Инструмент с вич вирусов

ВИЧ — это первый ретровирус человека. Ретровирус — это особый тип вируса. Про него было известно, что он существует у других видов, а ВИЧ — это первый пример такого вируса у людей. ВИЧ впервые был обнаружен в начале 1980-х годов, когда было зарегистрировано несколько случаев обращения гомосексуалов в отделения неотложной помощи в больницах с новой болезнью, которая, по-видимому, была как-то связана с иммунодефицитом. Их иммунная система переставала работать, и было непонятно почему. Какое-то время ушло на то, чтобы понять, что дело было в новой вирусной инфекции, которая раньше у людей не наблюдалась. Впервые она была описана в начале 1980-х годов в Сан-Франциско, а затем ученые поняли, что она распространена гораздо шире. Люди, которые ее идентифицировали, работали в Институте Пастера: Франсуаза Барре-Синусси и Люк Монтанье работали в лаборатории над другими ретровирусами и обнаружили под электронным микроскопом ретровирус в клетках пациентов, страдающих от этой инфекции.

За эту работу они получили Нобелевскую премию, и большой вклад в нее также внесли исследователи из США, например Роберт Галло. Для диагностики этого вируса был разработан тест, мы научились диагностировать наличие этого вируса, и оказалось, что им было заражено большое количество людей, но лечения тогда еще не было. И оказалось, что вирус распространяется через сексуальный контакт, то есть это заболевание, передающееся половым путем, а также через препараты крови, и в то время люди, которым вводились препараты крови, например люди с гемофилией, могли быть заражены этим вирусом. Также можно заразиться, например, через контакт с кровью — таким образом, потребители инъекционных наркотиков оказываются в группе риска: среди них часто бывает, что несколько человек используют одну иглу, и если один из них был заражен, то заражены будут и все остальные, кто использовал ту же иглу. Так что в те дни все это очень пугало: появился совершенно новый вирус, люди умирали, и никто не знал, что делать. Но, к счастью, мы довольно много знали о ретровирусах, потому что проводили исследования ретровирусов у других видов, в частности у мышей, так что довольно быстро был разработан новый тип препаратов для лечения ВИЧ, и они применяются и сейчас.

К 2016 году уже можно лечить ВИЧ коктейлем из антивирусных препаратов, которые в теории должны предотвратить заражение новых клеток тела. А это значит, что вирус в большинстве случаев становится невозможно обнаружить, и мы думаем, что пациент может прожить достаточно долгую жизнь, если будет принимать антиретровирусные препараты. Так что если вы можете себе их позволить, то все в порядке, и на Западе все хорошо, но в бедных ресурсами регионах, таких как Тропическая Африка, где меньше денег и сложнее купить довольно дорогие антиретровирусные препараты, это проблематично. Но они доступны, и сейчас существуют широкие программы по распространению антиретровирусной терапии, чтобы каждый больной мог получить доступ к необходимым препаратам.

Когда вы впервые подхватываете ВИЧ, вы получаете инфекционный синдром, очень похожий на другие вирусные инфекции, например грипп. Тогда вирус реплицируется в вашем теле до очень высоких титров, то есть очень большого количества вируса в теле, и вы чувствуете себя очень больным. У вас может появиться сыпь и температура, и вы, возможно, проведете несколько дней в постели и будете чувствовать себя так, как будто подхватили какую-то вирусную инфекцию. А затем все проходит, ваша иммунная система подавляет репликацию вируса и может даже подавить ее до очень низкого уровня, такого, что спустя несколько недель после заражения вирус в вашем теле обнаружить невозможно.

Что происходит затем — не вполне ясно, но точно известно, что ваша иммунная система постоянно сражается с вирусом. В течение этого периода времени вы не чувствуете особых симптомов, так что возникает ощущение, что вам стало лучше, вы выздоровели, но в случае с ВИЧ это не так. Он по-прежнему реплицируется в вашем теле, а это значит, что со временем по причинам, которые мы до конца не понимаем, ваша иммунная система оказывается истощенной и перестает работать. В этот момент вирус берет верх и уничтожает вашу иммунную систему, и вся эта долгая битва между вирусом и иммунной системой заканчивается полным поражением последней. Из-за этого вы заболеваете, и болезни, вызванные ВИЧ, — это в основном оппортунистические инфекции.

Так что все это — болезни, от которых вы обычно не страдаете, например грибковые инфекции. Мы постоянно подвергаемся атакам грибов, которые пытаются нас разрушить, но у них ничего не выходит, потому что наша иммунная система нас защищает. Но без нее эти грибковые инфекции начинают вызывать очень тяжелые заболевания рта, легких и дыхательных путей. И к моменту обнаружения СПИДа все эти болезни у людей ранее не наблюдались, потому что наша иммунная система с ними очень хорошо справляется, так что лечить их было очень сложно. Теперь для этих болезней разработаны разные способы лечения. Но до тех пор должен пройти долгий промежуток времени, около 8–10 лет, в течение которого ваше тело борется с вирусом и держит его под контролем.

Сейчас считается, что если вы заражены ВИЧ, то вам нужно начать медикаментозное лечение как можно скорее, хотя раньше, если мы видели, что вы не страдаете от каких-то симптомов, мы думали, что нет нужды принимать препараты, пока симптомы не проявятся. Сейчас мы можем измерять количество клеток CD4, являющихся целью вируса, и мы можем мониторить, как себя чувствует ваша иммунная система. Раньше мы начинали лечить людей, только когда они достигали определенной точки, после которой их иммунная система выходила из строя. Сейчас мы считаем, что чем раньше начать лечение, тем лучше, так как оно помогает защитить вашу иммунную систему от урона, который она возьмет на себя, даже пока вы сами не страдаете от каких-либо серьезных симптомов. Так что цель современной терапии состоит в том, чтобы помешать вирусу размножиться. Но это, к сожалению, не приводит к излечению, и мы не вполне понимаем почему. Так что если вы принимаете антиретровирусные препараты, то вы можете подавить репликацию вируса до такого состояния, что он будет незаметен: его будет невозможно обнаружить в вашем теле. Но все же, если вы прекратите принимать препарат, за короткий промежуток времени — около нескольких месяцев — вирус вернется. Так что мы знаем, что препараты не позволяют полностью избавиться от вируса и иммунная система тоже не может избавиться от вируса, но мы не понимаем почему.

Я думаю, есть два объяснения, и в настоящее время проводится много исследований в попытках выяснить, какое из них верно (а может быть, верны оба). Объяснение первое — что вирус по-прежнему находится в вашем теле где-то в органах (возможно, в лимфоидной ткани пищеварительной системы) и тихо там себе размножается. Объяснение второе — что он действительно перестает реплицироваться, а препараты позволяют избавиться от всех клеток, которые производят вирус. В этом случае в теле остаются только те клетки, которые содержат вирус, но активно его не производят, так что, пока они не начнут производить вирус, избавиться от них не получится. Поэтому если вы перестанете принимать препараты, то рано или поздно эти клетки начнут производить вирус, и все начнется заново. Так что мы не до конца понимаем, нужно ли нам улучшать препараты, чтобы уничтожить вирус, включая его остатки в организме, или нам нужна стратегия для пробуждения клеток, которые содержат вирус, но не производят его, чтобы уничтожить и их тоже. И это задает повестку исследований, цель которых — найти лучший способ до конца вылечивать людей.

Есть две большие области исследований ВИЧ. В США, как мне кажется, сейчас пытаются сосредоточить все исследования на поиске лечения. Есть ощущение, что нам надо не валять дурака, а просто сосредоточиться на лечении больных, и это единственный способ искоренить болезнь. Конечно же, есть попытки также и изобрести вакцину, но мы не понимаем, как ее сделать, и мы недостаточно много знаем о вакцинах, чтобы понять, почему у нас не получается сделать вакцину от ВИЧ. Мы пробовали классические способы получения вакцины, и все они с ВИЧ просто не работают. Есть множество возможных причин, почему это так, но до конца мы их не понимаем. И я не думаю, что кто-то верит, что в ближайшее время вакцина появится, так что, мне кажется, произошел сдвиг в сторону идеи, что нужно искать новые способы лечения, возможно, с новыми стратегиями терапии. Это одна область исследований.

Вторая глобальная область исследований ВИЧ — использование ВИЧ как инструмента. ВИЧ очень маленький вирус, он состоит из девяти генов — это девять белков. Часть из этих белков довольно сложны и могут быть разбиты еще на несколько, но все-таки это простой вирус. Для сравнения: вирус герпеса состоит из более чем двухсот генов, тогда как у ВИЧ их всего девять. И из-за этого ВИЧ становится очень легко управляемым генетическим инструментом.

Мы можем использовать этот вирус, чтобы изучать клеточную биологию, и это оказался очень мощный инструмент для понимания, что происходит в клетках нашего тела, как они работают, как они делятся, как движется вещество, как они организованы, и ВИЧ — потрясающий инструмент в этой области. Например, мы многое узнали об экспорте РНК из клеточного ядра, как регулируется экспорт РНК из ядра, как регулируется сплайсинг. ВИЧ должен управлять этими процессами, и, изучая, как он это делает, мы узнали об этом очень многое. Мы многое поняли о контроле за транскрипцией: ВИЧ обладает своим активатором транскрипции, но он работает не так, как другие активаторы, и изучение этого процесса позволило нам понять многое о том, как транскрипция работает в целом. Так что это потрясающий инструмент для решения разных научных вопросов, и в моей лаборатории мы используем ВИЧ именно как инструмент для исследования иммунной системы.

Нас часто спрашивают: действительно ли изучение ВИЧ и того, как он работает, помогает лечить его или другие болезни? И я думаю, что ответ — да. Очень важно понимать: когда в начале 1980-х годов ВИЧ только появился, единственное, как мы могли разработать лечение, — это основываясь на понимании биологии ретровирусов, которое мы получили, изучая ретровирусы мышей. Все лечение ВИЧ основано на твердом понимании того, как он работает. И если мы расширим наше понимание, мне кажется, оно поможет нам разработать и новые препараты. Вопрос в том, нужны ли нам новые препараты: те, которые мы используем сейчас, уже достаточно эффективны. Устойчивость к препаратам — вот это проблема. Если вы лечите кого-то одним препаратом, вирус может мутировать, измениться и перестать быть чувствительным к нему. Но если вы используете несколько препаратов, то эта проблема уменьшается, так что люди обычно принимают по три препарата. Но все же устойчивость к препаратам растет, становится более распространенной, и вполне возможно, что все закончится так же, как в ситуации с устойчивостью к антибиотикам, что наши препараты станут менее эффективны в борьбе с ВИЧ. И в таком случае знание, как работает ВИЧ и как создать новый препарат, будет очень полезным. Также возможно, что, действительно хорошо поняв, как работает ВИЧ, мы сможем найти уязвимые места у всех вирусов, так что некоторые считают, что мы сможем разработать антивирусные препараты более широкого спектра действия.

ВИЧ-инфекция (синдром приобретенного иммунодефицита — СПИД) — медленно

прогрессирующее инфекционное заболевание, возникающее вследствие заражения

вирусом иммунодефицита человека, поражающего иммунную систему, в результате

чего организм становится высоко восприимчив к различным инфекциям и

опухолям, которые в конечном итоге приводят больного к гибели.

Причина. Возбудитель СПИДа относится к вирусам медленных инфекций. Имеется

две группы вирусов — ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Они быстро изменяютя. При кипячении

погибают через 1 мин, быстро инактивируются под воздействием

дезинфицирующих средств. Стойки к солнечным лучам и замораживанию.

Источник возбудителя — человек, больной или вирусоноситель. Больные СПИДом

заразны в течение всей жизни.

Передача вируса осуществляется при половом контакте, при переливании

инфицированной крови и через инфицированные кровью инструменты, предметы,

от матери к плоду. Наиболее опасны в распространении заболевания лица обоих

полов, ведущие беспорядочную половую жизнь, а также гомосексуалисты.

ВИЧ не передается через укусы насекомых, при бытовом контакте, через слюну.

Процесс развития болезни. Заражение происходит при попадании вируса в кровь

или слизистые оболочки. Отсюда он внедряется в различные клетки тканей

организма и встраивается в них. ВИЧ может в течение многих лет находиться в

организме человека, не вызывая видимых признаков болезни. Под воздействие

внешних факторов, чаще всего — другой вирусной инфекции (герпес, гепатит В

и др.) вирус активизируется, начинает размножаться и разрушать зараженные

им клетки, в первую очередь клетки иммунной системы, что делает человека

беззащитным к инфекциям и опухолям.

Признаки. Инкубационный период длится в пределах до 1 мес. Большинство

зараженных вначале чувствуют себя здоровыми и болезнь никак себя не

проявляет, но выявляется при исследовании крови.

Через 1,5-2 года у больных увеличиваются лимфатические узлы (более 1 см)

нескольких областей тела (шейные, локтевые, подмышечные, надключичные) без

нарушения самочувствия и каких-либо болезненных ощущений.

Через 6 мес — 5 лет после этого начинается стадия вторичных заболеваний.

В первые 3-7 лет снижается умственная и физическая работоспособность,

появляется обильная ночная потливость, периодические повышения температуры

тела до 38 о С, неустойчивый стул, потеря массы тела до 10%. В эту фазу

болезни бывают грибковые болезни кожи, герпес, опоясывающий лишай,

бородавки, гнойничковые и аллергические болезни кожи, чешуйчатый лишай,

поражения слизистых оболочек, повторные ОРЗ и воспаления придаточных пазух

Затем появляется необъяснимое повышение температуры тела или понос более 1

мес, потеря массы тела более 10%, выраженные поражения кожи в виде

грибкового поражения полости рта, повторного распространенного

опоясывающего лишая, хронических гнойничковых поражений кожи, фурункулов,

кровоизлияний в кожу, опухоли кожи (саркома Капоши).

При длительности ВИЧ-инфекции более 5 лет, как правило, развиваются тяжелые

инфекции, обусловленные микроорганизмами, не вызывающими заболеваний у

здоровых лиц и новообразовавния, которые приводят больного к смерти.

Распознование болезни. Диагноз ВИЧ-инфекции ставится по результатам

специального исследования крови, которое в большинстве случаев дает

результат через 3 мес после заражения. Кровь для исследования берется из

локтевой вены в количестве 3-5 мл.

Показаниями для обследования на ВИЧ- инфекцию являются:

лихорадка более 1 мес;

понос более 1 мес;

необъяснимая потеря массы тела на 10% и более;

затяжное, повторяющееся или не поддающееся обычному лечению воспаление

постоянный кашель более 1 мес;

увеличение лимфоузлов 2-х и более групп свыше 1 мес;

слабоумие у ранее здоровых людей;

другие, более тяжелые болезни.

Обследование на ВИЧ-инфекцию можно произвести анонимно.

Лечение. ВИЧ-инфицированные в изоляции не нуждаются.

При постановке диагноза ВИЧ-инфекции больные госпитализируются в

специализированные клиники или отделения. Проводимое лечение предупреждает

прогрессирование болезни, предотвращает или отдаляет развитие угрожаюших

жизни поражений, так как в настоящее время медицина не располагает

средствами, которые позволили бы вылечить человека от ВИЧ-инфекции.

Диспансеризация. После госпитализации пациенты пожизненно находятся под

наблюдением специалистов региональных центров по профилактике и борьбе со

СПИДом, где им оказывается любой вид квалифицированной медицинской помощи

при гарантированном соблюдении тайны диагноза.

Предупреждение болезни. Основной метод — прерывание путей передачи инфекции.

Для предупреждения полового пути передачи следует иметь одного надежного

полового партнера или пользоваться кондомом при случайном сексуальном

контакте. Начинать половое воспитание необходимо с детства.

В медицинских учреждениях проводятся мероприятия по обеззараживанию

инструмента, исследуются все порции донорской крови.

Наркоманы нуждаются в одноразовых шприцах.

Лица, контактировавшие с ВИЧ-инфицированным, подвергаются обследованию.

— Валерий Владимирович, насколько опасен новый коронавирус для ВИЧ-инфицированных?

— Наверное, правильнее будет оценивать новый вирус с позиции опасности для всего человечества. Да, если говорить простым языком, люди со сниженным иммунитетом находятся в группе риска. Но в первую очередь рискуют пожилые и беременные. Пациенты с ВИЧ при условии своевременного регулярного приема антиретровирусной терапии не отличаются от обычных людей. У них тот же период наблюдения, те же меры профилактики, та же ответственность перед обществом.

— Как вы относитесь к призыву не выходить из дома?

— Нужно его услышать и выполнить, и неважно, хороший у вас иммунитет или нет. Молодым тоже нужно побыть в изоляции — пусть они лучше переносят эту инфекцию, но они могут стать источником для близкого возрастного человека и не близкого. Нужно понимать, что возрастные люди рискуют не просто заболеть, а получить осложнения и умереть.

Ведущие инфекционисты и эпидемиологи мира пока не могут спрогнозировать, что будет завтра. У нас нет способа профилактики — вакцины, поэтому разобщение самый эффективный метод. Это один из законов эпидемиологии.

— Говорят, что коронавирус лечат теми же препаратами, что и ВИЧ. Это правда?

— Да, поэтому еще нужно выяснить, кто в большей группе риска — ВИЧ-инфицированные или остальные люди. Пациент, принимающий антиретровирусную терапию, может переболеть коронавирусом в легкой форме и даже не отличит его от ОРВИ.

Исторически сложилось так, что в ситуации, когда нет препарата против нового вируса, пробуют то, что имеется в арсенале. После ряда эпидемий в 2000-х годах врачи поняли, что ВИЧ-препараты работают.

— Как будет развиваться вирус? Может ли он мутировать и стать более опасным и для молодых людей?

В период пандемии уровень летальности выше, чем год спустя. Тот же вирус 2009 года уже перешел в категорию сезонного, он циркулирует, но за последние 10 лет потерял свою вирулентность — стал менее зловредным. С коронавирусом все пока непонятно, но скорее всего, с ним будет то же самое. А может, он и вовсе исчезнет.

— Что вы думаете по поводу рекламы противовирусных средств, которая утверждает о якобы эффективности против нового вируса? Некоторых производителей уже проверяет антимонопольная служба.

— Дело в том, что рекомендации исходят из инструкции, в которой может быть указано, что препарат работает в отношении коронавируса. Но нужно понимать, что коронавирус — это не новое для человечества явление. Просто тот, что обнаружили в Китае — новый. Поэтому к такой рекламе я отношусь в зависимости от того, как в ней расставлены акценты. Сейчас еще ведутся исследования нескольких десятков препаратов, существующих на рынке.

— Как вы относитесь к антипрививочникам и ВИЧ-диссидентам? Они сильно мешают борьбе с инфекциями?

— Крайне негативно отношусь к этим явлениям — как врач, который старается сохранить жизнь пациенту и улучшить качество его жизни. Мы сталкиваемся с единичными эпизодами ВИЧ-диссиденства. Неверие в сам факт болезни, отказ от лечения — это трагедия для одного человека. Но когда мать отказывается ребенка лечить — это катастрофа.

Что касается антипрививочников — все они сравнительно молодые люди, которые никогда не видели эпидемий, последствий дифтерии, полиомиелита, кори, паротита. Это как раз те заболевания, прививки от которых входят в национальный календарь. Причем сами антипрививочники привиты в большинстве случаев.

Никто не говорит, что вакцина абсолютно безопасна — как у любого эффективного препарата, у нее есть противопоказания и побочные эффекты. Но без вакцины мы получим вспышку. Если болезни нет, это не значит, что вокруг нет ее возбудителей. И привитость не исключает факт носительства.

— Периодически всплывают новости, что ученые создали вакцину против ВИЧ. Что вы думаете по этому поводу? Будет ли такая вакцина когда-нибудь?

— Каждый выпуск новых врачей приходит к нам с информацией о вакцине, которая вот-вот появится. Но пока по факту ее нет. А все разговоры о том, что якобы кто-то скрывает готовую вакцину — на уровне слухов, доказательств этому нет.

— То есть, вылечить ВИЧ пока невозможно?

— Вылечиться — это значит либо избавиться от болезни, либо выработать устойчивость к возбудителю. При ВИЧ такое пока невозможно. Все варианты помощи при этой инфекции сводятся к подавлению вируса до неопределяемого показателя. Он есть в организме, но он не вредит.

— А существуют ли люди, которые не подвержены заражению ВИЧ?

— Да, это люди с генетической мутацией белка, куда встраивается вирус. Из-за этого ВИЧ просто не может закрепиться на поверхности клетки и заразить ее.

— Были ли у нас случаи умышленного заражения ВИЧ?

— Прямо умышленного не припомню. Было неинформирование партнера, из-за чего люди подавали иски в суды. Но на моей памяти эти процессы закончились мировыми соглашениями.

— Однозначно ответить сложно. У нас есть проблема антибиотикорезистентности — когда из-за бесконтрольного употребления либо устаревания антибиотики перестают работать при известных болезнях. Это реально представляет опасность для человечества. Новых антибиотиков не появляется, и сомнительно, что кто-то изобретет суперантибактериальные средства.

В отношении вирусов все тоже очень сложно. ВИЧ сейчас нельзя уничтожить, и в целом человечество не вооружено на 100% в отношении инфекционных агентов. И если пофантазировать, что появится какой-то новый вариант… Да вот пример — коронавирус. Кто думал об этом еще полгода назад?

— Как думаете, вакцину от коронавируса изобретут?

— Думаю, да. По наблюдениям ведущих специалистов, коронавирус довольно устойчивый, он не меняет состав белков на своей поверхности, его структура не меняется. Это очень важно для создания вакцины.

А вот ВИЧ и вирус гепатита С многократно меняются в организме, у них нет маркеров-зацепок, в отношении которых могла бы сработать вакцина. Они просто быстрее меняются, прежде чем вакцина создается.

Факт

Врага нужно знать в лицо

Об иммунитете, апоптозе и вообще.

Иммунная система развивалась сотни миллионов лет. По типу реакции ее обычно делят на врожденный (неспецифичный) и приобретенный (специфичный) иммунитет [1], [2]. Считается, что специфичный (то есть вырабатываемый к конкретному патогену) иммунитет впервые появился у челюстноротых (рыб и всех вышестоящих по эволюционному древу таксонов) после отделения от бесчелюстных (миног и миксин), хотя у вторых имеется аналогичная система защиты [3]. К клеткам специфичного иммунитета относят В-лимфоциты, Т-лимфоциты и NK-клетки (естественные киллеры, natural killer cells). Помимо этого существуют моноциты, которые хоть и не являются истинными инструментами приобретенного иммунитета, однако выполняют некоторые функции по нейтрализации патогена: фагоцитоз, презентация антигена, выделение бактерицидных веществ и цитокинов.

Рисунок 1. Взаимодействия Т-киллеров (слева) и Т-хелперов (справа) с зараженными клетками. Для передачи сигнала о заражении необходимо выполнение двух условий: контакт комплекса МНС-патоген с TcR (T-cell Receptor, рецептор Т-клеток) и CD. Двигаясь по организму, Т-лимфоциты проверяют каждую клетку на предмет наличия у нее антигена в комплексе с МНС. Их можно сравнить с подслеповатой глуховатой бабушкой, пришедшей забирать дитятко из детского сада. Для опознания ей надо подойти вплотную и по нескольким (в данном случае по двум) признакам определить, ее ли это чадо или нет.

Т-лимфоциты, в свою очередь, необходимы для уничтожения клеток, зараженных внутриклеточными паразитами, и опухолевых клеток. Они делятся на два основных типа в зависимости от класса рецепторов, находящихся на внешней стороне их мембраны.

Т-киллеры несут CD8 рецепторы и отвечают за:

Т-хелперы имеют CD4 рецепторы и ответственны за секрецию цитокинов, которые:

активируют макрофаги для борьбы с внутриклеточными паразитами;
способствуют продукции антител В-лимфоцитами.

Но не менее важна роль Т-хелперов в подготовке зрелых Т-киллеров из клеток-предшественниц, активации NK-клеток и моноцитов.

Как же происходит опознавание антигена на молекулярном уровне? Здесь надо упомянуть еще об одном очень важном классе рецепторов — МНС (Major Histocompability Complex или главном комплексе гистосовместимости). Они бывают двух классов: I и II. МНС I присутствует на поверхности всех ядерных клеток организма человека. Он необходим для опознавания клетки натуральным киллером и Т-киллером (рис. 1, 2). Если по какой-то причине МНС I изменен, несет на себе антиген или отсутствует, клетка будет подвергнута апоптозу. МНС II находится на поверхности В-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток. Он необходим для презентации антигена Т-хелперам (рис. 1, 2). Жизнь пула Т-хелперов можно представить как прогулку с ребенком в зоопарке, только вместо животных — антигены, вместо ребенка — Т-хелпер, а вместо взрослых, объясняющих, кто есть кто, — три перечисленных типа клеток.

Рисунок 2. Процесс передачи сигнала Т-киллеру и Т-хелперу. Первый этап — сборка комплекса МНС-антиген, второй этап — презентация комплекса на поверхности клетки.

Первый этап проникновения вируса в клетку — взаимодействие вирусного белка gp120 (рис. 3) с рецептором CD4. Отсюда понятно, почему ВИЧ размножается именно в Т-хелперах. Взаимодействию способствуют корецепторы CCR5 и CXCR4 [8]. В норме они являются рецепторами цитокинов, а при взаимодействии ВИЧ с клеткой их связь является необходимым условием проникновения вируса внутрь. Мутации в генах этих рецепторов обеспечивают частичную устойчивость носителей таких мутаций (таких людей около 2%, причем некоторые штаммы вируса все равно могут их поражать) [9]. Затем в мембрану клетки погружается белок gp41, после чего мембрана вируса сливается с клеточной, и происходит распаковка генетического материала. По принципу обратной транскрипции с РНК-матрицы вируса с помощью фермента ревертазы (обратной транскриптазы) синтезируются молекулы кДНК (комплементарной ДНК). Синтезированная кДНК вставляется вирусной интегразой в геном клетки хозяина. После попадания в геном хозяина вирус может никак себя не проявлять до нескольких лет — протекает так называемый инкубационный период. Только когда клетки активно пролиферируют, а значит, синтезируют белки на матрице ДНК, начинается сборка вирусных частиц , выход их из клеток и гибель последних (так как каждая частица забирает с собой часть клеточной мембраны клетки, вирусы попросту разрывают клетку).

Рисунок 3. Строение ВИЧ. Белки gp120 и gp41 участвуют в рецепции вируса клеткой и проникновении вирусной частицы внутрь. Липидная оболочка захватывается от клетки хозяина вместе с частью мембранных белков. Белки матрикса синтезируются в клетке после встраивания кДНК в геном в момент наработки клеточных белков для деления. Протеаза, возможно, необходима для разрезания противоапоптотического фактора Bcl-2 [9]. Ферменты обратная транскриптаза и интеграза создают кДНК на матрице РНК и встраивают кДНК в геном Т-хелпера соответственно. Tat — белок, вовлеченный в индукцию апоптоза. Нуклеокапсид — комплекс из РНК и белков вируса, представляющий собой компактную упакованную форму генома. Капсид — белковая оболочка, защищающая содержимое от воздействия внешних условий.

Как иммунитет бактерий правит геномы

Система редактирования геномов CRISPR/Cas известна уже довольно давно (впервые локус описал в 1987 году Есизуми Исино из университета Осаки), но только недавно (в 2005 году) ученые поняли ее истинное предназначение [11], [12].

Как вы уже поняли, система состоит из двух компонентов: CRISPR-локуса (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats или сгруппированные и регулярно разделенные короткие палиндромные повторы) и белков Cas, которые, являются нуклеотид-специфичными эндонуклеазами (а название получили за работу в команде с CRISPR — Crispr associated).

Помимо CRISPR-локуса и блока генов Cas в ДНК бактерии (не обязательно в нуклеоиде [12]) находится ген tracrРНК (transactivated crispr RNA), частично комплементарной палиндромам.

Для формирования специфичной устойчивости к вирусу бактерия, как и человек, должна встретиться с ним дважды.

Первый раз после внедрения вирусной ДНК в клетку происходит разрезание ДНК белками Cas1 и Cas2 на протоспейсеры и встраивание их в начало CRISPR-локуса. Cas1 и Cas2 формируют при этом комплекс, причем Cas2 играет только структурную роль, удерживая ДНК, тогда как Cas1 встраивает ее. Каждый протоспейсер вставляется в CRISPR-локус так, чтобы от другого (уже имеющегося) спейсера его отделял палиндром.

Соответственно, после транскрипции ДНК всего комплекса образуются три продукта (рис. 4):

tracrРНК;
РНК белка Cas (наиболее изученным является Cas9, поэтому далее повествование пойдет о нем), далее транслирующаяся;
pre-crРНК (poly-spacer precursor crRNA или многоспейсерный предшественник crРНК), которая представляет собой транскрипт спейсеров, разделенных образовавшимися из палиндромов шпильками или петлями.

Рисунок 4. Строение CRISPR-локуса и результат транскрипции. leader — лидерная последовательность, отвечающая за начало транскрипции, со стороны которой вставляется новый спейсер. repeat — палиндромный повтор, который после транскрипции превращается в шпильку или петлю.

Второй этап — образование комплекса pre-crРНК/Cas9/РНКаза III. Очевидно, что вся длинная pre-crРНК не может участвовать в опознавании инвазивной ДНК, так как, во-первых, очень длинна, что конформационно неудобно, а во-вторых, при сравнении спейсеров РНК с протоспейсерами инвазивной ДНК длинный транскрипт начнет путаться и в итоге образует клубок, непригодный для дальнейшей работы. Самое логичное — разделить длинную последовательность на короткие участки, которые могли бы проверятся на соответствие инвазивной ДНК белком Cas9. И тащить за собой не надо, и не запутается.

С помощью фермента РНКазы III и при участии tracrРНК pre-crРНК разделяется по границам повторов так, что в белково-нуклеиновый комплекс входят один спейсер и один повтор, комплементарно связанный с tracrРНК (рис. 5) [13]. Повтор полностью теряет свою вторичную структуру, tracrРНК же оставляет несколько шпилек (обычно три).

Рисунок 5. Белково-нуклеиновый комплекс после созревания транскрипта. crРНК состоит из спейсера (слева) и повтора, соединенного с частью tracrРНК (справа). Три петли на tracrРНК нужны для удержания ее эндонуклеазой Cas9.

комплементарность спейсера комплекса Cas9/crРНК/tracrРНК протоспейсеру инвазивной (например, вирусной) ДНК;
наличие в геноме вируса около протоспейсера последовательности из трех нуклеотидов — РАМ (Protospacer Adjacent Motif, прилежащий к протоспейсеру мотив).

Таким образом клетка страхуется от уничтожения своей ДНК. Но даже просто разрезанная в одном месте вирусная ДНК может представлять опасность, поэтому завершает инактивацию негомологическое сращивание концов (non-homologous end joining, NHEJ). При этом происходит инсерция/делеция одного или нескольких нуклеотидов, что приводит к потере инфекционности.

Рисунок 6. Полная схема механизма работы CRISPR/Cas9 системы. а — Транскрипция CRISPR локуса с образованием pre-crРНК. б, в — Разрезание РНК РНКазой III и образование комплексов Cas9/tracrРНК/crРНК. г — Вторичное проникновение в клетку чужеродной ДНК. д — Соединение комплекса с инвазивной ДНК. е — Образование двухнитевого разрыва в протоспейсере.

А где же тут редактирование геномов? А вот где:

во-первых, таким образом можно просто нокаутировать целевой ген и добиться прекращения экспрессии того или иного белка;
во-вторых, после создания двухцепочечного разрыва в образовавшуюся брешь можно вставить нужный нам ген и заставить организм синтезировать нужный нам белок.

Рисунок 7. Сравнение искусственной (а) и естественной (б) систем CRISPR/Cas9. Отличие состоит лишь в том, что искусственная РНК едина, а природная — состоит из двух частей, гены которых разделены.

Битва века

Однако вернемся к теме этой статьи.

Так как система редактирования геномов может помочь в избавлении от ВИЧ? Очень просто: вирус можно вырезать! Нацелив Cas9, путем создания sgРНК с последовательностью, комплементарной вирусной кДНК.

Некоторое время назад группа ученых из немецкого Института экспериментальной вирусологии и иммунологии уже пыталась использовать инструмент редактирования геномов для удаления ВИЧ из культуры HeLa [15]. Они модифицировали Cre-рекомбиназу методом направленной эволюции и один из полученных вариантов использовали для удаления вируса путем контролируемой рекомбинации [16]. Однако надо учитывать, что между Т-хелперами и опухолевой HeLa есть немало различий, к тому же, авторы не предлагают вариантов доставки или экспрессии гена Tre-рекомбиназы (усовершенствованный вариант фермента Cre).

С другой стороны, группа американских исследователей опубликовала в марте этого года статью [17], где подробно описывались метод доставки и механизм удаления вируса. Ученые ставили перед собой задачу не только полностью избавить клеточную культуру Т-хелперов от вируса, но и проверить отсутствие цитотоксического действия самой CRISPR/Cas9 системы. Единственный недостаток этого геномного инструмента в том, что из-за сравнительно небольшой длины спейсера, даже при наличии страхующего элемента PAM, в больших геномах могут быть найдены нецелевые сайты, подверженные разрезанию (off-target sites). Именно поэтому исследователи уделяли данной проблеме немало внимания.

Работа проводилась с использованием штамма ВИЧ-1 и клеточной линии Т-хелперов 2D10, зараженной вирусом в покоящейся стадии. Доставка и экспрессия sgРНК/Cas9 осуществлялась с помощью лентивирусного вектора.

Для оценки того, вырезался ли вирус из двух мест встраивания (1-я и 16-я хромосомы), было проведено полногеномное секвенирование. Оно показало, что в клетках, где экспрессировались и гены Cas9, и sgРНК, провирусная ДНК отсутствует.

Был проведен анализ того, могут ли гены, куда встроился провирус (RSBN1 и MSRB1), и близлежащие гены нормально транскрибироваться после его вырезания. Ученые показали, что как RSBN1, так и MSRB1 нормально экспрессируются. Соседние гены также не претерпели изменений.

С помощью биоинформатических методов и анализа баз данных было показано, что sgРНК/Cas9 не проявляет активности по отношению к нецелевым сайтам.

Таким образом, можно с уверенностью сказать, что группа Камински впервые успешно удалила ВИЧ из культуры зараженных Т-хелперов. Данное достижение приблизило человечество к победе на ВИЧ. Да, это только культура клеток. Да, до внедрения данной техники в медицину пройдут годы, а может и десятки лет, но данная работа является уникальной в своем роде, ибо ученые не только бросили вызов одному из страшнейших заболеваний на планете, но и смогли победить его — пусть даже масштаб сражения пока невелик.

Перспективы применения данной технологии очевидны: введя пациенту вектор, содержащий гены Cas9 и sgРНК, мы добьемся их экспрессии и полного удаления вируса из клеток. Современная терапия, направленная против ретровирусов, являющаяся основным средством борьбы с ВИЧ, не удаляет вирус из клеток, так как провирус остается встроенным в ДНК хозяина. В свою очередь, данный подход не оставляет вирусу шансов укрыться.

Читайте также: