Лимфокин-активированные киллеры для иммунизации. Влияние лимфокин-активированных киллеров на врожденный иммунитет

Добавил пользователь Morpheus
Обновлено: 21.12.2024

IL-2 или его экзогенные аналоги стимулируют пролиферацию естественных киллеров и усиливают их цитолитические функции, приводя к образованию так называемых лимфокин-активированных киллеров (ЛАК). По своей природе ЛАК являются цитотоксическими лимфоцитами, которые способны уничтожать клетки, зараженные вирусами или внутриклеточными бактериями и опухолевые клетки. В настоящее время возможности ЛАК-терапии исследуются при различных формах онкологических заболеваний. При инфекционных заболеваниях метод адоптивного переноса ЛАК практически не изучался.
Этот вопрос был нами изучен при заражении мышей линии СВА культурой штамма К. pneumoniae K2.

Лимфокин-активированные киллеры получали из МЛ селезенки мышей при культивировании в течение двух суток в среде RPMI-1640, содержащей 1000 МЕ/мл IL-2, затем клетки отмывали и использовали в эксперименте.
Морфогистохимические исследования выявили, что ЛАК представляют собой крупные клетки лимфоидного ряда типа иммунобластов и пролимфоцитов с базофильной цитоплазмой. В мазках часто обнаруживаются клетки в состоянии митотического деления. При фазово-контрастной микроскопии ЛАК представляют пролиферирующие конгломераты клеток.

Таким образом, при воздействии IL-2 на МЛ селезенок мышей происходила генерация ЛАК, характеризующаяся пролиферацией и активацией клеток лимфоидного ряда. Повышенная экспрессия активаци-онных антигенов, формирующая особенности иммунофенотипа ЛАК, также свидетельствовала о процессах активации лимфоцитов. Кроме того, нами было выявлено, что ЛАК обладали достоверно более высокой киллерной активностью по сравнению с интактными МЛ по отношению к NK-чувствительной линии клеток мышиной лимфомы YAC-1.

Согласно сложившемуся мнению, NK — основная субпопуляция лимфоцитов, экспрессирующая р75р цепь рецептора IL-2 и селективно активирующаяся и пролиферирующая под его воздействием с образованием ЛАК, способных эффективно лизировать опухолевые клетки-мишени. Однако наряду с изложенными представлениями, имеются данные о существовании в популяции ЛАК NKT-клеток, экспрессирующих не только маркеры NK (CD16, CD56), но и Т-клеточные дифференцировочные антигены (CD3, CD4, CD8).

Эти данные соответствуют высказанным ранее предположениям о NK-клетках, которые рассматривались не только как самостоятельная субпопуляция, но и как этап дифференцировки зрелых лимфоцитов. Из зрелых лимфоцитов при инкубации с IL-2 могут быть получены так называемые NK-ЛАК-клетки.

В наших экспериментах после культивирования МЛ селезенки мышей с IL-2, были получены ЛАК, экспрессирующие на своей мембране активационные молекулы (CD25) и молекулы главного комплекса гисто-совместимости МНС I, МНС II. В то же время, в популяции ЛАК, кроме NK, присутствовали клетки, экспрессирующие и Т-клеточные дифференцировочные антигены (CD3, CD4, CD8).

Последние в таких же количествах были выявлены в исходной популяции МЛ. Использованная технология получения лимфокин-активированных киллеров обеспечила существенное увеличение NK-клеток с 1,5 до 20,3%, а также клеток, содержащих маркер CD25 и молекул антигенного представления МНС I и II.

Полученную суспензию лимфокин-активированных киллеров вводили мышам внутрибрюшинно по 2,5 х 106 клеток в 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Затем, внутрибрюшинно вводили по 250 клеток в объеме 0,5 мл К pneumoniae K2. В качестве контроля были использованы МЛ, культивировавшиеся в присутствии ФГА (10 мкг/мл).

Лимфокин-активированные киллеры у инфицированных К. pneumoniae (100 LD50) мышей обеспечивали 100 % выживание животных при практически одновременном внутрибрюшинном введении киллерных и микробных клеток. МЛ, активированные ФГА, защищали в 50 % случаев при 100% гибели интактных мышей, получивших ту же заражающую дозу.
Наши исследования подтверждают целесообразность исследований по использованию ЛАК для адоптивной иммунотерапии, поскольку введенные мышам внутрибрюшинно ЛАК предотвращали развитие заболевания К.pneumoniae K2 у животных.

При определении цитокинов в культуральной среде ЛАК выявлялось повышенное содержание IL-1 через 24 ч и 72 ч инкубации (254+12,3 пг/мл и 213±11,5 пг/мл, соответственно), через 72 ч — IL-6 (224±21,2 пг/мл) и IL-10 (150±10,5 пг/мл) по сравнению с культурой МЛ (содержание этих цитокинов в контроле не превышало 25-80 пг/мл), инкубированных без IL-2. Интересно отметить, что в культуральной среде ЛАК не увеличивалось содержание регуляторного IL-12, что мы в значительных количествах определяли в культуральной среде ДК.

Цитотоксическую активность лимфокин-активированных киллеров, полученных из селезенки мышей (СВА), определяли на NK-зависимой линии клеток мышиной лимфомы YAC-1 в тесте восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест). Опухолевые клетки (1 х 104 в 1 мл) инкубировали в культуральной среде с ЛАК в разных соотношениях и по оптической плотности при длине волны 540 нм, рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).
Оценка киллерной активности эффекторных клеток показала, что ЛАК обладают достоверно большей NK-активностью по сравнению с МЛ интактных мышей.

При соотношении 1:5 ЛАК и опухолевых клеток мышиной лимфомы YAC-1 цитотоксическая активность киллеров увеличивалась в 6 раз по сравнению с МЛ. В данных условиях МЛ лизировали 15,5 % клеток линии К562, в то время как в аналогичных условиях ЛАК вызывали гибель 92,2 % опухолевых клеток (р < 0,01). В меньших соотношениях мишени/эффекторы (1:2 и 1:1) эти различия не столь значимы, хотя цитотоксическая активность ЛАК превышает таковую у МЛ интактных мышей.

-