Тесты для дифференциации стрептококков
151 . Заболевание дифтерией вызывает:
а) Corynebacterium diphtheriae нетоксигенный штамм
б) Corynebacterium diphtheriae токсигенный штамм (+)
в) Corynebacterium xerosis
г) Corynebacterium minutissimum
д) Mycobacterium bovis
152. Решающим для заключения о выделении возбудителя дифтерии является:
а) морфология клетки
б) ферментативная активность
в) подтверждение токсигенности в реакции преципитации (+)
15 3. Определение токсигенности коринебактерии проводится:
а) по внешнему виду подозрительных колоний
б) по биохимическим свойствам
в) по результатам пробы Пизу
г) по результатам реакции преципитации в геле (+)
д) по результатам пробы Заксе
15 4. Морфологические особенности коринебактерий позволяют:
а) установить видовую принадлежность
б) предположить род (+)
в) определить биовар
г) оценить токсигенность
155. Заключение по результатам бактериологического исследования на дифтерию отрицательное, если выделен:
а) атоксигенный штамм C . diphtheriae биовар mitis (+)
б) токсигенный штамм C . diphtheriae биовар mitis
в) токсигенный штамм C . diphtheriae биовар gravis
г) токсигенный штамм C . diphtheriae биовар intermedius
д ) токсигенный штамм C. diphtheriae
156. Заключение по результатам бактериологического исследования на дифтерию положительное, если выделен:
а) атоксигенный штамм C . diphtheriae тип gravis
б) токсигенный штамм C . diphtheriae тип mitis (+)
в) атоксигенный штамм С. ulcerans
д) атоксигенный штамм C . diphtheriae биовар mitis
г) атоксигенный штамм C . diphtheriae биовар intermedius
157. Температура хранения музейных культур коринебактерий (градусов Цельсия):
158. Какой тест является решающим в бактериологическом исследовании на дифтерию:
а) ферментация глюкозы
б) расщепление крахмала
в) определение токсигенности (+)
г) уреазная активность
159. Обязательными условиями при заборе материала на дифтерию являются:
а) своевременность взятия материала
б) отдельные тампоны для зева и носа
в) трехкратное исследование
г) взятие до начала антибиотикотерапии
в) все перечисленное (+)
160. Какой из представителей рода Corynebacterium ферментирует цистин:
б) C . diphtheriae (+)
г) C. minutissimum
161. В отличие от возбудителя дифтерии дифтероиды могут давать положительный тест на:
а) ферментацию глюкозы
д) ферментацию крахмала
162. В мазках возбудитель дифтерии имеет вид:
б) биполярных овоидных палочек
в) метахроматических полиморфных палочек (+)
д) изогнутых палочек правильной формы
163. К какой группе по типу дыхания принадлежит возбудитель дифтерии:
а) облигатный анаэроб
б) факультативный анаэроб (+)
г) облигатный аэроб
д) оксигенный фототроф
164. При отсутствии роста колоний на средах первичного посева при подозрении на дифтерию отрицательный ответ выдают через:
165. Кратность обследования больных с острыми воспалительными явлениями в носоглотке на дифтерию:
д) по желанию лечащего врача
166. Контингент лиц, обследуемых на дифтерию:
а) больные с воспалениями носоглотки
б) больные лакунарной ангиной с налётом на миндалинах
в) больные инфекционным мононуклеозом
г) больные некротической ангиной
д) всё перечисленное (+)
167. Для взятия материала на дифтерию используют:
б) тампоны, смоченные физ. раствором
в) тампоны, смоченные пептонной водой
д) все перечисленное
168. Забор материала на дифтерию производится:
в) через 10 мин после еды
г) через 30 мин после еды
д) независимо от приёма пищи
169. Забор материала при заболевании дифтерией производится:
а) из носовых ходов
в) с конъюнктивы
д) все перечисленное (+)
170. Средой для культивирования коринебактерий дифтерии является:
а) кровяной теллуритовый агар (+)
б) кровяной агар
в) среда Чистовича
д) среда Ресселя
171. Для возбудителя дифтерии характерно все, КРОМЕ:
а) грамположительные палочки
б) располагаются, в основном, под углом
в) содержат зерна волютина
г) не образуют споры
д) располагаются, в основном, частоколом (+)
173. Питательной средой для культивирования нейссерий является:
в) щелочной агар
г) сывороточный агар (+)
д) среда Клауберга II
174. Материалом для бактериологического исследования на менингит может служить:
а) мазок с миндалин
б) спинномозговая жидкость (+)
в) отделяемое из носа
г) соскоб с кожи
175. Препарат, который используется для подавления роста грамположительных кокков при культивировании менингококка:
б) теллурит калия
176. Забор материала на менингококк из зева производится:
а) через 30 мин после еды
