль, содержащий возбудителя и генерируемый системами водных коммуникаций.
Сочетание высокой концентрации легионелл в водной среде с источниками мелкодисперсного аэрозоля позволяет возбудителю инфекции вследствие ингаляции микробного аэрозоля попадать в нижнюю часть респираторного тракта и легкие человека, где происходит контакт с альвеолярными макрофагами, в которых вирулентные штаммы возбудителя активно размножаются.
При спорадическом легионеллезе и отдельных нозокомиальных вспышках заболевания возможна аспирация воды, контаминированной легионеллами без образования аэрозоля (бассейны, емкости для хранения и транспортирования воды и др.). Это обусловлено возрастанием восприимчивости к легионеллезу лиц со сниженной иммунологической реактивностью на фоне сопутствующих заболеваний, иммунодепрессивной терапии и др.
Эпидемические вспышки и спорадические случаи легионеллеза выявляют повсеместно. Особое значение в последние годы уделяется случаям болезни легионеров, возникающим во время поездок, путешествий и диагностируемым после возвращения из них. Инкубационный период составляет от 2 до 10 дней. Более 30 % случаев спорадического легионеллеза, многочисленные эпидемические вспышки в гостиницах, на круизных судах послужили причиной создания международной системы эпидемиологического надзора за случаями легионеллеза, связанного с поездками.
В настоящее время известно около 50 видов легионелл, преимущественно выделенных из окружающей среды, из которых собственно болезнь легионеров вызывает вид Legionella pneumophila , насчитывающий 16 серогрупп. Причем более 80 % случаев заболевания вызывают штаммы 1-й серогруппы. Среди других представителей рода Legionella в качестве микробов-оппортунистов, вызывающих заболевание при нарушении клеточного иммунитета и\или на коморбидном фоне, следует отметить L . micdadei, L . longbeachae , L . dumqffii и L . bozemanii. Остальные виды Legionella spp . не патогенны для человека.
рН метр - рН 410; диапазон рН от - 1 до 14, точность 0,01 рН, температура анализируемой среды от - 10 до 100 °С (Белоруссия)
Весы Adventurer ™ - прецизионные одночашечковые электронные цифровые с функцией обнуления тары и другими вспомогательными функциями, стандартного уровня, максимальная загрузка - 210 г, погрешность при измерении - 0,001 г ( OHAUS , США)
Весы ScoutPro - портативные одночашечковые электронные цифровые с функцией обнуления тары, максимальная нагрузка - 2000 г, погрешность при измерении - 0,1 г ( OHAUS , США)
Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П, поддерживающий температуру плюс (160 ± 5) °С (Россия)
Термостат суховоздушный ТС-1/80, объем 80 л с температурой до 60 °С (Россия)
СО2 инкубатор МСО 5АС, персональный, объем 49 л, тепловая рубашка, ТС-датчик СО2 (Sanyo) или анаэростат GasPak 100 (на 11 чашек), GasPak 150 (на 36 чашек)
Стерилизатор паровой ВК-30 с вертикальной камерой, объем 150 л
Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды
Облучатель бактерицидный настенный УФИК 1 ´ 30
Холодильник бытовой электрический с температурой в камере плюс 4 - 6 °С
Морозильная камера с температурой в камере до -20 °С
* Указанное оборудование и расходные материалы могут быть заменены на аналогичные по характеристикам производства других фирм.
Водяная баня TW 2.03, автоматическое регулирование температуры до 85/90 °С, объем 8,5 л, внутренняя и внешняя циркуляция ( Elmi , Латвия)
Батометр Молчанова ГР-18, предназначенный для взятия проб воды с различной глубины водоемов, с одновременным измерением температуры воды исследуемого слоя, при температуре окружающей среды от 1 до 40 °С (Россия)
Прибор для мембранной фильтрации под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм и устройство для создания разрежения 0,5 - 1,0 атм. (САРТОГОСМ, Россия)
Прибор для подсчета колоний бактерий ( Schuett )
Мешалка магнитная BioMMS -3000, без подогрева, максимальный объем 2 л, скорость вращения 0 - 3000 об./мин, размер платформы 150 ´ 150 мм
Микроцентрифуга/встряхиватель ТЭТА 2 (Биоком, Россия)
Твердотельный термостат Термо 24-15 с диапазоном рабочих температур от 0 до 120 °С (Биоком, Россия)
Охладитель проб ОП-1 с диапазоном температур от -4 до 30 °С (Биоком, Россия)
Амплификатор Терцик МС-2 (ДНК-Технология, Россия)
Амплификатор iCycler для проведения ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, оптический и реакционный модули, комплект фильтров iQ 5 Optical System ( BIORAD , США)
Источник тока Эльф-4 (ДНК-технология, Россия)
Камера для горизонтального электрофореза SE -2 (Хеликон, Россия)
Фотодокументирующая система GelDoc 2000 ( BIORAD , США)
4.3. Вспомогательные изделия и расходные материалы
Пинцет для работы с мембранными фильтрами
Скальпель хирургический, 15 см
Термометр ртутный с диапазоном измерений от 0 до 100 °С
Часы механические сигнальные
Пробки различных размеров: силиконовые, резиновые и другие, выдерживающие стерилизацию сухим жаром или автоклавированием
Тампоны (свабы) в полипропиленовой пробирке в упаковке с аппликатором-палочкой
Вата хлопковая медицинская гигроскопическая
Бумага плотная для упаковки посуды
Пленка Parafilm A
Газогенераторные пакеты CampyPak для факультативных анаэробов, 10 шт./уп.
Индикаторные полоски СО2, 50 шт./уп.
Мембранные фильтры поликарбонатные с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм
Чашки Петри пластиковые микробиологические, стерильные (Россия)
Стекла предметные для микропрепаратов
Пробирки типов П1, П2
Бутыли стеклянные градуированные с крышкой автоклавируемые или пластиковые флаконы (одноразовые), емкостью 500 и 1000 мл ( Wheaton , США)
Центрифужные пробирки, объемом 50 и 15 мл
Микроцетрифужные пробирки, объемом 0,2, 0,6 и 1,5 мл ( QSP, США)
Автоматические пипетки переменного объема Eppendorf 500 - 5000, 1000 - 10000 мкл
Наконечники до 10 мкл (QSP, США)
Наконечники до 200 мкл с фаской ( QSP , США)
Наконечники до 1000 мкл ( QSP , США)
Наконечники до 5000 мкл ( Eppendorf , Германия)
Наконечники до 10000 мкл ( Eppendorf , Германия)
Наконечники с фильтром до: 10, 100, 200, 1000 мкл ( QSP, США)
Штативы для центрифужных пробирок, объемом 50 и 15 мл (Германия)
Штатив для пипеток переменного объема (Ленпипет, Россия)
Штатив для хранения микропробирок, объемом1,5 мл (Хеликон, Россия)
Штативы для наконечников до: 10, 200, 1000 мкл (Россия)
4.4. Реагенты, реактивы и питательные среды
 | Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 |
Об утверждении Инструкции по
эпидемиологии, клинике, лечению,
1. Утвердить прилагаемую инструкцию по эпидемиологии, клинике, лечению, лабораторной диагностике и профилактике легионеллеза и ввести ее в действие на территории Республики Беларусь с 01 февраля 2007 г.
2. С момента введения в действие Инструкции по эпидемиологии, клинике, лечению, лабораторной диагностике и профилактике легионеллеза не применять на территории Республики Беларусь Методические рекомендации по эпидемиологии, клинике, лечению и профилактике легионеллеза, утвержденные заместителем министра здравоохранения СССР 08.02.1988г.
3. Главным государственным санитарным врачам данное постановление довести до сведения всех заинтересованных.
по эпидемиологии, клинике, лечению, лабораторной диагностике и профилактике легионеллеза.
ГЛАВА I
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1. Инструкция предназначена для специалистов органов и учреждений государственного санитарного надзора, организаций здравоохранения, осуществляющих диагностические, противоэпидемические и профилактические мероприятия в отношении легионеллезной инфекции.
ГЛАВА II
ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
2. Эпидемиологический надзор за легионеллезной инфекцией направлен на:
обеспечение своевременной диагностики и выявление вспышечных и спорадических случаев заболевания;
своевременное проведение противоэпидемических мероприятий;
разработку и внедрение эффективных методов профилактики легионеллезной инфекции.
ГЛАВА III
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛЕГИОННЕЛЕЗА
4. Легионеллез - острая инфекционная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, выраженной общей интоксикацией, тяжелым течением, поражением легких, ЦНС, органов пищеварения.
Вспышки и спорадические случаи легионеллезной инфекции зарегистрированы в большинстве стран Европы, Южной и Северной Америки, в Африке, Азии, Австралии, что свидетельствует о достаточно широком и практически повсеместном ее распространении.
Известны 3 основные клинические формы легионеллеза:
Болезнь легионеров - тяжелая, острая пневмония; описаны спорадические случаи и вспышки заболевания, в том числе внутрибольничные. При этиотропном лечении летальность достигает 10-12%, при внутрибольничных вспышках - до 30-40%.
Респираторная лихорадка (лихорадка Понтиак) - более редкая форма с различной тяжестью проявления, без летальных исходов, наносит значительный социально-экономический ущерб, так как все известные вспышки имели место на промышленных предприятиях или в учреждениях.
Лихорадка Форт-Брагг - характеризуется лихорадкой, кожным зудом, сменяющимся полиморфной сыпью (на животе, бедрах, предплечьях). Заболевание обычно через 3-7 дней завершается выздоровлением.
5. Возбудитель легионеллеза относят к роду Legionella, семейству Legionellaceae.
Известны более 40 видов легионелл (приложение 1), для 22 из которых доказана их роль в инфекционной патологии человека. Более 90% случаев болезни ассоциированы с видом L. pneumophila. Среди других видов легионелл чаще всего заболевание вызывают, как правило, при нарушениях клеточного иммунитета и/или на коморбидном фоне виды L. micdadei, L. longbeuchae, L. dumoffii и L. bozemanii.
Легионеллы представляют собой грамотрицательную палочку диаметром 0,5–0,7 мкм и длиной 2–5 мкм. В ряде случаев встречаются нитевидные формы длиной до 20–25 мкм. Они не образуют эндоспор, микроцист и капсул, растут в аэробных условиях.
Микроорганизм подвижен за счет одного, двух или большего числа жгутиков. Легионеллы не ферментируют углеводы, разжижают желатин, не образуют уреазу, не восстанавливают нитраты. Результаты теста на каталазу положительны, на оксидазу – вариабельны.
Легионеллы не растут на обычных питательных средах (кровяном агаре, агаре MacConkey и др.), что связано с потребностью возбудителя в L-цистеине и в растворимом пирофосфате железа (Fe++). Для выделения используют модификации буферного угольно-дрожжевого агара, содержащего L-цистеин, растворимый пирофосфат железа и кетоглутаровую кислоту (среда ВСYЕ). Все виды легионелл растут во влажной атмосфере при температуре 35oС. Рост некоторых видов стимулирует присутствие 2,5–3% СО2. Колонии легионелл вырастают при первичном выделении в течение 3–5 сут. Молодые колонии обычно имеют вросший центр, гранулярную или блестящую поверхность
Легионеллы – факультативные внутриклеточные паразиты. В организме человека они размножаются преимущественно в альвеолярных макрофагах, полиморфно-ядерных нейтрофилах и моноцитах крови. Вследствие ингаляции микробного аэрозоля или аспирации легионеллы попадают в легкие, где и происходит их контакт с альвеолярными макрофагами, что приводит к разрушению последних и выходу большого количества бактерий в легочную ткань. Многократно повторяемый цикл взаимодействия легионелл с макрофагами легких обусловливает накопление возбудителя в высокой концентрации и развитие острого воспалительного процесса, характерного для классической болезни легионеров.
6. В качестве факторов патогенности легионелл, играющих роль на различных этапах взаимодействия с эукариотической клеткой, описан широкий спектр ферментов, цитотоксинов, поверхностных белков: mip белок, главный белок внешней мембраны, цитолизин (главный секреторный белок), липиполисахарид, низкомолекулярные токсины, фосфолипаза С, протеинкиназа и кислая фосфатаза.
7. В природных условиях легионеллы обитают в пресноводных водоемах, где они являются симбионтами сине-зеленых водорослей, паразитируют в водных и почвенных амебах, инфузориях и других простейших. Размножение легионелл активно идет в теплой воде, хотя их выделяют и из холодной воды. Высокие адаптивные способности легионелл позволяют им успешно колонизировать искусственные водоемы – системы охлаждения, градирни, компрессорные устройства, душевые установки, оборудование для респираторной терапии и другие. Условия для выживания легионелл в искусственных сооружениях более благоприятны, чем в естественных, что приводит к накоплению в них возбудителя в высокой концентрации. Легионеллы активно колонизируют синтетические и резиновые поверхности водопроводного, промышленного, медицинского оборудования, с образованием так называемых "биопленок", в которых легионеллы значительно более устойчивы к действию дезинфицирующих веществ.
Легионеллы устойчивы в окружающей среде: в жидкой среде при температуре 25º С может сохраняться 112 дней, при 4º С - 150 дней. Под воздействием 1 % раствора формалина, 70 % этилового спирта, 0,2 % раствора фенола возбудитель гибнет в течение 1 мин, а в 3 % растворе хлорамина - за 10 мин. Для дезинфекции воды используют гипохлорит кальция в концентрации 3,3 мг свободного хлора на 1 л.
8. Легионеллез является типичным примером техногенных инфекций, обусловленных активным использованием в промышленности циркулирующих замкнутых водных систем, источников бактериального аэрозоля. Эпидемиологический анализ вспышек легионеллеза свидетельствует, что к резервуарам инфекции могут быть отнесены воды замкнутых систем охлаждения, термальных водоемов, промышленных и энергетических объектов. Легионеллы выделяют из объектов с широким диапазоном температуры - от 4°С до 63°С, однако, наиболее высокая концентрация легионелл и частота выделения возбудителя характерна для вод с температурой от 30°С до 50°С. Сочетание высокой концентрации легионелл в водной среде с источником мелкодисперсного аэрозоля позволяет возбудителю попасть в респираторные отделы легких, где происходит контакт с альвеолярными макрофагами, в которых вирулентные штаммы активно размножаются. Отсутствие рецепторов, позволяющих легионеллам "закрепиться" в клетках мерцательного эпителия слизистой оболочки дыхательных путей, объясняет отсутствие контагиозности при легионеллезе.
9. Путь передачи легионеллезной инфекции – воздушно-капельный, а основной фактор передачи – мелкодисперсный аэрозоль. Практически все крупные эпидемические вспышки и многие спорадические случаи легионеллеза связаны с распространением мелкодисперсного аэрозоля, содержащего легионеллы и генерируемого бытовыми, медицинскими или промышленными водными системами. Зону распространения аэрозоля, содержащего легионеллы, можно считать очагом инфекции. Среди лиц со сниженной иммунологической реактивностью на фоне сопутствующих заболеваний, иммуносупрессивной терапии, возможны случаи спорадических заболеваний или отдельные нозокомиальные вспышки не только от водных аэрозолей, но и при заглатывании воды, контаминированной легионеллами.
Имеются косвенные подтверждения, что пыль, образующаяся при проведении строительных и земляных работ и содержащая легионеллы, может переноситься на значительные расстояния и являться факторами передачи инфекции.
При анализе эпидемической заболеваемости показано, что болезнь легионеров (легионеллезная пневмония) развивается у 5–10% лиц, находившихся в зоне действия контаминированного легионеллами аэрозоля. Лихорадка Понтиак (острое респираторное заболевание легионеллезной природы) поражает 80–100% таких лиц, а 0,5–4% всех случаев пневмонии, требующей госпитализации, представлены болезнью легионеров.
Учебник предназначен для студентов, аспирантов и преподавателей высших медицинских учебных заведений, университетов, микробиологов всех специальностей и практических врачей.
5-е издание, исправленное и дополненное
Книга: Медицинская микробиология, иммунология и вирусология
Легионеллы
Заслуга выделения возбудителя болезни легионеров (легионеллеза) и доказательства его этиологической роли принадлежит сотрудникам Центра по контролю заболеваемости в г. Атланта (США) Дж. Мак-Дейду и С. Шепарду, которым в 1977 г. удалось из легочной ткани умерших от специфической пневмонии людей выделить неизвестный ранее микроб. Открытие нового широко распространенного инфекционного заболевания и еще не известного науке возбудителя само по себе является фактом в достаточной мере сенсационным. Легионеллы отнесены к классу Gammaproteobacteria, выделены в семейство Legionellaceae с двумя родами – Legionella и Tatlockia. В роде Legionella известно около 40 видов, разделенных более чем на 60 серологических групп. Они различаются по пигментообразованию, способности размножаться в определенных питательных средах, продуцировать ?-лактамазу, вызывать аутофлуоресценцию, по наличию оксидазы.
Легионеллез – острое инфекционное заболевание, проявляющееся интоксикацией, лихорадкой, пневмонией, а также поражением дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, почек и центральной нервной системы.
Возбудитель легионеллеза – Legionella pneumophilia – грамотрицательная палочка размерами 0,3 – 0,4 ? 2 – 3 мкм, иногда до 8 – 20 и даже до 50 мкм. Имеются липидные включения. Характерной особенностью легионелл является резко выраженная в ряде случаев заостренность концов их клеток. Они подвижны, несколько жгутиков располагаются полярно, биполярно или перитрихиально; спор и капсул не образуют, склонны к полиморфизму, иногда красятся грамположительно. Размер геномной ДНК легионелл составляет 2,5 · 10 3 МД, содержание Г + Ц составляет 39 мол %. Легионеллы – факультативные внутриклеточные паразиты.
Условия культивирования легионелл имеют ряд особенностей. На простых средах они не растут, требуют создания специальных условий. Их можно культивировать на средах с добавлением биологических жидкостей, гемоглобина, пирофосфата железа, изовиталекса; лучше растут в присутствии 5 % СО2; температурные границы роста 25 – 42 °C, оптимальная температура 35 – 37 °C. Видимые колонии на плотной питательной среде вырастают на 3-и сут., достигают диаметра 3 – 4 мм на 5 – 7-е сут. инкубации при 35 °C. Колонии округлые, выпуклые, сероватого оттенка, блестящие, имеют ровные края. На 4-е сут. колонии легионелл могут иметь пигмент коричневого цвета. Для культивирования легионелл может быть использовано заражение куриных эмбрионов, морских свинок и культур клеток.
Из биохимических свойств легионелл следует отметить способность продуцировать оксидазу, каталазу, ферментировать крахмал, а также гидролизовать желатин и гиппурат натрия. В то же время легионеллы не способны продуцировать уреазу, восстанавливать нитраты в нитриты, ферментировать другие углеводы.
Исследования химического состава легионелл показали ряд особенностей: в клеточной стенке разных штаммов преобладают жирные кислоты с разветвленными цепями, что характерно больше для грамположительных бактерий; и в большом количестве содержится диаминопимелиновая кислота.
Антигенная структура. У легионелл установлено наличие типо– и группоспецифических антигенов. Серогруппы определяют с помощью реакции прямой иммунофлуоресценции.
Факторы патогенности легионелл изучены сравнительно мало. Важнейшими из них являются липополисахаридный эндотоксин, несколько экзоферментов (протеазы), гемолизины, а также токсины. Один из них нарушает окислительные процессы, протекающие в полиморфно-ядерных лейкоцитах при фагоцитозе, летален для куриных эмбрионов, проявляет цитотоксическое действие в разных культурах клеток. Этот токсин представляет собой термостабильный пептид (ТС-токсин) с молекулярной массой 1,3 кД, состоящий из 6 аминокислотных остатков. Обнаружен также термолабильный цитотоксин (ТЛ-токсин), являющийся высокомолекулярным белком, теряющим свои токсические свойства при нагревании до 60 °C. Продукция этого токсина зависит от фазы роста бактериальной популяции, рН среды, температуры и ряда других условий.
Возбудитель вызывает быструю гибель макрофагов, давая основание полагать, что причина ее – не размножение возбудителя в макрофагах, а выход внутриклеточного токсина при разрушении бактериальных клеток. Наличие у легионелл внутриклеточной токсической активности подтверждается результатами, полученными при действии фильтрата разрушенных клеток вирулентной культуры на монослой макрофагов и при заражении им белых мышей.
Длительное инкубирование легионелл на искусственных питательных средах приводит к резкому снижению вирулентности культуры. Штамм, утративший свою вирулентность, может восстановить ее при переменном пассировании через куриные эмбрионы и организм морской свинки. Умеренная вирулентность сохраняется при постоянном пассировании легионелл на куриных эмбрионах.
Эпидемиология. Места естественного обитания легионелл – открытые водоемы. Источник инфекции – вода систем кондиционирования воздуха рециркуляторного типа, душевые установки, ванны для бальнеопроцедур и т. п. Механизм передачи – аспираторный. Большинство вспышек связано с замкнутыми системами охлаждения воды и технологическими циклами, при функционировании которых образуется высокодисперсный аэрозоль, содержащий легионеллы. Заражение возможно при участии в земляных работах. При групповых и спорадических случаях заболевания источником распространения возбудителя могут быть душевые установки, бытовые увлажнители воздуха, медицинское и лабораторное оборудование. Установлен факт внутриклеточного развития легионелл в амебах, обитающих в открытых водоемах и почве, в одной амебе может находиться более 1000 микробных клеток. Благоприятные условия для жизни и размножения легионелл обнаружены в открытых теплых водоемах с сине-зелеными водорослями, показана зависимость их роста от фотосинтетической активности водорослей. К инфекции восприимчивы все возрастные группы населения. Заболевают чаще люди, занятые земляными работами, а также лица, находившиеся в помещениях, где действуют системы кондиционирования воздуха или имеются устройства с указанными выше источниками инфекции. Для эпидемических вспышек характерна сезонность (июль, август, сентябрь), спорадические случаи регистрируются в течение всего года, но чаще летом. Из животных к возбудителю чувствительны крысы, сирийские хомячки, кролики, морские свинки. Наличие антител в сыворотках крови домашних животных и обезьян говорит также о возможном заражении их в естественных условиях.
Легионеллез зарегистрирован практически на всех континентах; первый случай в России описан в 1980 г. С. В. Прозоровским.
Легионеллы длительно сохраняются и размножаются в водной среде, во влажной почве, образуют пленки и осадок на различных поверхностях, паразитируют не только в амебах, но и в других простейших. Они выдерживают температуру до 70 °C, высокие концентрации хлора; чувствительность к другим дезинфицирующим веществам такая же, как и у большинства бактерий, не образующих спор.
Патогенез и клиника. По-видимому, все виды легионелл патогенны для человека, хотя клинические проявления могут быть различными. Ведущим моментом в патогенезе заболевания является токсическое действие возбудителя на организм. В пользу этого свидетельствует синдром общей интоксикации в начале заболевания, а в дальнейшем и характер патологических изменений в легких. Существенную роль в патогенезе играет бактериемия, которая приводит к развитию сосудистых нарушений, образованию участков некроза в печени и лимфатических узлах. Описаны несколько клинических форм заболевания: собственно болезнь легионеров с преобладанием синдрома пневмонии; респираторное заболевание без пневмонии (лихорадка Понтиак); лихорадка Форт-Брагг, сопровождающаяся кожными высыпаниями. При пневмонической форме инкубационный период от 2 до 11 дней, при лихорадке Понтиак – 6 – 24 ч, иногда 11 – 28 дней. Течение может быть субклиническим, легким, средним, тяжелым и крайне тяжелым (молниеносным). Пневмоническая форма обычно протекает тяжело, нарастает дыхательная и сердечно-сосудистая недостаточность, нарушается микроциркуляция, определяется диссеминированный внутрисосудистый синдром с развитием инфаркта или отека легких, инфарктов во внутренних органах, появляются кровотечения, может наступать почечная недостаточность, развивается шок. Летальность при этой форме во время вспышек, по данным различных авторов, варьирует от 8 до 38 %.
По данным американских исследователей, частота случаев легионеллеза в структуре острых пневмоний составляет от 2 до 5 %, а среди атипичных пневмоний неясной этиологии – от 15 до 20 %. Клиническое течение лихорадки Понтиак соответствует типу острой респираторной вирусной инфекции, начало острое, специфическая симптоматика отсутствует. Возможны рецидивы. Летальные исходы не зарегистрированы.
Иммунитет. Сведения об иммунитете при легионеллезе скудны и порою противоречивы. Установлено, что антитела в сыворотке крови появляются к концу 1-й недели заболевания, титр их существенно повышается на 2 – 3-й нед. и достигает максимума спустя 4 – 5 нед. с последующим снижением. Повторные заболевания не известны.
Лабораторная диагностика. Для диагностики легионеллеза используются бактериологический и серологический методы. Серологический метод используется чаще, так как дает более стабильные результаты. Для определения уровня антител в сыворотке крови применяется в основном реакция непрямой иммунофлуоресценции. Диагностически значимым считается титр 1: 128 и выше в одиночной сыворотке (при соответствующей клинической картине) или нарастание титра антител в динамике не менее чем в 4 раза. Используют также РПГА, ИФМ, РСК. Чистая культура из материала от больного (кровь) выделяется с трудом, лучше из трупного материала (легочная ткань, печень, селезенка). Для выделения чистой культуры из сильно загрязненного материала пользуются угольно-дрожжевым агаром с добавлением L-цистеина, пирофосфата железа, полимиксина В и ванкомицина. К ванкомицину легионеллы проявляют полную резистентность, что, по-видимому, является их видовым, а может даже и родовым признаком. Выделение возбудителя от больных возможно также при заражении морских свинок с последующим заражением куриных эмбрионов. В препаратах-мазках легионеллы обнаруживаются при использовании окраски по Гименсу и импрегнацией серебром. Возбудителя можно обнаружить с помощью реакции прямой иммунофлуоресценции в мазках мокроты из зева, в препаратах из экссудатов, из органов и в образцах внешней среды.
Профилактика и лечение. Специфическая профилактика легионеллеза не разработана. Отсутствие данных о контагиозности больных делает нецелесообразной изоляцию лиц, общавшихся с больным, и медицинского персонала. Основные профилактические и противоэпидемические мероприятия носят неспецифический характер и связаны с химической и термической дезинфекцией водных резервуаров, мест возможного обитания легионелл. На промышленных предприятиях, в учреждениях, больницах при наличии замкнутых систем водоснабжения, используемых для кондиционирования воздуха или охлаждения, при обнаружении в них легионелл необходимо ежеквартально проводить дезинфекционные мероприятия с обязательным бактериологическим контролем воды. Основным препаратом для лечения легионеллеза является эритромицин, при тяжелом течении заболевания его сочетают с рифампицином.
Читайте также: