Протеомика. Хроматография белков

Добавил пользователь Алексей Ф.
Обновлено: 21.12.2024

Протеомика занимается исследованием белков, экспрессируемых геномом. Геномику и протеомику следует рассматривать как комплементарные компоненты генетического профиля, начиная с ДНК и заканчивая модифицированными белками.

Белки служат конечными продуктами генома человека и в итоге определяют его биологию. Белки ответственны за биологическую форму и функцию. Ученые подсчитали, что количество белков у человека (200 тыс.) в 6-7 раз больше, чем генов, что обусловлено сплайсингом, изменениями структурных кассет среди генов в процессе транскрипции и посттрансляционными модификациями белков. Задача протеомики состоит в расшифровке сложных взаимодействий всех белков, экспрессирован-ных в ткани или организме в норме и при патологии.
В настоящее время протеомика находится в стадии становления.

Методы анализа протеома пока только разрабатывают и проверяют, но уже известно 5 основных элементов любого протеомного анализа: забор образца, экстракция белков, разделение белков, определение аминокислотной последовательности белка (секвенирование) и сравнение полученной последовательности с референсными базами данных по идентификации белков. Забор образца — обычная процедура получения биологического материала (биоптата ткани или плазмы крови от конкретного человека при наличии письменного информированного согласия).

Для экстракции белков в целях освобождения от ДНК, РНК, углеводов и липи-дов обычно используют химические методы, в основном метанол. Далее для идентификации экстрагированные белки разделяют; этот этап традиционно выполняют с помощью двухмерного электрофореза в геле. В одном направлении белки разделяются в зависимости от их массы, а в другом — тто изоэлектрической точке или заряду. Поскольку в большинстве пятен на пластинке с гелем после двухмерного электрофореза присутствует множество белков, исследователи применяют и другие методы разделения и идентификации белков, включая жидкостную хроматографию.

При жидкостной хроматографии для разделения белков в зависимости от их биохимических свойств, в т.ч. по молекулярной массе, изоэлектрической точке или гидрофобности, используют твердофазную или жидкофазную среду. Разделение с помощью жидкостной хроматографии можно проводить последовательно в несколько серий, что улучшает разрешающую способность метода.

Для повышения чувствительности и специфичности разделения белков используют другие виды хроматографии, например аффинную хроматографию, при которой колонка заполнена носителем, содержащим антитела, специфичные к определенным функциональным участкам белков; такой подход позволяет достичь желаемой степени разделения белков. После разделения белки идентифицируют; обычно для этой цели применяют некоторые виды масс-спектрометрии.

При масс-спектрометрии белки или пептиды превращаются В заряженные частицы, которые можно разделить в зависимости от характерного для них соотношения массы и заряда. Применяют несколько типов масс-спектрометрической ионизации: электроспрей, или ионизация распылением в электрическом иоле; матричная активированная лазерная десорбция/ионизация MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization). Пептидные последовательности, идентифицированные с помощью указанных методов, сравнивают с известными базами данных для однозначной идентификации белка.

После идентификации белка в протеоме определяют его относительный уровень и сравнивают с таковым в норме и при патологии. Наконец, тщательный анализ протеома должен включать оценку функциональной активности данного белка либо в культуре клеток, либо на животных моделях. Такой подход аналогичен анализу генома, где критичным является определение значимости гена или его мутации путем оценки его функциональной активности.

Анализ протеома в настоящее время имеет ряд ограничений: чувствительность, специфичность и пропускная способность методов. Однако эти направления и применяемые методы быстро развиваются. Возможности протеомики в изучении ССЗ представляются весьма многообещающими для понимания функционирования сердечно-сосудистой системы во всей ее сложности.

-