в) через 10 мин после еды
д) независимо от приёма пищи
177. Дифференцированным методом окраски мазков для менингококка является:
а) окраска по Граму
б) окраска по Граму в модификации Калины (+)
в) окраска по Цилю-Нильсену
г) окраска по Бурри-Гинсу
д) окраска по Нейссеру
178. Забор носоглоточной слизи на менингококк следует производить:
в) с задней стенки глотки (+)
г) с полости рта
д) методом кашлевых пластинок
179. По морфологическим свойствам нейссерии являются:
а) грамположительными палочками
б) грамотрицательными диплококками (+)
180. Устойчивость менингококка к физическим и химическим факторам следующая:
а) устойчив к изменению температуры
б) устойчив к дезинфицирующим веществам
в) легко погибает при охлаждении и высыхании (+)
г) устойчив к высушиванию
д) устойчив к нагреванию и охлаждению
181. Оптимальный температурный диапазон роста менингококка составляет:
182. Универсальной средой для культивирования менингококков является:
а) питательный агар
б) “шоколадный” агар
в) питательный агар с 20% сыворотки (+)
183. Температурные условия транспортировки патологического материала при подозрении на менингококковую инфекцию:
б) комнатная температура
184. В состав среды Эндо входят следующие компоненты:
1. основной фуксин
3. тиосульфат натрия
4. сульфит натрия
7. соли желчных кислот
Выберите правильный набор компонентов:
185. Чашки Петри при сборе материала на коклюш методом “кашлевых” пластинок удерживаются от больного на расстоянии:
186. Какая питательная среда применяется для культивирования бордетелл:
а) кровяной агар
б) казеиново-угольный агар (+)
в) желточно-солевой агар
г) кровяной теллуритовый агар
д) молочно-солевой агар
187. Какое заболевание вызывает Bordetella pertussis :
18 8. Морфология возбудителя коклюша:
а) грамположительные палочки
б) грамотрицательные овоидные палочки (+)
в) грамотрицательные кокки
г) грамположительные кокки
189. Какое заболевание вызывает Bordetella parapertussis :
190. Как выглядят стафилококки в мазке:
а) грамотрицательные кокки в скоплениях
б) грамотрицательные кокки в цепочках
в) грамположительные кокки в скоплениях (+)
г) грамотрицательные диплококки
д) грамположительные кокки в цепочках
191. Какая из перечисленных сред является элективной для стафилококков:
а) Сывороточный агар
б) Желточно-солевой агар (+)
в) мясо-пептонный агар
г) кровяной агар
192. Для какого вида стафилококков характерно наличие плазмокоагулазы:
б ) s . epidermidis
в) s . saprophiticus
193. На какой среде определяют гемолитические свойства стафилококка:
а) кровяно-теллуритовом агаре
б) агаре с 5% крови (+)
в) шоколадном агаре
г) сывороточном агаре
д) желточно-солевом агаре
194. Морфология какого из перечисленных кокков представлена длинными цепочками:
195. Какой из перечисленных видов стафилококков чаще вызывает заболевание у людей:
б ) s . epidermidis
в) s . saproph y ticus
196. Отрицательный результат какого теста применяется для дифференциации стрептококков от стафилококка:
а) редукция метиленового синего в молоке
г) ферментация глюкозы
д) редукция нитратов
197. Укажите питательные среды, наиболее часто используемые для культивирования стафилококков:
а) кровяной агар, желточно-солевой агар (+)
б) сывороточный бульон, желчный бульон
в) кровяной агар, среда Эндо
г) сывороточный бульон, среда Клауберга
д) желточно-солевой агар, среда Блаурокка
198. Отличительными свойствами вида s . aureus являются положительные тесты:
а) маннит, лецитиназа, уреаза
б) маннит, уреаза, сахароза
в) лецитиназа, уреаза, сахароза
г) маннит, лецитиназа, плазмокоагулаза (+)
д) лецитиназа, плазмокоагулаза, сахароза
199. В микропрепарате из бульонной культуры клетки стрептококков имеют характерное расположение:
д) по четыре клетки
200. На каких плотных средах возможно получить рост стрептококков
б) среда Чистовича
г) среда Клауберга
201. Для выявления носительства стафилококка исследованию подлежат:
а) мокрота, кровь
б) слизь из носа, слизь из зева (+)
г) слизь из носа, ликвор
202. Для выделения пневмококка используют питательную среду:
а) желточно-солевой агар
б) кровяно-теллуритовый агар
д) молочно-солевой агар
203. Клетки пневмококков в микропрепарате представляют собой:
а) крупные кокки в триадах
б) мелкие кокки в цепочках
в) диплококки ланцетовидной формы (+)
г) диплококки бобовидной формы
д) мелкие кокки в гроздьевидных скоплениях
204. В микропрепарате клетки коринебактерий располагаются:
б) параллельно друг другу
в) под углом друг к другу (+)
20 5. Дифтерийный токсин блокирует:
а) дыхательный центр
б) синтез белка в клетке (+)
в) передачу нервных импульсов в синапсах
г) транспорт воды и ионов
20 6. Для коринебактерий дифтерии характерна:
а) продукция экзотоксина всеми штаммами
б) продукция экзотоксина некоторыми штаммами (+)
в) продукция эндотоксина всеми штаммами
г) продукция эндотоксина некоторыми штаммами
д) продукция экзотоксина и эндотоксина одновременно
207. Для возбудителя дифтерии не характерно морфологическое свойство:
б) однородная морфология (+)
в) взаиморасположение под углом друг к другу
г) биполярное окрашивание
208. Возбудитель дифтерии не обладает следующим свойством:
а) биполярное окрашивание
в) продукция цистиназы
г) продукция уреазы (+)
д) продукция экзотоксина
209. Для дифтерийных палочек характерно наличие:
г) зёрен волютина (+)
210. Для определения токсигенности возбудителя дифтерии используется:
Определение родовой, видовой и таловой принадлежности микроорганизмов на основании изучения морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных и антигенных свойств — наиболее ответственная часть микробиологического исследования.
Большое количество патогенов, принимающих участие в возникновении инфекционного процесса, обусловливает применение различных тестов по определению ферментативных свойств путем постановки большого количества биохимических реакций, что позволяет в комплексе с другими данными определить вид микроорганизма. Этот наиболее трудоемкий процесс выполняется в несколько этапов, требует большого количества дифференциально-диагностических сред, реактивов, посуды, что значительно удорожает стоимость анализа и удлиняет сроки его проведения. Результаты удается получить через 4…7 сут. Поэтому для идентификации микроорганизмов наиболее перспективны микрообъемные коммерческие тест-системы (МТС). Они избавляют практических бактериологов от трудоемких и дорогостоящих процедур и позволяют получать стандартные, сопоставимые, воспроизводимые данные, экономят реактивы, ускоряют выдачу результата анализа.
Коммерческие тест-системы для биохимической идентификации микроорганизмов различных групп представляют собой готовые к использованию полистироловые планшеты и панели с сухими дифференцирующими средами или субстратами, которые выпускаются разными производителями.
Коммерческие тест-системы на основе полистироловых планшетов. В Российской Федерации наибольшее распространение получили следующие тест-системы.
4. Системы на основе стандартных 96-луночных микротитровальных планшетов для идентификации энтеробактерий (ММТ-Е1 и ММТ-Е2) (Ставропольская государственная медицинская академия).
5. Наборы для ускоренной (в течение 5 ч) идентификации энтеробактерий РапидЭнтеро 200 и РапидЭнтеро 750 (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург).
Диагностические полоски и диски для биохимической идентификации микроорганизмов. Системы индикаторные бумажные (СИБ) представляют собой полоски или диски из хроматографической бумаги, пропитанные соответствующим субстратом и индикатором и покрытые для стабилизации водным раствором поливинилового спирта.
1. Диски с бацитрацином (10 ЕД). Применяют для селективной изоляции Haemophilus spp. при первичном культивировании. Тест основан на устойчивости Haemophilus spp. к высоким концентрациям бацитрацина по сравнению с сопутствующей флорой и саттелитного роста микроорганизмов этого рода в зоне диффузии экзогенных факторов роста из культуры S. aureus.
2. Диски с бацитрацином S. Предназначены для предварительной индикации β-гемолитических стрептококков группы А (S. pyogenes). Тест основан на высокой чувствительности S. pyogenes к незначительным концентрациям бацитрацина (0,04 ЕД), обеспечивающей образование зон задержки роста вокруг диска. Другие β-гемолитические стрептококки резистентны к таким дозам или образуют незначительные зоны ингибиции роста.
3. Диски с оптохином. Предназначены для рутинной первичной индикации S. pneumoniae и дифференциации их от других зеленящих стрептококков. Принцип теста основан на избирательной чувствительности пневмококков к оптохину и резистентности к нему других зеленящих стрептококков.
Общие правила работы с МТС. Методика проведения микробиологических исследований с использованием МТС должна полностью соответствовать прилагаемой инструкции. Общая схема работы с тест-системами состоит из следующих этапов.
1. Выделение культуры. Для работы с МТС используют только чистые культуры. При их выделении особое внимание следует уделять качеству питательных сред. От этого зависит видовой состав изолированных микроорганизмов, их количество в исследуемом материале и успех идентификации. По результатам первичного посева и микроскопии проводят дифференциацию культур на грамположительные и грамотрицательные кокки и палочки.
2. Приготовление бактериальной суспензии. Суспензию готовят в рекомендованной суспензионной среде из чистой 18…24-часовой культуры определенной степени мутности согласно инструкции. Использование слишком густой или жидкой суспензии может привести к ложным результатам. Параллельно делают контрольный высев взвеси культуры на кровяной агар для проверки ее чистоты, ростовых свойств и (или) для постановки дополнительных тестов.
3. Инокуляция. Суспензию тщательно встряхивают; необходимый объем вносят в каждую лунку соответствующего ряда. После этого в определенные лунки для создания анаэробных условий добавляют по 2 капли стерильного вазелинового или парафинового масла.
4. Инкубация. Планшеты в полиэтиленовых пакетах или закрытые крышками инкубируют при 30…37 °С в течение 4…48 ч.
5. Оценка результатов. По окончании выращивания проверяют чистоту культуры по контрольному посеву. При отсутствии роста увеличивают время инкубации. Затем добавляют в определенные лунки необходимые реактивы, позволяющие визуализировать или усилить цветные реакции. Учет проводят визуально с помощью специальных таблиц, цветовых шкал и (или) цветных реакций контрольных штаммов и заносят их в бланки.
6. Идентификация. Проводят с помощью таблиц биохимической активности, индексов профилей, книг-кодов или компьютерных программ.
При окончательной идентификации учитывают дополнительную информацию (микроскопия, характер колоний, наличие гемолиза, пигментообразование, подвижность и т. д.).
При работе с тест-системами следует придерживаться следующих рекомендаций.
1. Строго соблюдать правила работы с инфицированным материалом.
2. После употребления МТС необходимо обезвреживать автоклавированием при (120+2) °С в течение 1 ч.
3. Строго соблюдать условия и сроки хранения в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к тест-системам.
4. Если культуру не удается идентифицировать, следует проверить ее чистоту и повторить исследование.
5. При отсутствии роста на контрольной чашке необходимо увеличить время инкубации.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.
Целью первичной идентификации является установление принадлежности выделенной культуры к семейству Streptococcaceae и роду Streptococcus. Для установления принадлежности культур к семейству Streptococcaceae используют тест на каталазу.
В отличие от родственного семейства микрококков представители семейства стрептококков не имеют фермента каталазы, и не способны расщеплять перекись водорода с образованием воды и газообразного кислорода.
Установление принадлежности культур к роду Streptococcus
На этом этапе исследования применяют методы, позволяющие идентифицировать стрептококки. К их числу относятся бактериоскопический, культуральный и биохимический методы.
Бактериоскопический метод
В мазках, окрашенных по Граму, стрептококки располагаются цепочками, или по четыре. Размеры микробных клеток стрептококков 0,6-1, мкм. Грамположительные кокки.
Культуральный метод
По виду гемолиза на кровяном агаре стрептококки делятся на 3 группы: гемолитические стрептококки, обусловливающие лизис эритроцитов с образованием вокруг колоний прозрачной зоны. При этом колонии могут быть мукоидные, шероховатые, гладкие. Зеленящие стрептококки образующие на кровяном агаре альфа-реакцию в виде полупрозрачной, зеленоватого оттенка зоны, обусловленной превращением гемоглобина в мет-гемоглобин. Негемолитические стрептококки, не реагирующие с эритроцитами и в процессе своего роста не вызывающие изменений кровяного агара.
Видовая идентификация стрептококков
Культуры гемолитических и зеленящих стрептококков, клетки которых при микроскопическом исследовании представляют собой грамположительные полиморфные кокки, располагающиеся парами, короткими цепочками или небольшими скоплениями необходимо дифференцировать с энтерококками.
Для этого суточную бульонную культуру высевают на желчно-солевой агар и в молоко с 0,1% метиленового синего. На ЖЩА растут только энтерококки в виде круглых, блестящих колоний с ровным краем, синеватого цвета. В пробирках с молоком энтерококк редуцирует метиленовый синий, вследствие чего среда обесцвечивается и из голубой становится кремового цвета через 16-20 часов инкубации в термостате.
Способность микробных клеток к росту на ЖЩА. и редуцированию 0,1% метиленового синего в молоке указывает на принадлежность исследуемой культуры к группе энтерококков.
Дифференциация энтерококков внутри группы
Внутри группы энтерококки делятся по ферментативным, редуцирующим и гемолитическим свойствам на ряд видов и подвидов. Дифференциация культур энтерококка внутри групп ведется по следующей схеме:
| Виды и подвиды | Резистен-тность к теллуриту каллия | Энтерококковая дифференциально-диагностическая среда | Подви-жность в 0,2% агаре | ||
| редукция ТТХ | гемолиз | протеолиз | |||
| 1. S. faecalis 2. S. faecalis subsp. zymogenes 3. S. faecalis liquefaciens 4. S. faecium 5. Подвижные энтерококки | + + + – + | + + + – + | – + – ± ± | – ± + – – | – – – – + |
Вопросы для обсуждения
1. Морфология, тинкториальные и культуральные cвойства стрептококков.
2. Токсины и ферменты стрептококков.
3. Классификация стрептококков по гемолитическому признаку и антигенной структуре.
4. Заболевания, вызываемые патогенными стрептококками.
5. Лабораторная диагностика.
6. Препараты, используемые для лечения и профилактики стрептококковых инфекций.
Самостоятельная работа студентов
1. Познакомится со схемой исследования при кокковых заболеваниях.
2. Микробиологический диагноз стрептококковых заболеваний:
а. изучить демонстрационный препарат из чистой культуры стрептококка; зарисовать;
б. изучить рост стрептококка на кровяном МПА и на МПБ;
в. сделать посев гноя на чашку с кровяным МПА;
г. изучить демонстрационный посев гноя на кровяном агаре;
д. приготовить мазок из гноя, окрасить его по Граму, зарисовать;
е. определить чувствительность к антибиотикам по демонстрационным посевам.
Схема лабораторного исследования при ангине и скарлатине
Материал для исследования: мазок из зева.
| День исследования | Ход исследования | Результат |
| 1 день 2 день | 1. Бактериоскопия мазка из зева, окраска по Граму 2. Посев мазка из зева на кровяной агар 1. Микроскопия мазка из колонии | В поле зрения грамположительные цепочки стрептококков Нa агаре мелкие точечные колонии в виде капелек росы с зоной гемолиза Цепочки стрептококка |
Заключение: В мазке обнаружен Streptococcus pyogenes.
Пневмококки
| Раздел | Вопросы для изучения |
| Биология возбудителя | I. Таксономия Пневмококки относятся к семейству Streptococcaceae, роду Streptococcus |
| 2. Основные биологические свойства: Морфологические – кокки, напоминающие пламя свечи: один конец клетки заострен, другой уплощен, располагаются парами, иногда в виде коротких цепочек. Спор не образуют. В организме человека и животных, а также на средах, содержащих кровь или сыворотку образуют капсулу. Тинкториальные – грамположительные кокки, но в молодых и старых культурах нередко грамотрицательны. Культуральные: факультативные анаэробы, температурный оптимум – 37°С., оптимальная рН = 7,2-7,6. Для культивирования используют кровяной агар, где колонии мелкие, круглые, окруженные зоной гемолиза (альфа-гемолиз), рост на сахарном бульоне не сопровождается помутнением и выпадением небольшого осадка. Биохимические свойства. Ферментация углеводов: глюкозы, сахарозы с образованием кислоты, без газа. Факторы патогенности: 1. Амилаза – активизирующуюся под влияющем желчных кислот, разрывающая связь между аланином и муравьиновой кислотой пептидогликана. 2. Капсула – главный фактор патогенности бескапсульные пневмококки утрачивают вирулентность. Антигенные свойства: кроме соматического 0-антигена, пневмококки имеют капсульный полисахаридный антиген, по которого разделяют на 83 сероварианта, 56 из них разбиты на 19 групп, 27 представлены самостоятельно. | |
| Эпидемио-логия | Источником пневмококковой инфекции является больной человек или реконвалесцент. Заражение происходит воздушно-капельным или воздушно-пылевым путем. |
| Патогенез | Пневмококки являются основным возбудителем острых и хронических воспалительных заболеваний легких. Кроме того, они вызывают ползучую язву роговицы, отиты, эндокардит, перитониты, менингиты, септицемии и другие гнойно-воспалительные процессы. |
| Постинфек-ционный иммунитет | Типоспецифический, обусловлен появлением антител, против типового капсульного полисахарида. |
Для специфической профилактики пневмококковых пневмоний у пожилых и ослабленных людей, а также лиц с иммунодепрессией можно использовать химическую пневмококковую вакцину, содержащую типоспецифические полисахариды нескольких типов пневмококков. В последнее время для специфической профилактики различных, в том числе и стрептококковой этиологии, поражений верхних дыхательных путей очень часто рекомендуется вакцина IR S19.
Для лабораторного анализа используются микроскопический, бактериологический и серологический методы диагностики.
Назначение, особенности и диагностическая ценность микроскопического исследования такие же, как и при стафилококковых инфекциях.
1. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Для выделения чистой культуры стрептококков важное значение имеет создание оптимальной питательной среды, так как стрептококки предъявляют к ней особые требования. Им необходимо значительное количество углеводов и нативного белка. Поэтому наряду с общепринятыми сахарным МПБ, кровяным МПА, молочно-солевым МПА и МПБ (см. рецепты выше) при стрептококковых инфекциях применяются асцитические и сывороточные среды.
АСЦИТИЧЕСКИЙ МПБ И МПА готовятся с добавлением отчетной жидкости, получаемой стерильно из брюшной полости больных терапевтического и хирургического профиля. Жидкость прогревают 3 дня при +56-58 °C по 1 часу, стерилизуют фильтрованием через фильтр Зейтца или добавляют 40% глицерина и хранят на холоду. Для приготовления асцит-бульона и асцит-агара 1 часть жидкости смешивают с 2-3 частями МПБ (или Хоттингеровского бульона) или растопленного и остуженного МПА.
СЫВОРОТОЧНЫЙ МПБ готовят из простого свежего мясопептонного бульона с pH 7,6, к 1 части которого добавляют 2 части свежей сыворотки человека или лошади. Сыворотку перед прибавлением к среде инактивируют при + 56 °C в течение 30 минут.
При осложнении капельных стрептококковых инфекций сепсисом необходим и посев крови. Для бактериологического исследования крови Э. Г. Кассирская рекомендует комплексное использование трех видов питательных субстратов, засеваемых из расчета 1 часть патологического материала на 10-15 частей среды. В качестве последней используются 0,2% полужидкий агар с 10% асцитической жидкости, бульон Левинталя с кровью и печеночная среда Китт-Тароцци.
ДЛЯ БУЛЬОНА ЛЕВИНТАЛЯ отдельно готовят следующие компоненты: № 1 - к 100 мл мясного фарша добавляют 300 мл дистиллированной воды и 10 мл нормального раствора соды; № 2 - 0,5 г панкреатина растворяют в 20-30 мл воды с 2 мл 1 N раствора соды и 10 мл хлороформа; № 3 - буферный раствор фосфорно-кислого натрия в дистиллированной воде (разведение 8:1000). С помощью раствора НСl устанавливают pH, равное 5,6-6.
В первый день смесь № 1 инкубируют в термостате при + 37 °C 1-2 часа, добавляют к ней раствор № 2, перемешивают и при тех же условиях выдерживают еще 24 часа. Сосуд со средой периодически встряхивают. После этого берут равные количества мясной кашицы и буферного раствора № 3. Кипятят, фильтруют. Устанавливают рН-7,2-7,4. Вновь кипятят. Разливают по пробиркам и стерилизуют 2 дня подряд по 30 минут текучим паром.
СРЕДУ КИТТ-ТАРОЦЦИ готовят из говяжьей печени или мяса. Последние нарезают кусочками, взвешивают, заливают тройным количеством МПБ (рН-7,4-7,6) кипятят 30 минут. Затем бульон фильтруют, кусочки печени отмывают водопроводной водой. Далее пробирки с 3-4 кусочками печени, залитыми 7-8 мл фильтрата и слоем вазелинового масла, стерилизуют под давлением 1 атм. в течение 30 минут.
Высеваемость стрептококков возрастет при использовании ПОЛУЖИДКОГО АГАРА ГАРОЦЦИ: в бульон Мартена (рН-7,6-7,8) добавляют 0,3-0,5% глюкозы и 0,1-0,15% агар-агара. В стерильные пробирки помещают кусочки печени или вареного мяса, добавляют по 9 мл среды и стерилизуют при температуре +120 °C в течение 30 минут.
Зеленящий стрептококк, выделяемый при септическом эндоркардите, развивается очень медленно. В связи с этим посевы крови выдерживают 2-3 суток в термостате.
В некоторых случаях выделить культуру стрептококка при широкой аэрации не удается. Более успешным оказывается применение анаэробиоза. Для создания последнего можно использовать три простейших способа.
I. ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ ЗАСЕВАЮТ В ПРОБИРКУ с 0.25% глюкозным бульоном и быстро всасывают его в стерильные пастеровские пипетки, концы которых тотчас же запаивают над пламенем горелки. Пипетки устанавливают вертикально в термостате. Через 24 часа нижние концы пипеток отламывают (стрептококки растут только внизу), первые капли используют для микроскопии и дальнейшего выделения чистой культуры возбудителя.
2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПОСЕВОВ В АТМОСФЕРЕ, НАСЫЩЕННОЙ УГЛЕКИСЛЫМ ГАЗОМ. Необходимую концентрацию СО2 получают при добавлении в загруженный пробирками эксикатор вначале 1г двууглекислой соды на 1 литр объема, а затем из того же расчета 8-9 мл 10% Н2SO4 или HCl.
3. ДОВОЛЬНО ПРОСТ и менее эффективен следующий прием: на дно неплотно закрытого эксикатора ставят зажженную свечку. Она горит 1-3 минуты и гаснет. По окончании первой или второй процедуры эксикаторы покрывают крышками, края которых смазаны вазелином и помещают в термостат.
Выделение чистой культуры
Биохимическая активность стрептококков непостоянна и ее выяснение не имеет диагностического значения. Изучение стрептококков в этом плане используется лишь для дифференциации с энтерококками (табл. 1.).
| Таблица 1. Дифференциация стрептококков от энтерококков | ||
| Критерии Шермена для различия стрептококков группы А (истинные) oт группы Д (энтрококки) | ||
| Тесты | Группы | |
| Группа А (стрептококки) | Группа Д (энтерококки) | |
| Длина цепочек | длинные (5-12 звена) | короткие (1-2 звеньев) |
| Рост на солевом МПА с 6,5% | + | - |
| Рост на желчно-кровяном МПА Д. Э. Беленького к П. Н. Поповой | - | + |
| Рост на молоке с метиленовой синькой | - | + (редукция) |
| Рост на МПБ с pH - 9,6 (в присутствии 0,05 М р-ра Na2CO3) | - | + |
| Чувствительность к пенициллину | + | - |
| Термоустойчивость при +60 °C в течение 30 минут. | - | + |
Состав дифференциально-диагностических сред, применяемых для этой цели следующий.
- ЖЕЛЧНЫЙ И ЖЕЛЧНО-КРОВЯНОЙ МПА Д. 3. Беленького и Н. Н. Поповой готовятся из расплавленного и отфильтрованного 3% МПА с любой бульонной основой. К 60 мл этого МПА добавляют 40 мл нативной профильтрованной желчи, разливают по флаконам и стерилизуют при давлении в 1 атм. 30 минут. Для приготовления агара с кровью к этому желчному МПА добавляют 5% дефибринированной крови.
- МОЛОКО С МЕТИЛЕНОВЫМ СИНИМ приготовляется из обезжиренного стерильного молока, к 100 мл которого добавляют 2 мл 10% водного раствора метиленового синего.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУЛЕНТНОСТИ СТРЕПТОКОККОВ
Для доказательства патогенности стрептококков важное значение имеют гиалуронидазная активность, выявление стрептокиназы или фибринокиназы, плазмокоагулазы, лейкотоксическое действие стрептококка, наличие гемолизина. Определение этих показателей осуществляется по методикам, описанным выше, но выявление гемолизирующей активности стрептококка лучше идет на средах с человеческой кровью.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИДИНА. Берут цитратную кровь человека или какого-либо животного, центрифугируют, верхний желтый слой лейкоцитов отсасывают пипеткой, переносят в другую пробирку и готовят 2-5% лейкоцитарную взвесь. Последнюю разливают по 1-1,5 мл в узкие пробирки. Сюда же вносят 1 петлю 1-2 млрд. суточной культуры стрептококка и на 1 час помещают в термостат при +37 °C. После инкубации, из лейкоцитарно-микробной массы делают мазки (по типу мазков из цельной крови), высушивают, фиксируют 15 мин. в смеси Никифорова, окрашивают 45-60 минут по Романовскому-Гимза, микроскопируют. Массовое разрушение лейкоцитов свидетельствует о наличии лейкоцидина.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ выделенных культур к лекарственным веществам производится общепринятыми способами.
СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ТИПИЗАЦИЯ обнаруженных стрептококков после их изоляции требуется только для особых эпидемиологических целей и применяется редко.
II. СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ СТЕПТОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ
Ферменты вирулентности стрептококков (гиалуронидаза, фибринокиназа, плазмокоагулаза) и их токсины (например, гемотоксин) являются мощными антигенами, в ответ на действие которых вырабатываются соответствующие антитела: антигиалуронидаза, антистрептокиназа, антистрептолизин и т. д. По обнаружению этих антител можно диагностировать заболевание и фазу развития инфекционного процесса.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИСТРЕПТОЛИЗИНА (АНТИГЕМОЛИЗИНА)
Стрептолизин представляет собой разновидность гемотоксина. Его присутствие проверяют на эритроцитариой массе. В ответ на действие этого антигена в организме формируются антитела, способные нейтрализовать его гемолизирующую активность. При выявлении антистрептолизина необходимы: сыворотка больного с антистрептолизинами (антителами); стрептолизин (очищенный), стандартный, лиофилизированный; 5% взвесь кроличьих, бараньих или человеческих эритроцитов; фосфатный буфер для разведения сывороток и приготовления взвеси эритроцитов: в 1 л дистиллированной воды растворяют 7,6 NaCl, 3,17 г КН2Р04 и 1,81 г Na2HPO4, добавляют по каплям концентрированную NaОН и доводят pH до 6.5-6,7. Буферный раствор сохраняется в рефрижераторе при -4 °C 2-3 недели.
Определение антистрептолизина складывается из двyx этапов: первый - установление титра и рабочей дозы стандартного стрептолизина, второй - выявление и количественное определение антистрептолизина. Схемы их выполнения приводятся ниже.
| Схема определения рабочей дозы стандартного стрептолизина | |||||||
| Компоненты в мл | Пробирки | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |
| (контроль эритроцитов) | |||||||
| Стрептолизин | 0,6 | 0,7 | 0,8 | 0,9 | 1,0 | 1,1 | - |
| Буферный раствор | 0,9 | 0,8 | 0,7 | 0,6 | 0,5 | 0,4 | 1,5 |
| Взвесь эритроцитов | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| В термостат на 15 минут при +37 °C, встряхнуть, снова в термостат на 30 минут. | |||||||
| Результат | - | - | - | - | гемолиз | гемолиз | - |
Титром и рабочей дозой стрептолизина считается его минимальное количество, давшее четкий гемолиз эритроцитов. В данном примере они равны 1,0 мл.
В последнее время выпускается стандартный лиофилизированный стретолизин, на флаконе с которым и в приложенной инструкции указан способ разведения препарата для получения рабочей дозы. Такой стрептолизин обеспечивает хорошую повторяемость результатов.
| Схема постановки реакции для определения антистрептолизина | ||||||
| Компоненты в мл | Пробирки | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | Контроль | ||
| 5 | 6 | |||||
| стрептолизина | эритроцитов | |||||
| Буферный раствор | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Сыворотка больного | 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | - |
| Стрептолизин в раб. дозе. | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | - |
| Встряхнуть, в термостат при + 37 °C на 15 минут. | ||||||
| Взвесь эритроцитов | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| В термостат на 45 минут при +37 °C с периодическими встряхиваниями. | ||||||
| Результат | - | - | гемолиз | гемолиз | гемолиз | - |
Антистрептолизин в данной пробе сыворотки обследуемого больного обнаружен в титре 1:200.
Принцип выявления основан на регистрации разрушительного действия фермента гиалуронидазы на гиалуроновый субстрат. Антитела сыворотки больного, направленные против этого фермента, нейтрализуют его и гиалуроновая кислота остается неизмененной.
Необходимые реактивы: сыворотка больного с антителами (антигиалуронидазой); экстракт гиалуроновой кислоты с известной рабочей дозой (способ описан выше); гиалуронидаза (химически чистый препарат); 15% уксусная кислота - индикатор; физиологический раствор.
Определение антигиалуронидазы состоит из трех этапов: первый - определение титра и рабочей дозы гиалуроновой кислоты, второй - гиалуронидазы, третий - выявление наличия и титра антигиалуронидазы.
Титрование гиалуронового субстрата описано выше. Титр и рабочая доза стандартной гиалуронидазы соответствует тому минимальному ее количеству, которое способно разрушить гиалуроновую кислоту, взятую в рабочей дозе.
После выяснения титра гиалуронидазы проводят определение титра антигиалуронидазы.
| Схема постановки реакции определения титра сывороточной антигиалуронидазы | ||||||||
| Ингредиенты в мл | Пробирки | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | Контроль | ||
| 7 | 8 | |||||||
| гиалуронидаза | гиалуроновая кислота | |||||||
| Физ. раствор | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,7 |
| Сыворотка больного в разведении 1:25 | 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1600 | ||
| Гиалуронидаза в рабочей дозе | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | - |
| В термостат при + 37°C на 30 минут. | ||||||||
| Гиалуроновая кислота в рабочей дозе | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 |
| В термостат при +37 °C на 30 минут. 15% уксусная кислота по 2-3 капли в пробирку. | ||||||||
| Результаты | сгусток | сгусток | сгусток | - | - | - | - | сгусток |
В данном примере титр антигиалуронидазы в сыворотке крови больного 1:200. Это количество антител при указанном разведении сыворотки еще обладает нейтрализующим действием в отношении гиалуронидазы и предотвращает разрушение гиалуроновой кислоты. Ее целостность регистрируется по образованию сгустка после добавления индикатора - 15% раствора уксусной кислоты.
Источник: Мотавкина Н.С., Пьянова Р.Е. Микробиологическая диагностика некоторых капельных инфекций и токсоплазмоза. Методическая разработка для студентов. ВГМУ, 1973
Читайте также: