Стрептококк а штамм гуров
Изобретение относится к области микробиологии, молекулярной генетики и медицины и может быть использовано в терапии злокачественных новообразований.
Традиционные противораковые методы лечения, такие как хирургическое вмешательство, лучевая терапия и химиотерапия, эффективны при лечении солидных опухолей, только в некоторой степени. Кроме того, они часто связаны с серьезными побочными эффектами. Альтернативой этим методам лечения является использование некоторых бактерий в качестве иммуномодуляторов и цитолитиков с прямой противоопухолевой активностью.
Терапевтический эффект от использования бактерий в лечении рака был продемонстрирован более 100 лет назад [Nowotny A. Handbook of Endotoxin. Vol. 3. Elsevier Science; Amsterdam: 389-448 (1985)]. А в 1890 нью-йоркский врач Coley обнаружил, что у нескольких пациентов с неоперабельными опухолями наблюдалась регрессия роста опухоли после введения Streptococcus pyogenes (СГА) [Coley W.B. Clin Orthop Relat Res: 3-11 (1991)].
Известен штамм Streptococcus pyogenes, введение которого мышам в ранее привитую опухоль (рак поджелудочной железы) приводило к регрессии последней [Maletzki C, Linnebacher М, Kreikemeyer B, Emmrich J. Gut. 57(4): 483-491 (1998)].
Однако бактерии Streptococcus pyogenes являются широко распространенным патогеном для человека и приматов, инфицируя, главным образом, назофарингеальную слизистую и кожу.
В основу решения указанной задачи положена модификация нуклеотидной последовательности гена, кодирующего М белок, путем интеграции в него специально сконструированной плазмиды pT7ErmEMM.
М белок является одним из основных факторов вирулентности СГА, способствующий устойчивости СГА к фагоцитозу [Maxted W.R. The British Journal of Experimental Pathology. №37(4): 415-422 (1954).]. Впоследствии было доказано, что антифагоцитарную активность М белка обеспечивает область, расположенная на его N-терминальном конце [Cunningham М.W., Beachey Е.Н. Infection and Immunity. №9 (2): 244-248 (1974); Beachey E.H., Campbell G.L., Ofek I. Infection and Immunity. №9 (5): 891-896 (1947).].
Генетическую модификацию осуществляют следующим образом:
Проводят анализ гена emm, кодирующего N-терминальный конец М белка, с целью выбора фрагмента, отвечающего за антифагоцитарные свойства М белка. Конструируют пары праймеров, фланкирующих выбранную область на гене emm, включая сайты рестрикции для эндонуклеаз HindIII и EcoRI с целью последующего клонирования в интегративный вектор. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и специфических праймеров получают необходимый фрагмент ДНК.
Морфологические признаки. Клетки шаровидной или овоидной формы, растущие чаще в виде цепочек, неспороносные, грамположительные.
Культуральные признаки. Бактериальные клетки хорошо растут на питательных средах с добавлением крови или сыворотки крови. При выращивании на 5% кровяном агаре образуют очень мелкие колонии с образованием зоны β-гемолиза. На жидких средах (Todd-Hewitt) рост придонно-пристеночный в виде крошковатого осадка, бульон чаще прозрачен.
Физико-биологические признаки. Клетки растут при оптимуме температуры +37°C и оптимальных значениях pH от 7.2 до 7.6. Не растут при 10°C и 45°C, в бульоне с 6,5% хлорида натрия, при pH 9,6, в молоке с 0,1% метиленового синего. Ферментируют глюкозу, лактозу, сахарозу, салицин, трегалозу, не ферментируют инулин, сорбит, глицерин, гиппурат натрия. Оптимальная среда для культивирования - среда Todd-Hewitt с 5% CO2.
На фиг. 1 показана схема получения интегративной плазмиды pT7ErmEMM. Фрагмент ДНК, кодирующий выбранную область М белка, получают с помощью полимеразной цепной реакции и специально сконструированных праймеров. Синтезированный фрагмент ДНК очищают с использованием набора для очистки ПЦР-продуктов (PCR Purification Kit, Qiagen, Германия), расщепляют эндонуклеазами HindIII и EcoRI и лигируют с вектором p7ermB, обработанным такими же ферментами.
