Среда для идентификации коринебактерий дифтерии
Для первичного посева материала с целью выделения дифтерийных бактерий используют агаровые среды, содержащие гемолизированную кровь (барана, лошади, кролика, морской свинки, донора) и 0,03-0,04% теллурита калия, подавляющего рост сопутствующей флоры.
Коринебактерии дифтерии восстанавливают металлический теллур из его солей, что способствует окрашиванию их колоний в черный цвет. Наиболее распространенные среды: кровяной теллуритовый агар и один из его вариантов — среда Клауберга-2.
а) Теллуритовая среда для транспортировки и обогащения проб на С. diphtheriae. Среда, применяемая при невозможности доставки материала в течение 3 ч.
Состав:
Полужидкий (0,1%) агар на питательном бульоне, соответствующем требованиям С. diphtheriae
Нормальная сыворотка лошади или крупного рогатого скота — 10%
Теллурит калия K2TeO3 — 0,02%
Полужидкий агар разливают в пробирки по 4,5 мл, стерилизуют при 112°С 15 мин и хранят в холодильнике (не более 2 нед.).
Цвет готовой среды бледно-желтый, среда опалесцирует.
Тампоны с материалом из зева и носа сразу после взятия погружают в транспортную среду; по доставке в лабораторию пробирки помещают в термостат для обогащения (подращивания). На другой день тампоном, слегка отжатым о стенки пробирки, делают посевы на один из вариантов кровяного теллуритового агара.
б) Кровяной геллуритовый агар.
Состав:
Агар питательный — 100,0 мл
Кровь дефибринированная гемолизированная — 10,0 мл
Теллурит калия K2TeO3 — 0,03-0,04 г
К расплавленному и охлажденному до 45°С питательному агару добавляют 10% дефибринированной гемолизированной крови. Гемолиз достигается путем дву- или трехкратного попеременного замораживания и оттаивания. Можно достичь гемолиза эритроцитов при помощи дистиллированной воды. Для этого дефибринированную кровь отстаивают, удаляют надосадочную жидкость (плазму); к эритроцитарной массе добавляют дистиллированную воду в объеме, равном объему осадка.
Донорская кровь непосредственно из ампулы непригодна, так как содержит различные консервирующие добавки. При необходимости могут быть использованы эритроциты из ампулы для переливания крови после трехкратного отмывания изотоническим (0,85%) раствором натрия хлорида и подвергнутые гемолизу при помощи дистиллированной воды или замораживания/оттаивания.
К смеси агара и крови добавляют теллурит калия в конечной концентрации 0,03-0,04%, используя заранее заготовленный рабочий раствор (2%) теллурита калия. Его готовят путем растворения навески в дистиллированной воде на кипящей водяной бане 30 мин. 2%-ный раствор сохраняют в холодильнике не более 1 мес. Перед употреблением в случае образования в растворе осадка его снова прогревают на водяной бане до исчезновения хлопьев. К кровяному агару добавляют 1,5-2% (по объему) 2%-ного рабочего раствора теллурита.
После тщательного перемешивания среду разливают в чашки Петри и используют для первичного посева материала из зева и носа, а также для высева из транспортной среды. Цвет готовой среды вишнево-красный. Чашки с готовым кровяным теллуритовым агаром можно хранить в холодильнике не более 7 сут.
Основные ингредиенты среды Клауберга-2 (из расчета на 100,0 мл питательной агаровой основы):
Глицериновая смесь. К 40,0 мл дефибринированной крови добавляют 20,0 мл химически чистого глицерина, стерилизованного при 110°С 30 мин
Лаковая кровь. К 34,0 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 16,0 мл дефибринированной крови
К 100,0 мл питательной агаровой основы, расплавленной и остуженной до 45°С, добавляют 2,0 мл прокипяченного 2%-ного раствора теллурита калия, 10,0 мл глицериновой смеси и 50,0 мл лаковой крови, тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.
г) Цистин-теллурит-сывороточный агар (среда Тинсдейла, модифицированная).
Состав:
1-%-ный раствор цистина на 0,1N растворе серной кислоты H2SO4 — 12,0 мл
0,1 N раствор натрия гидроксида NaOH — 12,0 мл
2%-ный раствор теллурита калия K2TeO3 — 1,8 мл
2,5%-ный раствор натрия тиосульфата Na2S2O3 • 5Н2О — 1,8 мл
Питательный агар для дифтерийных бактерий, pH -7,6 — 100,0 мл
Нормальная лошадиная сыворотка — 20,0 мл
К расплавленному и остуженному до 45°С питательному агару, pH-7,6-7,8, асепетически добавляют ингредиенты в следующей последовательности: раствор цистина, щелочь, раствор теллурита, раствор тиосульфата, нормальная сыворотка. После внесения каждого ингредиента среду тщательно перемешивают. Незастывшую среду разливают в чашки Петри. Среда должна быть полупрозрачна, кремовожелтого цвета.
С. diphtheriae через 24-48 часов инкубации вырастает в виде мелких (1 мм) черных блестящих колоний, окруженных черно-коричневым ореолом (за счет образования сероводорода). Среда применяется для посева материала только от лиц с подозрением на заболевание дифтерией. Для выявления бактерионосителей среда непригодна по причине ее низких ростовых качеств.
Среду используют для посева материала от больного с подозрением на заболевание дифтерией. Для этого ватный тампон, содержащий исследуемый материал (пленки, слизь из зева, носа, с поверхгости некротических участков и т.д.) вначале окунают концом в конденсационную воду, затем втирают в поверхность свернутой сыворотки. Через 6 часов инкубации дифтерийные бактерии вырастают в виде мелких точечных выпуклых колоний практически в чистой культуре, а сопутствующая флора еще не заметна. Из колоний готовят препараты-мазки, окрашенные синью Лёффлера. Среда может использоваться и для выращивания чистых культур С. diphtheriae.
е) Сывороточный агар (среда для культивирования чистых культур С. diphtheriae). К расплавленному и охлажденному до 45°С питательному агару добавляют 10% нормальной сыворотки лошади или крупного рогатого скота (стерильной или с консервантом — хлороформом). Среду разливают в пробирки по 2,5-3,0 мл и дают застыть в скошенном состоянии. Цвет готовой среды бледно-желтый (сходен с цветом исходной агаровой основы). Пробирки со скошенным сывороточным агаром могут храниться в холодильнике не более 6 дней.
ж) Реактивы и постановка теста на уреазу но методу Заксе. Готовят два раствора: раствор мочевины в спирте (реактив А) и водный забуференный раствор индикатора фенолового красного (реактив И).
Реактив А. Мочевина — 2,0 г
Этиловый спирт 96° — 2,0 мл
Вода дистиллированная — 4,0 мл
Реактив не стерилизуют, хранят в холодильнике.
Реактив В. 0,2%-ный раствор фенолового красного — 1,0 мл
Калия фосфат однозамещенный (KH2PO4) — 0,1 г
Калия фосфат двузамещенный (K2HPO4 • H2O) — 0,1 г
Натрия хлорид — 0,5 г
Вода дистиллированная — 99,0 мл
Реактив стерилизуют однократно текучим паром 15 мин, хранят в холодильнике.
В стерильную пробирку вносят ex tempore 19 частей раствора В и 1 часть раствора А, смесь разливают в узкие пробирки по 0,1 мл, по числу испытуемых культур. В каждую пробирку вносят по нескольку петель испытуемой культуры (до помутнения жидкости). Пробирки помещают в термостат на 30 мин. При положительной реакции (наличии уреазы) смесь в пробирке приобретает красный цвет.
з) Среда Пизу (для определения цистиназы у коринебактерий). При невозможности использовать сухую коммерческую среду Пизу ее можно приготовить в лаборатории самостоятельно. В качестве основы берут 1,5%-ный питательный агар, приготовленный для С. diphtheriae на бульоне Мартена, среде ЛГВ, гидролизате казеина, рыбной муке или сухой агар для определения токсигенности. Реакция агаровой основы pH 7,6.
Состав:
1,5%-ный агар на бульоне Мартена или другой питательной основе, пригодной для дифтерийных бактерий, pH 7,6;
1%-ный раствор L-цистина в 0,1 N растворе H2SO4 или НС1;
0,1 N раствор NaOH;
10%-ный раствор ацетата свинца, свежеприготовленный и стерилизованный дважды текучим паром;
нормальная лошадиная или бычья сыворотка.
К 90,0 мл расплавленной (при 90°С) или свежесваренной питательной агаровой основы добавляют 2,0 мл 1%-ного раствора L-цистина в кислоте. Смесь перемешивают и добавляют к ней 2,0 мл 0,1 N раствора NaOH. После определения и подправления pH до 7,6 среду стерилизуют при 112°С в течение 30 мин и хранят в холодильнике. При необходимости агаровую среду расплавляют, охлаждают до 45-50°С и стерильно добавляют к ней 1,0 мл 10%-ного раствора ацетата свинца; смесь тщательно перемешивают, добавляют к ней 9,0 мл нормальной сыворотки и разливают в стерильные агглютинационные пробирки по 2,0-3,0 мл. Хранят в холодильнике.
В качестве 0,1 N растворов кислоты и щелочи можно использовать соответствующие фиксаналы.
Среда непрозрачна, имеет желтоватый цвет (цвет питательного агара).
Посев испытуемой культуры производят уколом. Через 20-22 ч по уколу и вокруг него на расстоянии 1,0 см от поверхности образуется темно-коричневое облачко ацетата свинца, окутывающее зону роста и свидетельствующее о расщеплении цистина. При отсутствии цистиназы потемнения среды не наблюдается.
и) Среда для определения токсигенности С. diphtheriae. В качестве основы используют пептон Мартена — продукт самопереваривания свиных желудков, смешанный с равным объемом мясной воды двойной концентрации (1 кг мясного фарша и 1000,0 мл воды), уплотненный агаром 1,5%. Для приготовления этой среды используют агары светлых сортов, обеспечивающих прозрачность. Среду категорически запрещается готовить в железной посуде (или в эмалированной посуде с выщербленной эмалью).
Состав:
Пептон Мартена — 500,0 мл
Мясная вода двойной концентрации — 500,0 мл
Агар — 15,0 г
Натрий уксуснокислый — 5,0 г
Мальтоза — 3,0 г
Нормальная сыворотка лошади — 20,0%
или крупного рогатого скота — 30,0%
pH 7,8-8,0
Навеску агара промывают в проточной воде в течение рабочего дня.
Смешивают пептон и мясную воду, в полученную смесь вносят отмытый и отжатый агар. Устанавливают pH 7,8-8,0 путем подщелачивания 20%-ным раствором натрия гидроксида (NaOH) по индикаторной бумажке с крезоловым красным (см. ниже), которая при такой реакции среды изменяет желтый цвет на малиново-розовый. Бульон кипятят в течение 10 мин, считая с момента закипания, после чего добавляют уксуснокислый натрий и мальтозу, проверяют и подправляют pH, кипятят 15 мин, дают отстояться в теплом помещении 2-3 ч и фильтруют через тканевый или ватно-марлевый фильтр. Разливают в стерильные пробирки (по 10,0 мл) или во флаконы и стерилизуют однократно текучим паром 30 мин.
После 30-минутного подсушивания чашки засевают вдоль полоски с антитоксином испытуемыми колониями, снятыми непосредственно с кровяного теллуритового агара; каждую колонию засевают в виде отдельной бляшки.
Приготовление бумажек с крезоловым красным 0,1 г крезолового красного растворяют в 100,0 мл 95%-ного спирта и оставляют при температуре 37°С на 24 ч, часто встряхивая. На следующий день смачивают в этом растворе полоски фильтровальной бумаги и быстро высушивают. Ярко-желтый цвет бумажек в щелочной среде переходит в разные оттенки красного.
к) Приготовление раствора антитоксической сыворотки. Берут ампулу лечебной антитоксической противодифтерийной сыворотки (10 000 МЕ/мл), содержимое переносят в стерильную пробирку, куда добавляют стерильный изотонический (0,5%) раствор натрия хлорида до общего объема 10,0 мл. Полученный рабочий раствор, содержащий 1000 ME в 1,0 мл, хранят в холодильнике (не более 1 мес.). Перед постановкой теста на токсигенность из рабочего раствора стерильно отбирают объем, необходимый для приготовления нужного числа чашек. Отобранный объем разводят в 2 раза до конечной концентрации 500 МЕ/мл. Так, для приготовления двух чашек берут 0,25 мл исходного рабочего раствора, содержащего 1000 МЕ/мл, а для 5 чашек — 0,625 мл и т.д„ после чего рабочий раствор разводят вдвое (т.е. до 500 МЕ/мл).
Лежащие в пустой стерильной чашке стерильные полоски фильтровальной бумаги пропитывают полученным раствором антитоксина (500 МЕ/мл) — по 0,25 мл на каждую полоску (т.е. по 125 ME). Обожженным пинцетом полоски накладывают на агаровую среду по диаметру чашки Петри.
Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 25.2.2020
ВЗЯТИЕ И ДОСТАВКА МАТЕРИАЛА
При проведении исследования на дифтерию необходимо во всех случаях брать материал из ротоглотки и носа. При дифтерии редких локализаций (глаз, ухо, рана, кожа, половые органы), помимо пораженных участков, следует брать материал также с миндалин и из носа. Материал для исследования берут до начала лечения антибиотиками. Взятие мазков должно производиться специально обученным персоналом.
Для взятия материала используют сухие стерильные ватные тампоны. Материал из ротоглотки и носа берут отдельными тампонами, натощак или не ранее, чем через 2 часа после еды, при хорошем освещении, с использованием шпателя, не касаясь тампоном зубов, слизистой щек и языка. Одним тампоном собирают материал с пораженных участков ротоглотки - миндалин, а при необходимости - с небных дужек, задней стенки глотки. При наличии налетов материал следует брать с границы здоровых и пораженных тканей, слегка нажимая на них тампоном, т.к. большинство жизнеспособных коринебактерий находится в глубоких слоях псевдомембраны, и поверхностный мазок может не содержать их.
Тампоны должны быть доставлены в лабораторию не позднее 3-х часов с момента взятия материала. При невозможности произвести доставку и посев материала в указанный срок, его необходимо засевать на чашки с питательной средой или в транспортную среду на месте взятия. Применение транспортной среды удлиняет срок выдачи окончательного ответа на одни сутки, однако использование питательного бульона в качестве транспортной среды позволяет применить экспресс-методы выявления дифтерийного токсина для выдачи предварительного ответа (иммуноферментный метод, реакцию непрямой гемагглютинации). При транспортировании на дальние расстояния можно использовать тампоны, предварительно смоченные 5% раствором глицерина на физиологическом растворе, pH которого доводят до 7,6 20% раствором. В осенне-зимнее время года материал доставляют в лабораторию в термоконтейнерах.
Каждой пробирке с исследуемым материалом (зев, нос, другая локализация) придается номер. В прилагаемом сопроводительном документе указывается номер пробирки, фамилия, имя, возраст, название учреждения, направляющего материал, цель обследования (диагностическая, по эпид. показаниям, профилактическое обследование), дата и время взятия материала.
Микроскопия окрашенного по Граму мазка из нативного материала не является обязательной процедурой из-за низкой диагностической ценности. Коринебактерии дифтерии не могут быть надежно идентифицированы от сапрофитов с помощью данного метода, который также имеет низкую чувствительность. Однако его целесообразно использовать при подозрении на дифтерию редких локализаций.
1. Материал от одного лица засевают на чашку с селективной дифференциальной средой (кровяно-теллуритовым агаром), используя при этом половину чашки для посева материала из зева, а вторую половину - из носа. При обследовании на дифтерию редких локализаций, добавляется еще одна чашка для посева клинического материала. Для повышения вероятности обнаружения возбудителя первичный посев следует производить дополнительно еще на одну чашку с другой селективной средой (Тинсдаля, Бучина) и чашку с кровяным агаром. Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку.
2. При посеве материал втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью приблизительно 2х1 см и затем частыми непрерывными штрихами, не изменяя положения тампона, засевают оставшуюся поверхность половины чашки.
3. Засеянные чашки или пробирки с транспортной средой помещают в термостат при 37 0 С. Высев из транспортной среды производят на следующие сутки на плотную питательную среду тампоном, отжатым о стенки пробирки, или петлей (что гораздо лучше и надежнее), взяв материал из осадка.
4. Посев следует производить на среды, согретые при комнатной температуре или в термостате. Свежеприготовленные среды необходимо подсушить в термостате 20-30 минут.
5. Колонии, выросшие на чашках, просматривают через 24 часа после посева материала с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС) или лупы.
Чашки с колониями, похожими на колонии коринебактерии дифтерии, отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам.
Колонии, подозрительные на принадлежность к C. diphtheria, C. ulcerans и C. pseudotuberculosis, через 24 часа роста на средах с теллуритом калия имеют черный или с серым оттенком цвет, обычно мелкие, не более 2 мм в диаметре, выпуклые, вязкие или крошащиеся при прикосновении петлей. На кровяном агаре колонии серые или слегка кремовые, могут быть окружены небольшой зоной гемолиза. На среде Бучина подозрительные колонии имеют синий цвет, а среда в месте их роста приобретает фиолетовый оттенок. На агаре Тинсдаля колонии черного цвета и, в дополнение, C. diphtheria, C. ulcerans, иногда C. pseudotuberculosis образуют коричневый ореол вокруг колонии. Колонии черного цвета на средах с солями теллура могут формировать и некоторые другие бактерии (например, стрептококки и стафилококки).
6. Из сомнительных колоний готовят мазки и окрашивают их метиленовой синью Леффлера. Если при микроскопии обнаруживают палочки, характерные для рода коринебактерий, то эти колонии отбирают для дальнейшей идентификации. При обнаружении кокков, дрожжей, споровых палочек дальнейшее исследование можно прекратить.
7. В случае роста подозрительных однотипных колоний необходимо приступить к их идентификации (определение токсигенных свойств, цистеназы) и выделению чистой культуры на скошенном сывороточном агаре. Токсигенные свойства изучают не менее чем у двух колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токcигенности и, необожженной петлей, на среду Пизу, а другой половиной колонии - в пробирку со скошенным сывороточным агаром для накопления чистой культуры. При невозможности снять половину колонии. Для посева на токсигенность и на среду Пизу используется материал целой колонии; посев на скошенный агар исключается и, в дальнейшем, используется культура из пробирки с пробой Пизу или из бляшки, выросшей на среде для определения токсигенности через 48 часов роста или через 24 часа в случае выявления токсигенных свойств.
Если на чашке первичного посева вырастает множество подозрительных колоний, крайне важно изучить токсигенные свойства, по возможности, у максимального числа колоний (не менее 10), смешивая по 5-10 однотипных колоний в одну бляшку.
8. При наличии множественного роста подозрительных колоний, можно поставить РНГА или ИФА (после субкультивирования колоний 5-18 часов на сывороточном бульоне), использовать дополнительную пробу Заксе или индикаторный диск для определения ферментации мочевины (3-5 однотипных колоний, учет через 0,5-2 часа инкубации) или пробу Пизу на модифицированной среде (5-6 однотипных колоний, учет через 3 часа инкубации).
При характерной для коринебактерии дифтерии морфологии колоний, морфологии клеток при микроскопии, отрицательной пробе Заксе, положительной пробе Пизу, положительном результате РНГА или ИФА можно выдать предварительный ответ об обнаружении культуры, подозрительной на коринебактерии дифтерии через 36-48 часов (на третьи сутки) с момента первичного посева исследуемого материала.
9. Чашки с первичным посевом исследуемого материала после просмотра на вторые сутки, вновь помещают в термостат на 24 часа и просматривают их повторно.
10. Через 24 часа просматривают чашки с посевами на токсигенность в проходящем свете и на темном фоне. Выделенная культура считается токсигенной, если образовавшиеся линии преципитации контрольного и исследуемого штаммов, сливаясь концами, плавно переходят одна в другую.
При наличии специфических линий преципитации, положительной пробе на цистеназу выдают документированный предварительный ответ о выделении токсигенной культуры коринебактерии дифтерии.
При отсутствии специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности, чашки инкубируют еще 24 часа.
11. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу (после определения ее чистоты), засевают на среды для определения биохимического варианта (сахароза, глюкоза, крахмал) и ферментации мочевины.
12. Чашки с первичным посевом просматривают повторно через 36-48 часов инкубации. При отсутствии колоний, подозрительных на коринебактерии дифтерии, выдают окончательный ответ, что коринебактерии дифтерии не выявлены.
При обнаружении подозрительных колоний проводят идентификацию культуры, определяют токсигенные свойства, цистеназную активность и выделяют чистую культуру (см. второй день исследования).
Иногда коринебактерии дифтерии вырастают на чашках первичного посева через 72 часа и позднее, поэтому следует осторожно относиться ко времени выдачи отрицательного ответа. Если материал для исследования был взят от больного подозрительного на дифтерию, необходимо произвести повторное взятие и исследование материала от этого больного.
Полное отсутствие роста на чашках первичного посева колоний каких-либо микроорганизмов свидетельствует о нарушении правил взятия, доставки, посева и культивирования исследуемого материала.
ЧЕТВЕРТЫЙ ДЕНЬ (или ПЯТЫЙ)
13. Повторно (через 48 часов) учитывают результаты теста на токсигенность, поставленного на второй день исследования. Одновременно производят учет сахаролитических свойств и уреазной активности в тестах, поставленных на третий день исследования.
При отсутствии специфических линий преципитации через 48 часов инкубации чашек со средой для определения токсигенности, но при положительных результатах проб на цистеназу, глюкозу, отрицательных результатах ферментации сахарозы и определения уреазной активности, культуру идентифицируют как коринебактерии дифтерии нетоксигенные, с указанием биохимического типа (см. таблицу 9).
В случае выделения токсигенных коринебактерий дифтерии и выдачи предварительного ответа на третий день, окончательный ответ с указанием биотипа выдается на четвертый или пятый день (через 72-96 часов с момента первичного посева исследуемого материала).
Биологические свойства коринебактерий, используемые при идентификации
| Вид корине-бактерий | Токиген-ные свойства | Ферментация | Редук-ция нитратов | |||||
| цистина | глюкозы | сахарозы | крахма-ла | мочеви-ны | мальто-зы | |||
| C.diphtheria, var.gravis | +/- | + | + | - | + | - | + | + |
| var.mitis * | +/- | + | + | - | - | - | + | + |
| intrmedius | +/- | + | + | - | - | - | + | + |
| C.ulcerans | +/- | + | + | - | + | + | + | - |
| C.pseudotu-berculosis | +/- | + | + | - | - | + | + | v |
| C.pseudo-diphthericum | - | - | - | - | - | + | - | + |
| C.xerosis | - | - | + | + | - | - | + | + |
+, 90% и более штаммов положительны в течение 2 дней;
-, 90% и более штаммов отрицательны;
v, более 10%, но менее 90% штаммов положительны;
*, биотип mitis включает штаммы ферментирующие сахарозу и не редуцирующие нитраты (вариант belfanti), которые встречаются редко
Таким образом, выделенные коринебактерии являются возбудителями дифтерии, если они обладают токсигенными свойствами, ферментируют глюкозу, крахмал, цистин; не ферментируют сахарозу и мочевину, а также имеют характерные морфологические и культуральные свойства.
СРОКИ ВЫДАЧИ И ФОРМУЛИРОВКА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО
1. Предварительный ответ об обнаружении культуры, подозрительной на коринебактерии дифтерии, выдается через 24-48 часов с момента первичного посева исследуемого материала при характерной для коринебактерий дифтерии морфологии бактериальных клеток и морфологии колоний, отрицательной пробе Заксе, положительной пробе Пизу, выявлении токсина методами иммуноиндикации, в частности, РНГА, ИФА, РНАт (методика последней изложена в приложении 5 к приказу МЗ СССР 1986 г. № 450), либо при выявлении гена токсинообразования (tox -гена) с помощью геноиндикации - полимеразной цепной реакции (ПЦР).
2. При обследовании на бактерионосительство с профилактической целью, а также при исследовании материала из мест редкой локализации дифтерии предварительный ответ не выдается. В этих случаях выдается только окончательный ответ, основанный на идентификации выделенных культур по всем свойствам.
3. Окончательный ответ при обследовании лиц всех категорий в случае роста коринебактерии дифтерии на чашках первичного посева через 24 часа может быть выдан через 48 часов (культура токсигенная) или через 72 часа (культура нетоксигенная). В тех случаях, когда колонии на чашках первичного посева появляются позднее, чем через 24 часа, ответ выдается, соответственно, позднее (до 96 часов). При применении транспортных сред срок выдачи ответа отодвигается еще на 24 часа.
5. При наличии линий преципитации, идентичных специфическим линиям контрольного штамма коринебактерий дифтерии, положительных проб на уреазу, цистеназу, ферментации глюкозы и крахмала, отсутствии ферментации сахарозы, редукции нитратов в нитриты культуру относят к виду C. ulcerans, токсигенный вариант (см. таблицу 9). Эти штаммы следует направлять в специализированную лабораторию для дальнейшего изучения.
В случае идентификации C. ulcerans, нетоксигенный вариант, выдают отрицательный ответ. Обнаружение коринебактерий Гофмана или других дифтероидов также дает возможность считать ответ отрицательным.
6. Во всех случаях обнаружения дифтерийных палочек лаборатория обязана известить учреждение, из которого был доставлен материал, и районного эпидемиолога.
7. При передаче ответа по телефону необходимо записывать дату передачи и фамилии лиц, передавших и принявших телефонограмму.
Культивирование.Коринебактерии — факультативные анаэробы, температурный оптимум 37-38° С, рН питательных сред 7,4-7,6. Для выделения патогенных коринебактерии используют кровяной, сывороточный (5%) МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера, кровяную теллуритовую среду, среду Леффлера. Контаминированный материал для подавления роста грамотрицательных бактерий засевают на агар Мак-Конки. Посевы инкубируют в условиях обычной атмосферы 24-48 часов.
Особенности роста коринебактерии на питательных средах. С.pseudotuberculosis на кровяном агаре через сутки инкубирования формирует желто-белые или белые с матовой поверхностью, непрозрачные колонии диаметром около 1 мм. Через 48-72 часа культивирования проявляется узкая зона гемолиза (у большинства штаммов). При длительном инкубировании размер колоний может достигать 3 мм, они приобретают коричневатый цвет и крошковидный характер.
На среде Леффлера возбудитель растет в виде крошковатого с желтым оттенком налета, без разжижения сыворотки. На кровяной теллуритовой среде колонии мелкие, слабовыпуклые, с матовой поверхностью, черного цвета. В питательном бульоне возбудитель растет без или с равномерным помутнением среды, с появлением небольшой пленки и осадка.
C.renale через 24 часа инкубирования образует мелкие, негемолитические колонии, с возрастом превращающиеся в непрозрачные, белые. C.pilosum образует колонии, сходные с колониями C.renale, приобретающие с возрастом цвет от желтого до коричневого. C.cystitidis формирует колонии как и C.renale, но обычно белого цвета. C.equi (R.equi) через 24 часа выращивания посевов образует мелкие, гладкие, блестящие колонии, негемолитические. В более старых культурах колонии желтовато-розового цвета.
Морфология клеток коринебактерии в культуре. Из подозрительных колоний готовят и микроскопируют мазки, окрашенные по Граму. Клетки коринебактерии в мазках из колоний по морфологии и тинкториальным свойствам в основном не отличаются от таковых в препаратах из исходного материала.
Идентификация коринебактерии на уровне рода. Культуры бактерий, сходные по морфологическим, тинкториальным, культуральным свойствам с коринебактериями, отвивают на питательные среды и исследуют с целью идентификации. Для идентификации на родовом уровне принимают во внимание происхождение материала, тинктори-альные особенности (быстрота обесцвечивания при окраске по Граму), морфологию клеток, отношение к кислороду, подвижность, каталазную активность.
Идентификация коринебактерии на уровне вида. Выделенные культуры на последующем этапе дифференцируют на виды путем изучения гемолитической активности на кровяном агаре, ферментативных свойств: гидролиз эскулина, редукция нитратов, разжижение желатины, образование уреазы, образование кислоты без газа из глюкозы, мальтозы, сахарозы (табл. 61).
С целью уточнения видовой принадлежности выделенной культуры коринебактерии число изучаемых признаков может быть в случае необходимости расширено (табл. 63).
Биопроба. При заражении мышей культурами С. pseudotuberculosis выявляется вариабельность их вирулентности. При внутривенном заражении погибает 90,7% животных, при подкожном — около 21,2%. В результате внутрибрюшинного заражения морских свинок (самцы) можно вызвать орхит.
Питательные среды. Среда Тинсдаля. К 1000 мл расплавленного и охлажденного до 50° С 2%-ного МПА добавляют 120 мл 1%-ного раствора L-цистина на 0,1 N хлористоводородной кислоте, 120 мл 0,1 N раствора гидроокиси натрия, 18 мл 2%-ного раствора теллурита калия, 18 мл 2,5%-ного раствора гипосульфата натрия и 200 мл стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота.
Приготовление раствора теллурита калия. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 2 г теллурита калия. Раствор стерилизуют в кипящей водяной бане 30 минут и хранят при комнатной температуре. В случае выпадения осадка раствор вновь прогревают в водяной бане.
Таблица 61 - Дифференциальные признаки грамположительных,
не образующих спор, неправильной формы палочек
| Признаки | Cory neb ас -terium | Agromyces | Cellulomonas | Oerskovia | Rothia | Actinomyces | Arc anob ас terium | Propiono-bac terium | Arachnia | Cardnerella |
| Морфология клетки | Палочки булавовидной формы | Ветвящиеся, нитевидные формы | Неправильные палочки, кокковые формы | Ветвящиеся гифы, палочковидной формы | Неправильные палочки, нити, кокковид-ные формы | Палочки, нити, ветвящиеся структуры | Короткие неправильные палочки, могут доминировать кокко-видные формы | Неправильные палочки, ветвящиеся и кок-ковидные формы | Палочки, нити, ветвящиеся структуры | Неправильные палочки |
| Окраска по Граму + | + | + ' | + | + | + | + | + | + | - | |
| Отношение к кислороду: | Строгий аэроб Р | X | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Факультативный анаэроб или мик-роаэрофил Р | X | + | + | + | + | + | Р | + | + | |
| Строгий анаэроб | - | - | - | - | - | - | - | Р | - | - |
| Подвижность | - | _ | Р | X | - | - | - | - | - | - |
| Каталаза | + | - | + | + | + | + 4 | - | - | ||
| Место обитания и патогенные свойства | Человек, животные и др. источники. Есть виды, патогенные для животных и человека | Почва | Почва, гниющие растения | Почва, гниющие растения, другие источники | Ротовая полость; оппортунистический патоген человека | Млеко питающие; большинство патогенны для животных и человека | Животные, человек; патогенны для человека и животных | Продукты, кожа человека, клинический материал. Есть патогенные для человека | Ротовая полость и др. материалы от человека. Может быть патогенней для человека | Генитальный и мочеполовой тракты |
| 1 - Возможно быстрое обесцвечивание; 2 - Возможно появление грамотрицательных клеток, но более типична вариабельность; некоторые штаммы дают положительную реакцию; 4 которые штаммы дают негативную реакцию; штаммов имеют положительный признак; признак различен в рангах (вида, рода, семейства). |
Таблица 62 - Дифференциация коринебактерий и Rhodococcus equi
| Признаки | C.bovis | C.kurtscheri | С.pseudotuberculosis | C.renaie группа | R.equi |
| β-гемолиз | - | V | - | - | - |
| Гидролиз эскулина | - | + | - | - | - |
| Редукция нитратов | - | + | V" | V | + |
| Уреаза | - | + | + (>18ч) | + ( 18ч) | |
| Разжижение желатина | - | - | - | V | - |
| Глюкоза | + | + | + | + | - |
| Мальтоза | - | + | + | - | - |
| Сахароза | - | + | - | - | - |
+ положительная реакция; - отрицательная реакция; v - варьирующий признак;
v"- штаммы, выделенные от лошадей позитивные, от овец - негативные.
Таблица 63 - Дифференциация С. renale, C. pilosum, C. cystitidis
| Признаки | C.renaie | C.pilosum | C.cystitidis |
| Цвет колоний | Желтый | Желтый | Беловатый |
| Срок появления макроскопически видимых колоний при 37° С | 24 ч | 48 ч | |
| Образование кислоты из: | |||
| ксилозы | - | - | + |
| крахмала | - | + | + |
| Редукция нитратов | - | + | - |
| Разжижение казеина | + | - | - |
| Гидролиз твина-80 | - | - | + |
| Рост в бульоне с рН 5,4 | + | - | - |
Таблица 64 - Дифференциальные признаки видов коринебактерий
| Признаки | C.diphteriae | C.pseudotuberculosis | C.xerosis | C.pseudodiphteriticum | C.kurtscheri | C.minutissi mum | C.striatum | C.renale | C.cysticus | |
| Гидролиз | эскулина | - | - | - | - | - | нд | - | - | - |
| гиппурата | - | - | + | + | + | + | + | + | + | |
| желатина | X | - | - | - | - | х 2 | - | - | ||
| Уреаза | + | - | + | + | - | - | + | + | ||
| Фосфатаза | - | - | - | - | - | + | + | - | - | |
| Расщепление тирозина | - | - | - | - | - | нд | + | - | - | |
| Метилрот | + | + | - | - | - | - | + | - | - | |
| Расщепление казеина | - | - | - | - | - | - | - | + | - | |
| Редукция нитратов | + 3 | X | + | + | + | - | - | - | - | |
| Образование кислоты из: | глюкозы | + | + | + | - | - | + | + | + | + |
| арабинозы | + | X | - | - | - | нд | - | - | - | |
| ксилозы | - | - | - | - | - | - | - | - | + | |
| рамнозы | + | - | - | - | - | НД | - | - | - | |
| фруктозы | + | + | + | - | + | + | + | + | + | |
| галактозы | + | + | + | - | - | нд | 4 X | - | - | |
| маннозы | + | + | 4 X | - | + | X | + | + | - | |
| лактозы | - | - | - | - | - | - | X | - | - | |
| мальтозы | + | + | - | + | + | + | X | + | ||
| сахарозы | X | + | - | + | + 4 | - | - | |||
| трегалозы | - | X | - | X | X | + | ||||
| раффинозы | X | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| салицина | + | - | + | - | + | нд | - | - | - | |
| декстрина | + | X | - | - | + | нд | + | + | + | |
| крахмала | X | - | - | - | + | - | + | - | + |
| Признаки | C.pulosum | C.mucetoides | C.matruchotii | C.flavescens | C.vitarumen | C.glucamicum | C.callunac | C.bovis | C.paurometobolum | |
| Гидролиз | эскулина | - | - | + | нд | + | - | - | - | + |
| гиппурата | + | нд | + | - | - | + | + | + | - | |
| желатина | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| Уреаза | + | - | х 2 | - | + | + | + | - | - | |
| Фосфатаза | - | + | - | - | - | нд | нд | + | + | |
| Расщепление тирозина | - | нд | нд | нд | нд | нд | нд | - | - | |
| Метилрот | - | - | - | + | + | + | + | - | - | |
| Расщепление казеина | - | нд | НД | нд | нд | - | - | - | - | |
| Редукция нитратов | + | - | + | - | + | + | - | - | - | |
| Образование кислоты из: | глюкозы | + | + | + | + | + | + | + | + | - |
| арабинозы | - | - | - | - | нд | - | - | X | - | |
| ксилозы | - | - | - | - | нд | - | - | - | - | |
| рамнозы | - | нд | - | - | нд | - | - | - | - | |
| фруктозы | + | нд | + | + | + | + | + | + | - | |
| галактозы | - | - | - | + | + | - | - | + | - | |
| маннозы | + | - | + | + | + | + | + | - | - | |
| лактозы | - | - | - | - | - | - | - | X | - | |
| мальтозы + | - | + | - | + | + | + | + | - | ||
| сахарозы - | нд | + | - | + | + | + | - | - | ||
| трегалозы | + | X | - | - | + | + | + | X | - | |
| раффинозы - | - | 5 X | - | нд | - | - | - | - | ||
| салицина - | нд | + | - | + | - | + | - | - | ||
| декстрина | + | - | + | - | нд | - | - | X | - | |
| крахмала | + | нд | - | - | - | - | - | - |
' Исключение — тип ulcerans; 2 около 50% штаммов положительны; 3 тип ulcerans может быть отрицательным; 4 некоторые штаммы отрицательные; 5 некоторые штаммы положительные; нд — нет данных; х — 11-89% штаммов положительные.
Приготовление раствора гипосульфита натрия. Раствор готовят на стерильной дистиллированной воде. После добавления каждого компонента среду тщательно перемешивают и, не стерилизуя, разливают по чашкам Петри. До использования среду можно хранить при 10° С не более 3-4 суток.
Среда предназначена для дифференциации возбудителя дифтерии и дифтероидов. Коринебактерии дифтерии образуют колонии черного цвета, т.к. способны продуцировать сероводород из цистина, взаимодействующий с солью теллурита. С. diphtheriae var. gravis на этой среде образует мелкие, выпуклые, блестящие, черные колонии. Среда обладает селективными свойствами, посторонняя микрофлора растет слабо.
Кровяной теллуровый агар. К 100 мл расплавленного и охлажденного до 45-50° С питательного агара (рН 7,6-7,8) добавляют 10 мл дефибринированной крови лошади или крупного рогатого скота, 2 мл 2%-ного раствора теллурита калия (К,ТеО3). Полученную среду перемешивают и разливают в чашки Петри. Колонии дифтерийных бактерий на этой среде имеют черный цвет или черный центр колонии, дифтероидов — более выпуклые, влажные, серого цвета, с коричневым центром, ложнодифтерийных бактерий — мелкие серые, с коричневым центром, непрозрачные.
Среда Пергола. Используют как среду обогащения для выделения коринебактерии дифтерии. Из куриного яйца стерильно извлекают желток, переносят его в колбу с бусами и добавляют 100 мл стерильной сыворотки крови лошади или крупного рогатого скота, 1 мл 2%-ного раствора теллурита калия; тщательно перемешивают. Полученую смесь разливают по 2-3 мл в стерильные пробирки и прогревают 1 ч в водяной бане при 56° С. Затем для контроля стерильности выдерживают 48 ч в термостате при 37° С. На этой среде дифтерийные бактерии формируют через 12-
15 ч инкубирования светло- или темно-серые влажные колонии.
Ацетатно-теллуритовый бульон для дифтерийных микробов. В колбе смешивают 200 мл МПБ (рН 7,4), 2 мл глицерина, 18 мл 50%-ного раствора пептона Витте и 0,63 мл 50%-ного раствора ацетата натрия. Среду стерилизуют текучим паром в течение 1 ч, охлаждают до 48° С и добавляют 10 мл 1%-ного раствора теллурита калия и 21 мл дефибринированной крови барана.
Желточно-молочно-агаровая среда. К 1000 мл 4%-ного агара на мартеновском бульоне или МПБ (рН 7,6-7,8) добавляют 10 куриных желтков, эмульгируют и вносят 800 мл обезжиренного, стерильного молока. Компоненты перемешивают, готовую среду разливают по стерильным пробиркам, скашивают и дважды по 1 ч прогревают в аппарате Коха при 80° С.
Среда Пай. В колбе смешивают 1000 мл содержимого куриных яиц и 500 мл дистиллированной воды, взбивают, фильтруют через двойной слой марли, добавляют 120 мл глицерина, 5 г декстрозы, перемешивают, разливают по стерильным пробиркам, скашивают и стерилизуют как свернутую сыворотку (см. среда Леффлера).
Индикаторная среда III для дифтерийных бактерий. К 420 мл 3%-ного питательного агара добавляют 12,5 мл 1%-ного раствора цистина, 1,5 мл 50%-ного раствора ацетата натрия, 880 мл 1%-ного раствора теллурита калия. Устанавливают рН 8,0 и вносят 60 мл 2%-ного раствора индикатора водного голубого. В нагретую до 50-55° С среду добавляют смесь следующего состава: 280 мл дистиллированной воды, 21 мл глицериновой смеси (см.среда Клауберга II), 15 г глюкозы, 140 мл дефибринированной крови (рН смеси 7,0). После перемешивания среду разливают в чашки Петри.
Сывороточная среда Леффлера. Рекомендуется для выращивания патогенных нейссерий, коринебактерии. Смешивают 750 мл сыворотки крови овцы, 250 мл МПБ (рН 7,0), 2,5 г декстрозы, 1,25 г натрия хлорида. Среду разливают в пробирки и свертывают в скошенном положении при 80° С 3 дня по 2ч в аппарате Коха или в сушильном шкафу при 70° С 3 дня по 1 ч.
Читайте также: