Что такое генотипирование вич

Термин "генотип" был предложен Иогансеном в 1909 году. В современной генетике "генотип" рассматривают как единую систему генетических элементов, взаимодействующих на различных уровнях (например, между аллелями одного гена или различных генов). Генотип контролирует развитие, строение и жизнедеятельность организма, т.е. совокупность всех признаков организма -его фенотип. Особи с разными генотипами могут иметь одинаковый фенотип, поэтому для определения генотипа организма необходимо проводить его генетический анализ (генотипирование). Особи с одинаковым генотипом в различных условиях могут отличаться друг от друга по характеру проявления признаков, т.е. по фенотипу. В связи с этим в генетике используют понятие о норме реакции - возможном размахе фенотипической изменчивости без изменения генотипа. При изменении генотипа говорят о генотипической изменчивости, являющейся одним из условий эволюционного процесса.

Вирусы, как и другие организмы, обладают свойствами, передающимися по наследству, т.е. генетическими признаками, проявление которых в конкретных условиях характеризует их фенотип. В фенотипе вируса никогда не реализуются полностью все генетические возможности. Фенотип каждого штамма-частный случай проявления функции генома в конкретных условиях внешней среды. Популяции штаммов всех известных вирусов генетически гетерогенны, различия между клонами внутри популяции могут быть весьма значительными.

Все генетические признаки условно можно разбить на групповые, видовые, внутривидовые и штаммовыс. К групповым и видовым признакам относят тип нуклеиновой кислоты, размеры и морфологию вирусов, тип капсида, количество капсомеров, антигенную специфичность, устойчивость, наличие ферментов, способность вызывать агглютинацию, патогенность для адекватных лабораторных моделей, характер цитопатического действия на соответствующей культуре клеток. Для проведения генетических исследований наибольшее значение имеют внутривидовые (внутритиповые) признаки, позволяющие дифференцировать варианты (мутанты, рекомбинанты) между собой.

К числу признаков, позволяющих дифференцировать штаммы, относится патогенность для восприимчивого хозяина. Патогенность - это потенциальная способность вируса вызывать инфекционный процесс. Степень выраженности этого свойства у разных штаммов характеризует вирулентность вируса. Вирулентность относится к полигенным признакам и представляет собой функцию ряда генетических признаков вируса.

Проявление некоторых генетических признаков у вирусов связано с особенностями структуры внутренних и наружных белков. При изучении генетических признаков вируса необходимо учитывать также влияние факторов внешней среды. Взаимосвязь генетических признаков представляет большой теоретический и практический интерес, т.к. в процессе изменчивости вируса нередко наблюдается одновременное изменение не одного, а нескольких признаков. Предполагают, что в основе коррелятивной изменчивости лежат различные причины: полигенность изучаемого признака, плейотропность действия гена, селекция мутантов.

Исследование и идентификация нуклеотидных последовательностей ретровирусов и, в частности, ВИЧ-1 показало его чрезвычайную изменчивость. На основании анализа нуклеотидных последовательностей генов Env и Gag были выделены 10 генетических субтипов ВИЧ-1 (от А до J), относящихся к группе М. Кроме этой группы были идентифицированы высокодивергентные штаммы - группа О. Различия в геноме группы О и группы М составляют 35%.

В настоящее время доказана высокая частота рекомбинации у вируса иммунодефицита человека, что, вероятно, связано с процессом смены матрицы при обратной транскрипции. Обязательным условием рекомбинации, по-видимому, является попадание в одну вирусную частицу 2-х копий РНК, принадлежащих к вирусам разных субтипов. Вероятно, это случается при циркуляции в популяции двух разных субтипов. В России около четверти всех пациентов предположительно заражены рекомбинантными вирусами, что может играть важную роль втечение заболевания, т.к. в организме инфицированного происходит селекция рекомбинантных вариантов и появление наиболее патогенных и резистентных вирусов.

Современные молекулярно-генетические данные позволяют выявлять и сравнивать различные варианты ВИЧ, выделенные в различных странах, регионах или у отдельных лиц, что играет важную роль в расшифровке эпидемий (Покровский В.В., 1996, Бобков А.Ф., Казенова М.Р., Бобкова М.Р. и соавт., 2000).

Применение генотипирования ВИЧ повышает эффективность комбинированного противовирусного лечения, поскольку на основании определения генотипа возбудителя в схему лечения можно вносить необходимые коррективы. Исследователи, обследуя "лекарственно-наивных" больных, выявили резистентность у каждого девятого ВИЧ - инфицированного, не получавшего ранее антиретровирусную терапию ("Reuters" 27.08.99 г.). Широкое применение противовирусных препаратов приводит неизбежно к появлению резистентных штаммов, обусловленных как рекомбинацией, так и мутационным процессом.

Выявлена также прямая корреляция между фенотипом вируса и клиническим течением: вирусы с выраженным цитопатическим действием, высоким уровнем репликации чаще выделяются на стадии СПИДа, в отличие от штаммов с низкой реплицирующейся активностью и отсутствием ЦПД, которые выявляются чаще на ранних стадиях.

Источник: АХ. Рахманова, Е.Н. Виноградова, Е.Е. Воронин, А. А. Яковлев "ВИЧ-инфекция"

Иголка в стоге сена

ВИЧ сегодня разделяют на два вида — ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Более 90% всех ВИЧ-инфекций — первый вид. Второй встречается реже, проявляется медленнее и не всегда приводит к синдрому приобретенного иммунодефицита (СПИД).

ВИЧ-1, в свою очередь, включает в себя четыре группы: M, O, N и P. Самая распространенная — М. В ней сейчас выделяют не менее девяти подтипов.

Открытый американскими учеными штамм вируса относится к группе М. Исследование проводила компания Abbott Laboratories совместно с университетом Миссури в Канзас-Сити. Это первый новый подтип ВИЧ с 2000 года, когда были разработаны основные принципы их классификации.

Для идентификации штамма нужны минимум три независимых случая заражения. Они были: двух человек нашли в Демократической Республике Конго в 1983 и 1990 годах, еще одну — в Конго в 2001 году. Чтобы подтвердить их соответствие друг другу, надо было проверить весь геном. В то время технологий, которые бы помогли с этой работой, не существовало. Выявить подтип L смогли только сейчас. Ученые сравнили свою работу с поиском иголки в стоге сена, а затем ее вылавливанием с помощью магнита.

Ведущий научный сотрудник — заместитель заведующего лабораторией анализа показателей здоровья населения и цифровизации здравоохранения МФТИ (Цифромед Физтеха) Станислав Отставнов предположил, что линия штамма проходит через всех трех обнаруженных больных, а промежуточные переносчики, заразившиеся этой формой, оставались недиагностированными.

Ученые подчеркивают, что вирус иммунодефицита, как любой другой, может со временем меняться и мутировать.

В целом, добавил он, распространение разных подтипов часто зависит от случайных факторов.

Вакцина и терапия

По словам ученых, современные методы лечения ВИЧ вполне эффективны против нового штамма. Вадим Покровский подчеркивает, что подтип не представляет большой опасности.

Он отметил, что, возможно, будет сложнее создать вакцину, так как ученым придется учитывать при работе еще один подтип вируса. Вакцина, пояснил Покровский, должна быть максимально универсальной на случай выявления новых штаммов.

Александр Лукашев добавил, что вероятность заноса подтипа L в Россию крайне низкая, поскольку вирус встречается крайне редко. Но теоретически это может произойти.

Тем не менее некоторые специалисты считают, что тест-системы будут реагировать на новый штамм иначе. Нуклеотидная последовательность подтипа L не менее чем на 15% отличается от геномов других подтипов, иначе бы он не определялся как уникальный. Из-за этого некоторые системы могут не выявить его.

Сейчас существуют две группы тестов: серологические и молекулярно-биологические. Первые выявляют антитела к вирусу — они используются при постановке диагноза. Вторые применяют для оказания медицинской помощи тем, кому диагноз уже поставлен.

Молекулярно-биологические тесты измеряют концентрацию вируса в крови — от этого показателя зависит подход к терапии. Они выявляют фрагменты генома вируса. Если геном поменялся, система может либо не сработать, либо занизить концентрацию вируса. Серологические тесты более устойчивы к генетическим изменениям, поэтому, скорее всего, необходимо будет использовать несколько систем.

Однако эксперты уверены — серьезных поводов для беспокойства нет. Подтип L очень редкий, также действует на организм и распространяется теми же путями, что и другие. Профилактика против него и других штаммов одна и та же, лечение пока тоже.

Общая процедура генотипирования. Независимо от вида теста (см. ниже) процедура генотипирования всегда начинается одинаково - на первом этапе производится выделение РНК из плазмы крови пациента. Как правило, для этого используют ту же порцию плазмы, в которой был повторно обнаружен повышенный уровень вирусной нагрузки в ходе количественного анализа РНК ВИЧ. Минимальное содержание РНК в пробе, предназначенной для генотипического анализа, составляет 1000 копий

На втором этапе полученный генетический материал подвергают амплификации для того, чтобы получить достаточное количество матрицы для работы на последующих этапах. Обычно для этого используют хорошо всем знакомую технику ПЦР. Для повышения чувствительности используют протокол, включающий предварительное ультрацентрифугирование плазмы с целью концентрации вирусных частиц, а иногда дополнительный этап гнездового (nested) ПЦР.

Наконец, третий этап посвящен собственно анализу наличия мутаций лекарственной устойчивости в составе генома ВИЧ. Для этого применяют один из двух подходов.

Альтернативный подход заключается в анализе не всей последовательности генома, а лишь отдельных его позиций, связанных с лекарственной устойчивостью ВИЧ. К их числу относятся LiPA-тест (Line probe assay; INNO-LiPA HIV-1 RT, INNO-LiPA Protease, Murex Innogenetics) и технология микрочипов (Genechip, HIV PRT 440 assay, Affymetrix).

Принципы обоих методов схожи: на первом этапе фрагменты ДНК - пробники, содержащие известные мутации, с помощью блотинга переносят на нитроцеллюлозные фильтры в виде отдельных полос (LiPA-тест) или в виде пятен вносят в силиконовые ячейки (Genechip). На последующих этапах амплифицируют РНК, выделенную от пациента, при этом в полученный ампликонвводят метку - биотин (LiPA- тест) или флуоресцеин (Genechip). За гибридизацией ампликонов с пробниками следует этап детекции, основанной на ферментативной реакции (LiPA-тест) или флуоресценции, соответственно.

Ни тот, ни другой методы широкого применения не получили, и в настоящее время коммерческие их варианты не производятся. Главная причина этого состоит в том, что оба подхода дают неполную информацию о составе генома ВИЧ и при этом обладают целым

рядом технических несовершенств. Так, количество полос, которые можно нанести на LiPA-тест, ограничено физически; напротив, число пробников, которые можно разместить на чипе, практически ничем не лимитировано. Тем не менее, при разработке чипов возникают трудности другого рода, связанные с высокой вариабельностью генома ВИЧ, в том числе и в участках, прилегающих к позициям, связанным с устойчивостью. Эти вариации (включая подтип-специфические) мешают гибридизации ампликона вплоть до полного отсутствия позитивного сигнала; вследствие этого в ходе испытаний Genechip была выявлена недостаточная эффективность в отношении неВ-подтипов и многочисленные проблемы с интерпретацией. Стоимость LiPA-теста сравнима со стоимостью прямого секвенирования, хотя по мере ее снижения эти сравнительно простые и не требующие дорогостоящего оборудования системы могли бы найти применение в практике лабораторий развивающихся стран, тем более, что у них есть и достоинства - они способны выявлять мутации, содержащиеся в 1-10% популяции вирусов (для сравнения, известные на сегодня тесты выявляют мутантный вирус, составляющий минимум 20-25% популяции).

Принципы прямого секвенирования генома ВИЧ. В России разрешены к применению три вида коммерческих тестов для генотипирования ВИЧ - Viroseq HIV-1 (Abbott Laboratories), TruGene HIV-1 genotyping assay (Siemens) и АмплиСенс HIV-Resist-Seq (ЦНИИ эпидемиологии). За рубежом также используются некоторые другие тест-системы, например, GeneSeq HIV (ViroLogic) и HIV GenoSure (LabCorp). Во многих странах мира к использованию также разрешены многочисленные in-house тест-системы (разумеется, после того, как они докажут свою надежность в сравнительных испытаниях), однако в России такой способ лабораторного анализа не практикуется.

В основе всех трех тестов, применяемых в лабораториях для генотипирования ВИЧ, лежит принцип так называемого циклического секвенирования (cycle sequencing). Сам принцип, в основе которого лежит остановка синтеза цепи, был разработан еще в 70-х годах прошлого века Фредериком Сэнгером (Fredrick Sanger) и с тех пор успешно применяется в разных модификациях.

Процесс циклического секвенирования сильно напоминает хорошо всем известную полимеразную цепную реакцию (ПЦР): в составе реакционной смеси, кроме матрицы - исследуемой ДНК (продукта реакций

ОТ и ПЦР), тоже находятся дезокси- нуклеотидтрифосфаты (dNTPs), праймеры, фермент ДНК-полимераза и буфер. Принципиальное отличие заключено в том, что, кроме dNTPs, к смеси в небольшом количестве добавлены так называемые дидезокситрифос- фаты нуклеотидов (ddNTPs).

Эти молекулы - производные dNTPs способны присоединяться к последнему нуклеотиду строящейся цепочки, однако потенциальная связь для присоединения следующего нуклеотида у них отсутствует, и после встраивания любого из ddNTPs синтез новой цепи ДНК прекращается (терминируется), поэтому ddNTPs получили название терминаторов. Это событие происходит не часто, потому что в смеси в избытке находятся dNTPs, а терминаторы присутствуют в недостатке, конкурируя с обычными нуклеотидами за встраивание в цепочку (например, в составе тест-системы TruGene это соотношение составляет 300:1). В результате циклической ре-

В первом случае (dye-terminator)

используются меченые ddNTPs (каждый - своей меткой со специфичной длиной волны), при этом все они добавляются в одну пробирку, а электрофорез проводится в одном капилляре. Образующиеся фрагменты оказываются помечены на З'-конце. В составе секвенатора - машины для проведения последней стадии секвенирования прибор для электрофореза соединен с лазерным регистрирующим устройством, которое распознает не только положение (размер) фрагмента, но и связанную с ним метку, соответствующую последнему З'-нуклеотиду в цепочке каждого фрагмента. Этот подход применен в тест-системах Viroseq и АмплиСенс.

Во втором случае (dye-primer) метят праймеры, при этом приходится использовать четыре разные пробирки, в каждой из которых находится лишь один из ddNTPs, а разделение фрагментов проводить в разных ячейках электрофореза. Тест-система Тш- Gene основана на применении именно такого варианта циклического секвенирования, который в составе этого теста именуется CLIP-реакцией (от cross- linking immuno precipitation; происхождение этого сокращения не вполне ясно). Для получения объединенного (комбинированного) результата регистрации применяется специальное программное обеспечение, и данные о генотипе, полученные обоими методами, выглядят практически одинаково. Читать визуальные результаты легко: каждый из четырех цветных пиков кривой соответствует одному из нуклеотидов, а порядок пиков - порядку нуклеотидов в составе ДНК; впрочем, для прочтения таких кривых также применяются специальные программы, и конечным результатом секвенирования, который получает оператор, становится четырехбуквенный текст последовательности ДНК (sequence).

Сравнение тест-систем для генотипирования ВИЧ. Все три тест-системы предназначены для секвенирования одной и той же области генома - гена ро/, кодирующего все ферменты ВИЧ. Известно, что специфические мутации в PR и RT сосредоточены в позициях 10-93 и 41-236, соответственно. Все тесты анализируют эти позиции, однако несколько различаются координатами исследуемых участков.

Тест Viroseq определяет полную последовательность участка, кодирующего протеазу (PR) (с 1 по 99 аминокислоту), а также секвенирует обратную транскриптазу (RT) с самого начала до 335-ой аминокислоты

• (отсчет начинается индивидуально для каждого белка). Область анализа TruGene включает почти полную последовательность PR (4-99) и ограничивается частью PR, в которой встречаются мутации устойчивости
• (36-247) . В отличие от первых двух тестов, Амплисенс не только способен анализировать мутации в PR (1-99) и RT (30-265), но также в зависимости от комплектации может включать в себя набор для секвени-

рования области, кодирующей инте- гразу (IN) (91-288), а при необходимости дополнительно анализировать участок гена env, кодирующий петлю V3 др120, с целью определения тропизма ВИЧ (см. далее).

В практике лечения ВИЧ-инфекции все чаще применяются ралтегравир и маравирок, поэтому тест-системы Viroseq и TruGene также готовятся к модернизации, в результате которой усовершенствованные наборы будут включать в свой состав набор реагентов для анализа IN и др120.

Каждая из тест-систем имеет собственное программное обеспечение для анализа, редактирования и интерпретации результатов генотипирова- ния, а также позволяет получать последовательности в форматах, пригодных для последующего дополнительного изучения с применением инструментов on-line (*.txt, *.fasta) и научных исследований. Подробнее об интерпретации результатов генотипирования с применением всех тест-систем речь пойдет в следующей главе.

Надежная работа всех трех тестов обеспечивается при вирусной нагрузке от 1000 копий РНК/мл, хотя значительная часть образцов с содержанием вируса от 300 до 1000 копий РНК/мл также поддается анализу; иногда для этого требуется предварительное концентрирование вирусных частиц из большого объема плазмы, а в ряде случаев к протоколу добавляют еще один раунд ПЦР (nested PCR). Время выполнения анализа составляет от трех до пяти дней.

5.1. Использование генотипирования ВИЧ и филогенетического

анализа при проведении эпидемиологического расследования

Генотипирование и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей необходимо использовать в качестве дополнительного инструмента при проведении эпидемиологического расследования случаев ВИЧ-инфекции, предположительно связанных с оказанием медицинской помощи, или других сложных (с эпидемиологической точки зрения) случаев.

Филогенетический анализ может применяться с целью обеспечения дополнительной доказательной базы при определении связанности лиц - участников цепи передачи ВИЧ-инфекции. Методика может позволить сузить круг поиска предполагаемых источников заражения при недостатке эпидемиологических данных и выявить наиболее вероятный источник заражения при наличии нескольких вариантов. Метод филогенетического анализа обладает очень высокой ценностью отрицательного результата при ограниченной ценности положительного результата.

Для определения связи между биологическими образцами от пациентов предположительно из одной эпидемиологической цепи (исследуемая группа) необходимо провести генотипирование образцов крови от всех инфицированных ВИЧ из предполагаемого очага передачи ВИЧ-инфекции, а также образцов крови от инфицированных лиц из группы сравнения. В исследуемую группу необходимо включить пострадавшего/их и лицо/лиц, потенциально являющегося(ихся) для него источником инфекции. В группу сравнения (контрольную группу) необходимо включить не менее 20 - 30 образцов крови, полученных от ВИЧ-инфицированных из того же географического региона, социальной группы, группы риска заражения и инфицированных ВИЧ, в близкие (к исследуемой группе) сроки. Дополнительно в качестве контрольной группы возможно использовать охарактеризованные нуклеотидные последовательности из баз данных, подобранных по аналогичным критериям.

Образцы для проведения генотипирования должны быть направлены с сопроводительным письмом, каждый образец при этом должен сопровождаться заполненным бланком "Направления на генотипирование ВИЧ" (прилож. 4). Все образцы для генотипирования должны иметь свой индивидуальный номер в соответствии с бланком направления, тот же номер должен быть нанесен на пробирку с пробой.

В зависимости от уровня ВН у пациентов из исследуемой группы (инфицированные ВИЧ из предполагаемого группового очага заболевания) и доступности биологических образцов производится выбор вида доставляемого материала. Субстратом для получения нуклеотидных последовательностей для филогенетического анализа может быть использована как вирусная РНК, так и провирусная ДНК. В рамках проведения одного анализа должен быть использован только один тип субстрата для всех образцов как исследуемой группы, так и группы сравнения. Невозможно провести генотипирование образцов от пациентов с неопределяемой ВН, длительно получающих эффективную АРТ.

Если ВН всех образцов из исследуемой группы составляет более 1 000 копий/мл, для каждого пациента из обеих групп на исследование должно быть направлено не менее 1 - 2 мл плазмы крови.

В том случае, если ВН хотя бы у одного пациента из исследуемой группы окажется менее 1 000 копий/мл, то на исследование от такого пациента должны быть направлены пробирки с 5 - 10 мл цельной крови с ЭДТА или не менее 2 аликвот, содержащих лейкоциты плазмы крови.

Ввиду высокой разрешающей способности методики филогенетического анализа следует на всех этапах лабораторной работы минимизировать потенциально возможные технические ошибки, приводящие к контаминации, а также исключить вероятность неправильной маркировки образцов. Для минимизации ошибок во время проведения анализа и для подтверждения его результатов можно рекомендовать исследовать два образца от пациентов из исследуемой группы, забранных в разное время.

Для получения нуклеотидных последовательностей могут быть использованы как методы популяционного секвенирования, так и массового параллельного секвенирования с предварительным специфическим обогащением (например, ПЦР) или без него. По причине большей стандартизации рекомендуется использование наборов реагентов, предназначенных для определения лекарственной устойчивости ВИЧ, в том случае если они позволяют получить нуклеотидные последовательности в необходимом для анализа объеме. По каждому образцу необходимо получить нуклеотидные последовательности достаточной длины (не менее 500 пар нуклеотидов) для 2 - 3 регионов вирусного генома. Следует использовать гены с различными функциями и различной скоростью эволюции (обычно env, pol, pro/rev, int.). Полученные последовательности необходимо объединить в единый файл и провести их выравнивание. После проведения выравнивания все нуклеотидные последовательности должны быть обрезаны по краям для приведения их к одинаковой длине.

Филогенетический анализ полученных последовательностей проводится с использованием специализированного биоинформатического программного обеспечения с обязательным проведением бутстреп-анализа. Результатом филогенетического анализа является филогенетическое дерево, которое является визуальным отображением генетической дистанции между изучаемыми образцами.

При анализе структуры филогенетического дерева попарно оцениваются отношения между образцами исследуемой группы и группы сравнения. В случае если образец из исследуемой группы кластеризуется отдельно от других образцов исследуемой группы (генетическая дистанция между ним и образцами группы сравнения меньше, чем между ним и другими образцами исследуемой группы), можно сделать вывод о том, что по результатам филогенетического анализа данный образец и остальные образцы исследуемой группы эпидемиологически не связаны друг с другом. В случае если образец из исследуемой группы кластеризуется совместно с другими образцами исследуемой группы (генетическая дистанция между ним и образцами из группы сравнения больше, чем между ним и другими образцами исследуемой группы) можно сделать вывод о том, что результаты филогенетического анализа указывают на возможную эпидемиологическую связь между образцами в исследуемой группе.

Заключение по результатам филогенетического анализа содержит следующую информацию: детали применяемой методики, количество исследованных образцов, полученные филогенетические деревья, все выявленные субтипы ВИЧ у обследованных, генетическая дистанция между образцами разных групп, выводы.

Представлены данные определения субтипа вируса иммунодефицита человека, частоты выявления первичных и вторичных мутаций вируса иммунодефицита человека, выделенных от больных первичной ВИЧ-инфекцией в 2009 и 2011 гг. Всего было изучено 78 образцов. Отмечено сохранение доминирующей роли субтипа А вируса, который был диагностирован в 89,7%. Впервые в СанктПетербурге описана передача первично резистентного штамма ВИЧ от больного, получающего антиретровирусную терапию. Показано, что наиболее частыми мутациями резистентности стали мутации в гене обратной транскриптазы A62V (8 случаев) и в гене протеазы L10I/V/F/R/Y (9 случаев). Проведен анализ выявленных мутаций резистентности и мутаций полиморфизма, определено их значение для назначения оптимальной схемы антиретровирусной терапии.

Внедрение в клиническую практику комбинированной антиретровирусной те- рапии (АРВТ) обеспечило снижение смертности, улучшение качества жизни людей, живущих с вирусом иммунодефицита человека (ЛЖВ), сокращение вероятности пере- дачи вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и уменьшение экономического бреме- ни эпидемии ВИЧ-инфекции [1]. При этом наличие первичной или вторичной рези- стентности вируса к АРВ препаратам резко снижает ее эффективность, что приводит к быстрой селекции высокорезистентных штаммов с последующей передачей их но- вым пациентам. Уровень резистентных штаммов, циркулирующих в популяции ЛЖВ, является серьезным фактором, определяющим выбор противовирусных средств пер- вой линии, и обосновывает различные стратегии подбора эффективных схем АРВТ. В США и странах Западной Европы от 6 до 16% штаммов ВИЧ имеют резистентность, как минимум, к одному классу АРВ препаратов, в том числе 3–5% штаммов резистент- ны более чем к одному классу [2–5]. Таким образом, высокий уровень резистентности к основным АРВ препаратам обуславливает действующие в США клинические реко- мендации по выполнению теста на резистентность каждому вновь выявленному ВИЧ- инфицированному пациенту [6]. До настоящего времени в Российской Федерации со- храняется низкий уровень первичной резистентности ВИЧ. В 2011 г. были опубликова- ны результаты двух исследований по изучению уровня резистентности среди ЛЖВ, не получавших АРВТ. Среди 56 образцов, проанализированных в Московском регионе, был выявлен 1 случай генотипической резистентности — мутация M184V, определя- ющая устойчивость к базовому препарату из группы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (НИОТ) — ламивудину [7]. При изучении 111 образцов от па- циентов Санкт-Петербурга не было выявлено ни одного случая мутации лекарствен- ной устойчивости [8]. Для выработки наиболее оптимальной схемы комбинированной АРВТ необходима актуальная информация об уровне резистентности среди штаммов ВИЧ, циркулирующих в популяции в настоящее время. Эту задачу возможно решить, осуществляя генетический анализ вирусов, выделенных от больных первичной ВИЧ- инфекций, при которой период от момента попадания ВИЧ в организм человека до начала клинических проявлений не превышает нескольких месяцев. При этом в на- стоящее время для оценки уровня резистентности, как правило, используются данные, полученные при анализе материала от пациентов, имеющих различные клинические проявления ВИЧ-инфекции. В этой ситуации не учитывается важнейшая особенность патогенеза ВИЧ-инфекции — длительный скрытый (латентный) период, который про- должается от 1 до 8 лет [1]. В связи с этим информация об уровне резистентности ВИЧ у впервые выявленного пациента, имеющего клиническую симптоматику, отражает ха- рактеристику вируса в момент его проникновения в организм человека, которое про- изошло некоторое время тому назад.

Результаты и обсуждение. В исследуемых группах было показано следующее рас- пределение субтипов ВИЧ-1: в 2009 г. — выявлено 87,7% (43) пациентов, имеющих суб- тип А, 10,2% (5) — субтип В, 2,1% (1) — субтип G; в 2011 г. — 94,7% (18) — субтип А,
5,3% (1) — субтип В. В целом по результатам 2009 и 2011 гг. субтип А ВИЧ доминировал и был выявлен у 89,7% обследованных (61/69). В исследовании выявлен относитель- но высокий уровень образцов ВИЧ, геном региона pol которого оценен как рекомби- нантный. Преобладающим рекомбинантным вариантом ВИЧ был А/АЕ рекомбинант (15/60), вторым вариантом был АЕ/А рекомбинант (6/60). АЕ/АЕ и А/В рекомбинанты выявлены не были.
Полученные данные о преобладании в структуре ВИЧ на территории Санкт- Петербурга субтипа А полностью соответствуют результатам, полученным при ана- лизе ВИЧ от больных, наблюдающихся в Санкт-Петербургском городском центре по профилактике и борьбе со СПИДом. В работе, опубликованной в 2011 г., показано, что доля субтипа А составляет 86,7% среди всех субтипов. При этом авторы отмеча- ют, что половой путь доминирует при передаче не-А субтипов вируса [8]. При анализе механизма передачи среди 513 больных острой ВИЧ-инфекцией, выявленных в Санкт- Петербурге в 2007–2010 гг., отмечено стабильное преобладание полового пути пере- дачи, который установлен более чем у 60% пациентов [9]. Можно считать, что сохране- ние доминирующего субтипа А ВИЧ в Санкт-Петербурге как в период преобладания парентерального пути передачи (1999 — середина 2000-х), так и в период нарастания сексуального пути передачи (середина 2000-х — 2011 г.) свидетельствует о последова- тельном вовлечении в эпидемический процесс потребителей инъекционных наркоти- ков, их половых партнеров, а затем и популяции в целом.
При анализе 78 образцов сывороток методом циклического секвенирования были получены результаты по частоте выявления мутаций в исследуемых образцах. Прове- ден раздельный анализ мутаций устойчивости к АРВ препаратам и мутаций полимор- физма. Данные исследования свидетельствуют, что в 2009 г. мутаций резистентности выявлено не было. В 2011 г. впервые был диагностирован 1 случай выявления первич- ной резистентности — выявление мутации G190S среди штаммов ВИЧ, в настоящее время циркулирующих в Санкт-Петербурге. Высоко резистентный к группе ненукле- озидных ингибиторов обратной транскриптазы (ННИОТ) штамм вируса был выделен от больной с диагностированной острой ВИЧ инфекцией 2В стадии, клиническими проявлениями которой являлись орофарингеальный кандидоз и мононуклеозопо-добный синдром. Заражение произошло половым путем от ВИЧ-инфицированного сексуального партнера, заразившегося из-за употребления инъекционных наркоти- ков. Пациент состоит на диспансерном учете, получает антиретровирусную терапию, включая ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы. Передача первично резистентного вируса от пациента, находящегося на АРВТ, свидетельствует о ее виру- сологической неэффективности и недостаточной приверженности больного проводи- мому лечению. В данной ситуации назначение больной с резистентным вирусом АРВТ с использованием препаратов первой линии из группы ННИОТ приведет к клиниче- ской и вирусологической неэффективности и формированию мультирезистентных штаммов ВИЧ.

Мутации в гене протеазы были представлены только минорными (второстепен- ными) мутациями, которые характеризуются тем, что не затрагивают активный центр фермента и часто обнаруживаются в полиморфных участках не-В субтипа ВИЧ. Наи- более часто выявлялась мутация L10I/V/f/R/Y — 11,5% случаев. Данная мутация встречается у 5–10% ранее нелеченных АРВТ пациентов и вызывает резистентность к препаратам из группы ингибиторов протеазы (ИП) только в присутствии других му- таций резистентности в гене протеазы. В нашем наблюдении мутация носила изолиро- ванный характер, следовательно, штаммы вируса сохраняли свою чувствительность ко всем препаратам из группы ИП. В 5 случаях выявлены иные изолированные минорные мутации в гене протеазы, в том числе в 3 случаях t74S мутация и по 1 случаю мута- ции f53Y и L33f. Эти мутации могут приводить к снижению эффекта двух препаратов из группы ИП — нельфинавира и фосампренавира. При этом, указанные АРВ средства имеют ограниченное применение в клинической практике, а другие ИП, такие как ло- пинавир, атазанавир, дарунавир, эффективны даже при наличии этих изолированных мутаций.

Наряду с первичными мутациями у больных острой ВИЧ-инфекцией выявлены
вторичные мутации (табл. 2, 3).

Данные мутации, также обозначаемые как мутации полиморфизма, появляются в геноме ВИЧ спонтанно, более того, у части генетических вариантов ВИЧ они реги- стрируются постоянно и отражают генетическое разнообразие популяции вируса. Эти мутации не оказывают выраженного действия на устойчивость ВИЧ к АРВ препара- там, однако возможно, что наличие мутаций полиморфизма может оказывать потен- циальное действие по снижению эффективности АРВТ. Клиническая необходимость осуществления мониторинга мутаций полиморфизма ВИЧ определяется следующим положением. Несмотря на то, что каждая из мутаций полиморфизма не оказывает пря- мого влияния на формирование резистентности, может происходить синергетическое усиление действия двух и более мутаций. Соответственно, наличие изолированной мутации резистентности может не приводить к вирусологической неэффективности, а наличие той же мутации в сочетании с мутациями полиморфизма может формиро- вать резистентность вируса к АРВТ.

Среди обследованных образцов выявлено 6 мутаций, отнесенных к мутайиям лиморфизма в гене ОТ. Частота их выявлена была относительно невысокой и состав- ляла от 2,6 до 11,5%. Наиболее часто были диагностированы мутации G333D/E, E138A и V90I. Мутация E138A, являясь мутацией полиморфизма, может оказывать влияние на увеличение резистентности к препаратам из группы ННИОТ второго ряда (этра- вирин и рилпивирин) при ее сочетании с иными мутациями резистентности к группе ННИОТ.
Мутации полиморфизма в гене протезы отмечались более часто. Всего было выяв- лено 11 различных мутаций, встречаемых с различной частотой. Мутации L89M, I93L, M36I, отражая генетическое разнообразие вируса, наблюдались практически во всех образцах (91,0–94,8%). При этом мутация M36I может иметь слабое влияние на рези- стентность к ИП среди субтипа В ВИЧ. Мутации L63P, V77I, V82I, встречаемые с часто- той от 1,3 до 14,0%, являются типичными мутациями полиморфизма, при этом счита- ется, что их селекция может обуславливаться воздействием препаратов из группы ИП. В 15,4% случаев была выявлена мутация K20R, которая, являясь мутацией полимор- физма, тем не менее может оказывать незначительно влияние на снижение чувстви- тельности вируса к препаратам из группы ИП. В случаях выявления иного варианта этой мутации — K20I/M/t/V, может происходить потенциальное снижение чувстви- тельности к нельфинавиру, при селективном давлении которого, возможно, и форми- руется указанная мутация. Клиническое значение мутаций I13V, I15IV, G16E, I62V, вы- явленных у пациентов первичной ВИЧ-инфекцией, в настоящее время не установлено.
Таким образом, впервые в Санкт-Петербурге документирована передача первично резистентного штамма ВИЧ от пациента, находящегося на неэффективной антиретро- вирусной терапии. Уровень резистентных штаммов, выделенных от больных первич- ной ВИЧ-инфекцией, является низким (0/49 в 2009 г. и 1/29 в 2011 г.).
Антиретровирусная терапия на основе препаратов из группы нуклеозидных и не- нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы сохраняет свое значение в каче- стве эффективной схемы первой линии для ранее нелеченных пациентов. Наиболее часто выявлялись мутации в гене обратной транскриптазы A62V (10,3%) и в гене про- теазы L10I/V/f/R/Y (11,5%). Отмечается тенденция к нарастанию числа мутаций в гене обратной транскриптазы. Несмотря на преобладание в Санкт-Петербурге с середины
2000-х гг. полового пути передачи ВИЧ-инфекции отмечается сохранение доминирую- щего значения субтипа А вируса иммунодефицита человека.

Статья поступила в редакцию 5 декабря 2012 г.

ЖУРНАЛ: ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ 11: МЕДИЦИНА Издательство: Санкт-Петербургский государственный университет (Санкт-Петербург) ISSN: 1818-2909 Номер: 1 Год: 2013 Страницы: 171-178

В. Б. Мусатов, А. А. Яковлев, Т. В. Тыргина, Н. Н. Ладная

Статья добавлена 29 мая 2013 г.