Интегративная плазмида pT7ErmEMM содержит: фрагмент, несущий ген устойчивости к эритромицину, промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7, фрагмент гена emm.
Полученный рекомбинантный штамм сохраняет групповую принадлежность, характерную морфологию, адгезивную способность к клеткам эпителия и другие свойства S. pyogenes и при этом обладает противоопухолевой активностью.
Суспензию живых S. pyogenes, приготовленную в физиологическом растворе pH-7,4 в концентрации 10 6 бактерий/мл в объеме 50 мкл двукратно вводят внутрь опухолей. Первую инъекцию осуществляют через 9 суток от начала инокуляции опухолевых клеток, при достижении опухолевым узлом размера 2-3 мм. Повторную инъекцию проводят с интервалом 5 суток. Контрольным животным вводят подкожно 50 мкл физиологического раствора. Спустя 5 суток после второй инъекции (19 суток после инокуляции опухоли) опухоли измеряют в двух взаимно перпендикулярных направлениях и вычисляют средний диаметр опухоли по формуле: 
где "а" - наибольший, "b" - наименьший размер опухоли, а 1 мм - толщина кожной складки.
Этот эффект наблюдался только при росте гепатомы 22а (фиг. 3, фрагмент А) и не проявлялся при росте саркомы S37 (фиг. 3, фрагмент Б).
Фиг. 2 демонстрирует влияние внутриопухолевого введения S.pyogenes на размер опухолей мышей с гепатомой 22а (фрагмент А) и саркомой S37 (фрагмент Б).
Александр Николаевич Суворов — член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, заведующий отделом молекулярной микробиологии НИИ экспериментальной медицины, профессор кафедры фундаментальных проблем медицины и медицинских технологий Санкт-Петербургского государственного университета. Занимается исследованием молекулярных механизмов патогенности бактерий, в частности факторов вирулентности стрептококков, конструированием новых вакцин, а также изучением свойств пробиотиков и механизмов, обеспечивающих их действие.
Кто друг, а кто враг?
Чем же заняты в нашем организме разнообразные бактерии? Механистическое разделение бактерий на симбионтов и патогенов не улучшило понимание. Более того, к настоящему времени накопилось немало научных данных о не совсем понятном месте в системе взаимоотношения микрои макромира даже патогенных организмов.
Современные знания о микромире (микробиоте) человека однозначно указывают на то, что каждый из нас обладает сложнейшим суперорганизмом, в который, помимо собственного тела, входит сообщество самых разных микроорганизмов — бактерий, архей, простейших и вирусов. В совокупности их генетический аппарат (микробиом ** ) существенно превосходит геном человека. Изучение микробиоты человека в последние годы позволило пролить свет на многие функции микроорганизмов, жизненно необходимые для нашего существования. Это касается и обмена веществ, и работы всех органов и систем человека.
Бактерии vs рак
Вильям Коли, изобретатель онколитической терапии бактериями
В 1891 г. Коли впервые добился полного излечения больного от рака, введя ему стрептококки в область опухоли (саркомы), а спустя год представил Американскому хирургическому обществу первые успешные результаты онколитической терапии сарком у значительной группы пациентов. До конца своей врачебной практики (в 20-х годах XX в.) Коли пролечил с использованием бактерий более 1,5 тыс. пациентов, достигая положительных результатов в 75% случаев, при этом спас 895 неоперабельных онкологических больных.
Возникает сразу несколько справедливых вопросов. Почему при столь успешном лечении рака (а такому высокому проценту излеченных могут позавидовать и современные онкологи) мировое врачебное сообщество отказалось или не восприняло онколитическую терапию Коли? Неужели все дело в жадных фармацевтических компаниях, стремящихся продать свои препараты, или в бессердечных онкологах, желающих обобрать пациента на краю смерти?
Таблица. Некоторые бактериальные пептиды и токсины, обладающие противоопухолевой активностью [4]
Найти и обезвредить
Важнейшая особенность бактериальной терапии рака — почти полное отсутствие побочных реакций иммунной системы и организма в целом. К тому же бактерии как самонаводящиеся ракеты могут находить опухолевые ткани в организме, что сильно отличает такой подход от большинства химических препаратов (например, цитостатиков), действующих по принципу гранаты в темном подвале: достанется всем — и друзьям, и врагам.
Пиогенный стрептококк (Streptococcus pyogenes) — чемпион противоопухолевого действия по всем критериям. Этот стрептококк группы А, колонизирующий обычно миндалины или чуть реже кожные покровы, может вызывать такие неприятные заболевания, как фарингиты, стрептодермии, скарлатину, рожистое воспаление, а также иммунопатологические осложнения в виде ревмокардитов и гломерулонефритов. Однако описано и многолетнее бессимптомное носительство S. pyogenes в организме человека.
Стрептококки группы А на клетках линии нервной ткани [8]
Стрептококковая аргининдеиминаза оказалась наиболее эффективным бактериальным противораковым агентом, который в настоящее время усердно изучают и уже рассматривают в качестве перспективного препарата для терапии самых трудноизлечимых новообразований, включая опухоли мозга [5, 6].
Важно также то, что появление патогена в неположенном месте дополнительно мощно стимулирует врожденный иммунитет, обычно подавленный при развитии рака, привлекая к опухолевой ткани новые отряды Т-киллеров и М1-макрофагов, выполняющих положенные им полицейские функции.
И вновь возникает вопрос: почему же медики забыли работы Коли? На самом деле забыли, но не все и не вполне. Исследования онколитических бактерий, включая стрептококков, продолжались и после его смерти. В 1959 г. один из основоположников онкоиммунологии Л. Дж. Олд (L. J. Old; 1933–2011) установил, что вакцина БЦЖ, используемая для профилактики туберкулеза, может ингибировать рост опухоли у мышей [9]. В 1970-х годах канадские ученые доказали эффективность БЦЖ при лечении рака мочевого пузыря [10]. В 1991 г. в США использование вакцины в этих целях было одобрено Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, FDA), и БЦЖ стала первой официально зарегистрированной онколитической бактерией. В конце 1980-х годов в Японии был создан и зарегистрирован препарат ОК432 на основе S. pyogenes с доказанной эффективностью против широкого круга различных опухолей [11]. В России, начиная с 70-х годов прошлого века, под руководством академика В. А. Черешнева проводилась селекция и локальные клинические исследования стрептококковых штаммов с противоопухолевым действием. Активно разрабатываются и другие подобные препараты (например, на основе аргининдеиминазы), однако по-прежнему не решена основная проблема использования живых патогенов в лечении рака — контроль инфекции. А что, если выпущенные на волю разбойники так разойдутся, что порушат всю государственную систему? Вопрос безопасности, конечно же, наиболее серьезный, и он беспокоил и самого автора противораковой вакцины — Вильяма Коли.
Схематическое изображение клеточной стенки стрептококков группы А и М-белка
Возможно также, что проведенные генетические манипуляции в области гена М-белка на рушили структуру данного тонко регулируемого генетического участка хромосомы стрептококков, отвечающего за вирулентность бактерии [14].
Литература
1. Tjalsma H., Boleij A., Marchesi J. R., Dutilh B. E. A bacterial driver-passenger model for colorectal cancer: beyond the usual suspects // Nat. Rev. Microbiol. 2012; 10(8): 575–582. DOI: 10.1038/nrmicro2819.
2. Ferlay J., Soerjomataram I., Dikshit R. et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012 // Int. J. Cancer. 2015; 136(5): E359–E386. DOI: 10.1002/ijc.29210.
3. Nair N., Kasai T., Seno M. Bacteria: prospective savior in battle against cancer // Anticancer Res. 2014; 34(11): 6289–6296.
4. Karpiсski T. M. Anticancer activity of bacterial proteins and peptides // Pharmaceutics. 2018; 10(2): E54. DOI: 10.3390/pharmaceutics10020054.
5. Fiedler T., Straussab M., Hering S. et al. Arginine deprivation by arginine deiminase of Streptococcus pyogenes controls primary glioblastoma growth in vitro and in vivo // Cancer Biol. Ther. 2015; 16(7): 1047–1055. DOI: 10.1080/15384047.2015.1026478.
6. Maletzki C., Rosche Y., Riess C. et al. Deciphering molecular mechanisms of arginine deiminase-based therapy — Comparative response analysis in paired human primary and recurrent glioblastomas // Chem. Biol. Interact. 2017; 278: 179–188. DOI: 10.1016/j.cbi.2017.10.007.
7. Krzykawski M. P. Combined bacterial and viral treatment: a novel anticancer strategy // Cent. Eur. J. Immunol. 2015; 40(3): 366–372. DOI: 10.5114/ceji.2015.54601.
8. Maletzki C., Klier U., Obst W. et al. Reevaluating the concept of treating experimental tumors with a mixed bacterial vaccine: Coley’s Toxin // Clin. Dev. Immunol. 2012; 2012: 230625. DOI: 10.1155/2012/230625.
9. Old L. J., Clark D. A., Benacerraf B. Effect of Bacillus Calmette Guerin infection on transplanted tumors in the mouse // Nature. 1959; 184: 291–292. DOI: 10.1038/184291a0.
10. Morales A., Eidinger D., Bruce A. W. Intracavitary Bacillus Calmette-Guerin in the treatment of superficial bladder tumors // J. Urol. 1976; 116(2): 180–183. DOI: 10.1016/S0022-5347(17)58737-6.
11. Bonavida B., Katz J., Hoshino T. Mechanism of NK activation by OK-432 (Streptococcus pyogenes). I. Spontaneous release of NKCF and augmentation of NKCF production following stimulation with NK target cells // Cell Immunol. 1986; 102(1): 126–135. DOI: 10.1016/0008-8749(86)90331-X.
12. Suvorova M. A., Kramskaya T. A., Suvorov A. N., Kiseleva E. P. Inactivation of M111 protein gene modifies Streptococcus pyogenes interactions with mouse macrophages in vitro // Bull. Exp. Biol. Med. 2018; 164(3): 347–350. DOI: 10.1007/s10517-018-3987-z.
13. Суворова М. А., Крамская Т. А., Дуплик Н. В. и др. Влияние инактивации гена М-белка на противоопухолевые свойства живых Streptococcus pyogenes в эксперименте // Вопросы онкологии. 2017; 63(5): 803–807.
14. McMillan D. J., Drèze P. A., Vu T. et al. Updated model of group A Streptococcus M proteins based on a comprehensive worldwide study // Clin. Microbiol. Infect. 2013; 19(5): E222–E229. DOI: 10.1111/1469-0691.12134.
* Подробнее см.: Суворов А. Н. Гонки с микробами: наши шансы // Природа. 2011. № 5. С. 13–24. — Примеч. ред.
** Подробнее см.: Суворов А. Н. Мир микробов и человек // Природа. 2015. № 5. С. 11–19. — Примеч. ред.
1. В настоящее время одной из самых перспективных противораковых вакцин является вакцина академика РАН и РАМН иммунолога В.А. Черешнева, которая является эффективной так же и при сердечно-сосудистых заболеваниях. Она создана на основе стрептококков штамм Гуров, причем эти стрептококки не являются антагонистами по отношению к организму человека - они всегда в нём жили, но исчезли с появлением антибиотиков. Собственно говоря, именно из-за этого после войны стала резко увеличиваться заболеваемость раком (например, в США в 15 раз!). Черешнев разыскал штамм Гуров в довоенной коллекции микроорганизмов, создал вакцину и ввел ее себе, что не только оздоровило его организм, но и увеличило его работоспособность. Вот пример. Он одновременно работает в трех городах (Пермь, Екатеринбург, Москва), являясь руководителем трех НИИ (Институт экологии и генетики микроорганизмов РАН, Института физиологии и иммунологии РАН, Средне-Уральского научного центра РАМН). Кроме того, он руководит Уральским Отделением РАН и является вице-президентом РАН. Весьма полезно было бы эту вакцину привить всем членам Госдумы и СФ, что не только сделало бы их более работоспособными, но и более здоровыми. На мой взгляд, именно Черешнев является наилучшим кандидатом на пост президента РАН и его кандидатуру можно рекомендовать президенту РФ. По новому Уставу РАН, который принят недавно, кандидатуру президента РАН выдвигает Общее Собрание РАН, а утверждает президент РФ. Но даже если Общее Собрание выдвинет другого кандидата, все равно можно поставить Черешнева, так как в этом случае врио президента РАН назначается из числа вице-президентов. Поскольку Черешнев В.А. является депутатом Госдумы от "Справедливой России", то именно его и целесообразно предлагать, что позволит увеличить популярность "Справедливой России" среди ученых и вообще интеллигенции. Я считаю, что будет неплохо, если его фамилия будет звучать в названии препарата и имеет смысл убедить учёного в этом по партийной линии. Известна же мазь Вишневского, кружка Эйсмарха и т. д. Применительно к проблемам лечения рака известен такой исторический факт - писатель Антон Чехов в своем дневнике 1884 г. писал о случае самоизлечения от рака женщины, случайно заболевшей рожей (возбудителем рожи являются стрептококки). Именно на основе стрептококков создал свою вакцину американский онколог Вильямс Колли, который с 1893 по 1917 год ею вылечил 1000 больных раком, из которых умерло всего 6 человек (сейчас в мире заболевает раком 10 млн. чел, а умирает 8,5 млн. чел). Причем Колли имел право лечить только больных с 3-4 стадией. Погубило вакцину то обстоятельство, что она была слишком дешевой - ее стоимость была сравнима со стоимостью ее почтовой пересылки. То ли дело сейчас: по словам главного онколога РФ стоимость 1 инъекции современного противоракового препарата составляет более 1500 долл., а надо десятки инъекций и по нескольку курсов. Причем никакой гарантии излечения не дают. По этой причине официальная онкология всегда будет против вакцины Черешнева.
. 3. Обе вакцины (Черешнева и Бритова) объединяет одно обстоятельство - у них нет шансов быть утвержденными, причем не только из-за противодействия консерваторов. Например, когда пенсионер Бритов обратился по поводу проверки и утверждения его вакцины, то с него затребовали 300 млн. руб. Поэтому даже если РОНЦ создаст свое эффективное противораковое средство, то оно тоже не сможет утвердить его, так как годовой бюджет РОНЦ тоже составляет 300 млн. руб. По этой причине в России за последние 15 лет не было утверждено ни одного собственного лекарственного препарата. Не только противоракового, но вообще ни одного! То есть наша наука работает вхолостую, питая зарубежную медицинскую фармакологию - в очереди за утверждением сидят только зарубежные фирмы. Я вовсе не предлагаю сломать этот уже сложившийся порядок - мое предложение в другом, и реализация его доступна именно Госдуме. Госдума должна целевым назначением финансировать утверждение нужных народу лекарственных средств, причем выделять деньги надо не на организацию или на Министерство Здравоохранения, а именно отдельной строкой на утверждение конкретных вакцин, лекарств и прочее. В данном случае это вакцины Черешнева и Бритова, хотя могут быть назвать и другие препараты.
| Классы МПК: | A61K35/74 бактерии A61P37/00 Лекарственные средства против иммунологических или аллергических заболеваний |
| Автор(ы): | Черешнев В.А. , Морова А.А. , Иконникова Г.В. , Губа А.С. |
| Патентообладатель(и): | Черешнев Валерий Александрович, Морова Агния Аркадьевна, Иконникова Галина Владимировна, Губа Александр Сергеевич |
| Приоритеты: |