Какой метод окраски будет использован для выявления спор ботулизма

Нарушение дыхания, как причина смерти при ботулизме. Лабораторная диагностика ботулизма (выявление ботулинистического токсина, выделение Clostridiumbotulinum, ПЦР, ИФА, тест на мышах). Интенсивная терапия.

Ботулизм это тяжелое токсико-инфекционное заболевание (пищевая

Токсико-инфекция), характеризующееся поражением нервной системы, преимущественно продолговатого и спинного мозга, протекающее с преобладанием офтальмоплегического и бульбарного синдромов,

преимущественным поражением экзотоксином, продуцируемым анаэробным, спорообразующим возбудителем (Clostridium botulinum) в анаэробных условиях (создающихся в консервированных пищевых продуктах и копченостях, а также кишечнике маленьких детей и раневых тканях) – центральной нервной системы. Ботулизм зоонозная инфекция с глобальным распространением преимущественно в животноводческих регионах.

Осложнения ботулизма

· острая дыхательная недостаточность

· гнойный трахеобронхит и вторичная аспирационная пневмония

· нозокомиальные инфекции (вследствие длительной госпитализации, пребываний на ИВЛ, катетеризаций и т.д.)

· сывороточная болезнь (после введения гетерологичной сыворотки)

Критерии тяжести

Ø легкая форма: малая выраженность клинической симптоматики (изолированная офтальмоплегия или гастроэнтерит)

Ø среднетяжелая форма: неврологические проявления выражены, но отсутствуют признаки ОДН и не нарушено глотание

Ø тяжелая форма: признаки ОДН и, в любой степени выраженности, нарушение глотания

Проявления нарушений черепных нервов – поражаются III, IV, VI, VII, IX, X, XII ч.н.

· Нечеткость зрения, потеря зрения вблизи

· Двоение в глазах - диплопия

· Маскообразное лицо - без выражений, птоз, без морщин и складок

Параличи черепных нервов

· Двухсторонний средний птоз

· Больной в покое

· Минимально ассимметричная улыбка

· Отсутствие периорбитальных морщин при улыбке

Нарушение дыхания

Грозным признаком, свидетельствующим о неблагоприятном течении болезни, является нарушение дыхания.

Больные ощущают нехватку воздуха, тяжесть в груди, дыхание становится поверхностным, исчезает кашлевой рефлекс - развивается парез дыхательной мускулатуры, что выражается в отсутствии диафрагмального дыхания, подвижности межреберных мышц.

Дыхательная недостаточность вследствие пареза дыхательных мышц усугубляется воспалительными инфильтратами в легких.

Причиной смерти больных при ботулизме является острая дыхательная недостаточность.

Лабораторная диагностика ботулизма:

· Исследования ОАК не выявляют особых отклонений от нормы.

· Для подтверждения диагноза решающее значение имеют обнаружение и идентификация ботулинического токсина в сыворотке крови больных, рвотных массах или промывных водах желудка, а также в пищевых продуктах, при употреблении которых могло произойти отравление.

Обнаружение ботулинического токсина в крови является абсолютным подтверждением этиологии заболевания.

- Наблюдение за мышами в течение 48 часов с целью выявить или симптомы ботулизма или смерть;

- Обычно проявления ботулизма у мышей начинаются в течение 24 часов

- Шерсть становится взъерошенной

- Появляются приступы затруднения дыхания

- Наступает общий паралич с затрудненным дыхание последующей смертью из - за дыхательной недостаточности

- Гибель мышей без клинической симптоматики ботулизма не является подтверждением того, что исследуемый материал содержит ботулотоксин

- Гибель мышей может наступить из - за посторонней микрофлоры, воздействия других токсических веществ, а также травмы

- Поэтому нередко постановку теста приходится повторять в тех случаях, когда мы не можем точно определить от чего наступила гибель мышей.

· Для выделения возбудителя ботулизма производят посевы содержимого желудка, испражнений, подозрительных продуктов на анаэробные питательные среды (Китта -Тароцци, казеиновогрибную, бульон Хотингера и др.).

· ИФА диагностика ботулизма

- Методом ИФА выявляется антиген бутулотоксина сыворотке крови больных, рвотных массах или промывных водах желудка, а также в пищевых продуктах, из культуры тканей умерших больных. Исследование ИФА занимает одни сутки, но требует до 5 дней инкубации посевов для накопления токсина.

-ИФА более чувствителен чем тест на мышах.

-Параллельно с ними проводят тест на мышах, которые

подтверждает данные ИФА * (минимальная смертельная доза)

· ПЦР диагностика ботулизма

- ДНК живого микроорганизма могут быть определены методом ПЦР. Исследование занимает 1 день проведения анализа после инкубации спор или вегетативной формы С. botulinum.

-Исследование в ПЦР должно быть подтверждено в тесте на мышах.

- -ПЦР дает возможность определить субтипы С. botulinum.

-ПЦР позволяет индентифицировать тип А, В, Е и F токсигенной 24 часовой культуры C.Botulinum.

-ПЦР - это быстрая, чувствительная и специфичная реакция для идентификации токсигенных штаммов C.Botulinum.

Интенсивная терапия:

Терапия при ботулизме во всех случаях должна быть неотложной, а наблюдение за больными постоянным, обеспечивающим профилактику осложнений и готовность к немедленной дыхательной реанимации.

1.Всем больным, независимо от сроков заболевания, уже на догоспитальном этапе показано промывание желудка через зондв начале кипяченой водой, а затем 2-5% раствором натрия гидрокарбонатаи очистительная клизма с5% раствором натрия гидрокарбоната.

2. После промывания желудка больным следует дать внутрь или ввести через зонд энтеросорбенты.

3. Одновременно вводят поливалентную антитоксическую противоботулиническую сыворотку по Безредко. Введение антитоксических сывороток является обязательным и главным компонентом неотложной терапии больных ботулизмом.

Одна лечебная доза которых составляет по 10 тыс. ME антитоксинов типов А, С и Е,

5 тыс. ME –типа В и 3 тыс. ME –типа F.

При среднетяжелом течении 2 лечебные дозы, больным с тяжелой клинической картиной заболевания 3 лечебные дозы .

Если тип токсина известен, назначают моновалентную антитоксическую сыворотку.

Критерием эффективности антитоксических сывороток является обратное развитие клинических проявлений болезни. При положительном терапевтическом эффекте (обратное развитие неврологических расстройств) можно ограничиться однократным введением сыворотки.

Перед введением сывороток обязательно ставят внутрикожную пробу к гетерогенному (лошадиному) белку. При положительной внутрикожной пробе антитоксическую сыворотку вводят по жизненным показаниям, под прикрытием десенсибилизирующих средств (глюкокортикоиды, антигистаминные препараты).

4. С целью неспецифической дезинтоксикации осуществляют инфузионно - дезинтоксикационную терапию. Для этого ежедневно внутривенно вводят глюкозо-солевые растворы с одновременной стимуляцией диуреза (фуросемид, лазикс по 20-40 мг). По показаниям реополиглюкин, СЗП.

А. Бактериологический (по классической схеме с последующей

биологической пробой – см. ниже).

Б. Биологический

Для обнаружения токсина и его типа в реакции нейтрализации.

Для обнаружения токсина двум мышам вводят исследуемый фильтрат в количестве 0,5 мл внутрибрюшинно, другим двум мышам вводят смесь, состоящую из 0,5 мл фильтрата и 0,2 мл смеси диагностических моновалентных противоботулинических сывороток типа А, В, С, Е (соединяют по 0,5 мл сыворотки каждого типа). Перед введением смесь испытуемого материала и сывороток выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут. Наблюдение за животными ведут в течение 4 дней. При наличии токсина погибают первые две мыши, остальные остаются живы.

При обнаружении токсина ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа токсина. Для этого в 5 пробирок разливают по 2,4 мл испытуемого фильтрата и в каждую пробирку прибавляют по 0,6 мл сыворотки раздельно типа А, типа B, типа С и типа Е. В 5-ю пробирку прибавляют 0,6 мл физиологического раствора. Смесь после 30 минут выдерживания при комнатной температуре вводят внутрибрюшинно по 1 мл 2 мышам из каждой пробирки отдельными шприцами. Наблюдают за животными в течение 4 дней. При наличии токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологичной сыворотки, остальные мыши гибнут. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина.

В. Ускоренные методы диагностики ботулизма

а) обнаружение токсина с помощью РПГА (на эритроцитах адсорбируют антитоксин)

б) обнаружение токсина с помощью реакции угнетения фагоцитоза. Ботулинический токсин резко угнетает фагоцитарную способность лейкоцитов в связи с наличием у токсина лейкотоксических свойств. При этом фагоцитарный показатель уменьшается в 3, 5, 10 и даже 20 раз. При добавлении к крови, содержащей токсин, гомологичной антитоксической сыворотки фагоцитарная способность лейкоцитов восстанавливается.

ЗАНЯТИЕ № 11

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА АНАЭРОБНЫХ ИНФЕКЦИЙ (газовая анаэробная инфекция)

План занятия

1. Морфология анаэробных бактерий. Микроскопия препаратов-мазков из культур патогенных анаэробов.

2. Изучение особенностей роста культур анаэробов на различных питательных средах.

3. Микробиологический диагноз анаэробных инфекций. Разбор методов диагностики газовой гангрены. Посев исследуемого материала по способу Вейон-Виньяля, Фортнера, на среду Китта-Тароцци. Регистрация результатов посева материала, содержащего анаэробные микробы, макро- и микроскопия выросших культур.

4. Ускоренное обнаружение С. реrfringens. Демонстрация роста на среде Вильсон-Блера, среде Китта-Тароцци и на молочной среде.

5. Демонстрация иммунопрепаратов, применяемых для профилактики и лечения анаэробных инфекций.

Методические указания

1. Морфология анаэробных бактерий. Микроскопия препаратов-мазков из культур патогенных анаэробов.

Готовые препараты-мазки из чистых культур патогенных анаэробов окрасить по Граму, промикроскопировать. Препараты зарисовать. Обратить внимание на характер расположения спор, отношение к окраске.

2. Изучение особенностей роста культур анаэробов на различных питательных средах.

Демонстрация роста анаэробов на средах Виллиса-Хоббс, Китта-Тароцци, Вильсон-Блера, Цейсслера, на молоке.

3. Микробиологический диагноз анаэробных инфекций. Разбор методов диагностики газовой гангрены.

Для выделения чистых культур анаэробов берется раневое отделяемое. Исследование начинается с предварительной микроскопии исходного материала. Для этого готовят мазки и окрашивают по Граму. Обратить внимание на наличие капсул. Препараты зарисовать.

Посев производится на регенерированную, то есть предварительно прогретую на кипящей водяное бане в течение 10-20 мин для освобождения от растворенного в ней кислорода, среду Китта-Тароцци. Пастеровской пипеткой взять каплю гноя и, наклонив пробирку со средой Китта-Тароцци, по верхней стенке осторожно ввести каплю гноя на дно пробирки так, чтобы не попал воздух.

Зарегистрировать результаты посева материала, содержащего анаэробные микроорганизмы. Приготовить препарат-мазок, окрасить по Граму и зарисовать.

Посев раневого отделяемого на среду Вильсон-Блера. Среда Вильсон-Блера предварительно расплавляется и выдается студентам в пробирках. Перед посевом ее необходимо охладить до температуры 40-45°С. Раневое отделяемое предварительно развести в стерильном физиологическом растворе. Для этого каплю исследуемого материала внести в пробирку с физиологическим раствором. Затем после перемешивания из этой пробирки каплю внести в пробирку со средой Вильсон-Блера, тщательно перемешать путем вдувания и выдувания содержимого и быстро набрать среду в трубки Вейон-Виньяля. Трубки положить в горизонтальном положении и дать им остыть. Концы трубок закрыть ватой.

6. Демонстрация препаратов, применяемых для профилактики и лечения анаэробных инфекций.

Рис.1. С. реrfringens Окраска по Граму

Рис.2. Анаэробы в раневом отделяемом Окраска по Граму

Рис.3. С. novi Окраска по Граму

Контрольные вопросы

1. Каковы основные биологические свойства анаэробных бактерий?

2. Какова роль анаэробных бактерий в патологии человека?

3. Какие заболевания вызывают анаэробные бактерии?

4. Каков механизм заражения при газовой гангрене?

5. Что является средой обитания анаэробных бактерий в естественных условиях?

6. Какие возбудители чаще всего вызывают газовую гангрену?

7. Какие токсины образуют возбудители газовой гангрены и на что они действуют?

8. Каковы особенности патогенеза газовой гангрены?

9. Какие условия способствуют развитию газовой гангрены?

10. По каким основным признакам различаются между собой C. perfringens, C. novyi, C. septicum, C. histolyticum?

11. Какие ускоренные методы применяются для обнаружения C. perfringens?

12. Какие микробиологические методы используются для диагностики анаэробных инфекций?

Возбудитель - Clostridium botulinum входит в семейство Bacillaceae, род Clostridium.

Материалом для микробиологического исследования являются рвотные массы, промывные воды желудка, кал, кровь, моча, остатки пищевых продуктов. При летальном исходе исследуют содержимое желудка, кишечника, лимфатические узлы, головной и спинной мозг.

Используют методы микробиологической диагностики: бактериологический, биологический (для выявления ботулотоксина в исследуемом материале).

С целью выявления ботулотоксина можно использовать также РОПГА с антительным диагностикумом (эритроциты, сенсибилизированные антитоксинами соответствующих типов) и определение активности фагоцитов (ботулинический токсин способен подавлять активность фагоцитов, которая восстанавливается в присутствии соответствующей антитоксической сыворотки).

Бактериологический метод. Исследуемый материал растирают в стерильной ступке с физиологическим раствором хлорида натрия.

Посев материала выполняют на специальные питательные среды, например, среду Китта-Тароцци.

Одну пробу засевают в 4 пробирки, две из которых прогревают при температуре 60°С 15 мин. (для селекции C. botulinum типа Е), а остальные - при температуре 80°С 20 мин. Накопление культур клостридий типа Е и F происходит при температуре 28°С, типа А, В, С - при 35°С в течение 48 часов.

Для идентификации чистой культуры возбудителя определяют сахаролитические и протеолитические свойства. Антигенные свойства изучают в реакции агглютинации с типовыми сыворотками. Одновременно с изучением ферментативных свойств возбудителя выявляют ботулотоксин в фильтрате бульонной культуры и определяют его тип в реакции нейтрализации.

Биологический метод. Выявление ботулотоксина и определение его типа с помощью реакции нейтрализации имеет важное значение для назначения специфической терапии.

Для проведения реакции нейтрализации используют сухие диагностические антитоксические сыворотки типов А, В, С, Е, F, которые разводят физиологическим раствором до 100-200 МЕ / мл, что обеспечивает нейтрализацию гомологичного токсина в исследуемой пробе.

Реакцию нейтрализации проводят либо со смесью сывороток (предварительная реакция), либо с моновалентными сыворотками для определения типа токсина.

Сахаролитические и протеолитические свойства Clostridium botulinum типов А, В, С, D, Е, F

КГ - образование кислоты и газа

(КГ) - кислота и газ не у всех штаммов

+ - разжижение или пептонизация, положительная реакция

Если в исследуемом материале есть ботулинический токсин, выживает только одна пара мышей, у которых произошла нейтрализация ботулинического токсина антитоксической сывороткой соответствующего типа.

Определение фагоцитарного показателя. Ботулинический токсин подавляет фагоцитарную активность лейкоцитов. Это свойство используют для выявления его в крови больных и в пищевых продуктах. Исследования проводят следующим образом: кровь больного смешивают в пробирке с 3% раствором цитрата натрия в соотношении 2:1. Опыт выполняют в двух пробирках с использованием поливалентной противоботулинической сыворотки. Если используют типовые сыворотки А, В, С, Е, F, соответственно, количество пробирок для исследования увеличивается. После смешивания взятых ингредиентов, пробирки помещают в термостат на 30 минут для нейтрализации токсина. В пробирки вносят по одному объему 2 млрд. суспензии Staphylococcus aureus и снова помещают в термостат на 20 минут для завершения фагоцитоза. После этого из содержимого каждой пробирки готовят мазок, фиксируют, окрашивают азурэозином и определяют фагоцитарный показатель (фагоцитарный показатель - количество стафилококков, поглощенных в среднем одним лейкоцитом. Для его определения подсчитывают микроорганизмы в 50 лейкоцитах и полученное число делят на 50.

Если в крови больного содержится ботулинический токсин, фагоцитарный показатель крови будет низким, за исключением фагоцитарного показателя той порции, в которой тип токсина соответствует типу добавленной в нее сыворотки, то есть произойдет реакция нейтрализации токсина соответствующими антителами, и фагоцитарный показатель будет значительно выше.

РОПГА с антительным эритроцитарным диагностикумом.

Сущность реакции заключается в том, что эритроциты сенсибилизируются специфическими антителами, и гемагглютинация происходит при наличии в исследуемом материале антигена. Ее высокая чувствительность и специфичность позволяет найти в исследуемом материале микро количество токсинов. Диагностический титр 1:10.

Ботулизм развивается из-за попадания в организм ботулотоксина, который относится к одному из наиболее ядовитых биологических веществ. Выделяется токсин в процессе жизнедеятельности спорообразующей палочки, размножающейся в безвоздушной среде.

Попадает инфекция в организм человека при употреблении консервов домашнего приготовления, поскольку яд длительное время существует в рассолах, консервах и пищевых продуктах, содержащих различные специи. Пищевая токсикоинфекция поражает нервную систему, что может привести к остановке дыхания или сердцебиения, поэтому каждый, кто любит домашние консервы, должен знать, как определить ботулизм.

Что позволяет заподозрить развитие ботулизма

Диагностика ботулизма начинается с изучения эпидемиологического анамнеза и клинической картины заболевания. Инфекция передается фекально-оральным путем, то есть вместе с продуктами питания, недостаточно отчищенными от почвы. В подавляющем большинстве случаев, причиной болезни выступает употребление приготовленных в домашних условиях консервированных продуктов, которые были загрязнены спорами клостридий.

Токсин может находиться в банках с огурцами, помидорами, грибами и любыми другими продуктами, содержащими рассол. Необходимым условием для размножения бактерии является отсутствие кислорода, поэтому они накапливаются только в плотно закрытых банках. Если заболевший ел в течение последних 10 дней консервированные овощи, грибы, мясные изделия или соленую рыбу, то есть вероятность, что он заразился токсикоинфекцией.

Люди высоковосприимчивы к ботулотоксину, а значит, даже небольшие его дозы способны приводить к появлению клинических симптомов. Затрудняет диагностику ботулизма то, что не все, кто ел продукты из банки, заражаются, поскольку токсин концентрируется в определенном месте и достаточно минимального количества, чтобы развилась патология.

Вместе с тем часто бывают случаи семейного поражения ботулизмом после употребления долго хранившихся консервированных продуктов. В редких случаях заражение ботулотоксином происходит при контакте обсемененной жидкости с ранами и гнойниками, развивается так называемый раневый ботулизм. Поэтому нельзя даже открывать подозрительную банку с консервами.

Токсин в начале заболевания может спровоцировать развитие гастроэнтерологического, глазного синдрома или острую дыхательную недостаточность. Чаще всего развивается гастроэнтерологический вариант, который протекает, как пищевая токсикоинфекция. Больной ощущает боль в верхней части живота, появляется тошнота, рвота, диарея, кожа быстро становится сухой из-за потери жидкости, нередко заболевшие говорят о том, что стало больно глотать.

В продромальный период ботулизма, протекающего по глазному варианту, больные жалуются на нарушение зрения (появление черных точек, затуманивание, утрата четкости и остроты зрения, развитие острой дальнозоркости). Даже на начальном этапе болезни может возникнуть острая дыхательная недостаточность, которая способна приводить к летальному исходу в течение 3–4 часов, поэтому если внезапно появилась и увеличивается отдышка, кожа и слизистая оболочка становятся синюшными, то срочно необходима медицинская помощь.

В разгар болезни появляются специфические для ботулизма симптомы: парезы и параличи мышц различных групп. У больных возникает офтальмоплегия (паралич мышц глаз), что может проявляться расширением зрачков, косоглазием, вертикальным нистагмом, опущением века.

Из-за пареза мышц глотки развивается дисфагия (нарушение глотания), что приводит к невозможности проглатывания пищи и жидкости. Ботулотоксин провоцирует и ослабление иннервации мимических мышц, что проявляется в асимметрии лица. Походка больных неустойчива, отмечается общая слабость. Парез мышц кишечника приводит к развитию запора.

Последовательно нарушается речь. Сначала у больного изменяется голос из-за сухости слизистой голосовых связок. Когда развивается парез мышц языка, человек не может внятно говорить. По мере прогрессирования болезни возникает парез мышц небной занавески, что делает голос гнусавым, а когда ослабевают голосовые связки, голос исчезает вовсе.

Таким образом, заподозрить развитие ботулизма можно, если больной недавно употреблял консервированные продукты, а симптомы указывают на нарушение иннервации различных групп мышц (глазных, лицевых, голосовых). При подозрении на ботулизм необходимо срочно обратиться к врачу. Специалисты проведут дифференциальную диагностику, а с помощью микробиологии будет подтверждено или опровергнуто присутствие яда в организме.

Как подтверждается диагноз

Дифференциальная диагностика проводится на начальном этапе заболевания, когда клиническая картина еще не включает специфические симптомы ботулизма. Первые признаки болезни, такие как понос, рвота, тошнота, слабость характерны для многих кишечных инфекционных заболеваний и пищевых отравлений.

Паралич глазных мышц может возникнуть в результате новообразования, отравления свинцом, алкоголем, барбитуратами, поражения головного мозга (ЧМТ, инсульт, энцефалит), заражения столбняком, дифтерией и прочими инфекционными болезнями. Дыхательная недостаточность развивается при заболеваниях бронхолегочной системы и поражениях ЦНС.

Диф. диагностика ботулизма требует исключение:

миастении;
вирусного энцефалита;
дерматомиозита;
синдрома Гийена-Баре;
синдрома Вернике;
полиомиелита;
отравления грибами или атропином.

Лабораторные методы

Специфическая лабораторная диагностика ботулизма на начальной стадии болезни не разработана, поэтому дифдиагностика основывается на данных эпидемиологического анамнеза (употреблении консервированных продуктов, алкоголя, получения черепно-мозговой травмы).

По мере развития ботулизма появляются характерные симптомы, которые и помогают дифференцировать болезнь (сохранность сознания и чувствительности, отсутствие жара и лихорадки, мышечные параличи). Дальнейшая диагностика проводится для определения типа токсина (А, В, С, Е, F) и подтверждения диагноза. При подозрении на ботулизм у больного берут анализ крови и мочи, и хотя исследования не являются специфичными, но они помогают установить тяжесть течения болезни.

Микробиологическая диагностика ботулизма позволяет обнаружить токсин в рвотных массах, кале, крови, моче, промывных водах желудка, остатках продуктов. Для определения вида яда используют бактериологический и биологический метод, а также устанавливают фагоцитарный показатель.

При использовании бактериологического метода взятый материал смешивают в стерильной емкости с физиологическим раствором хлорида натрия. Затем высевают материал на питательную среду в четыре пробирки. Два образца нагревают при температуре 60 ⁰С в течение 15 минут, что позволит обнаружить бактерию типа Е.

А остальные две пробирки нагревают 20 минут при 80 ⁰С. Размножаются бактерии типа Е и F при 28 ⁰С, а типа А, В, С при 35 ⁰С за 48 часов. Через 1–2 суток оценивают характер роста и проводят окрашивание мазков по Граму. После выделения чистой культуры изучают ее антигенные свойства с помощью реакции агглютинации с типовыми сыворотками.

Биологический метод предполагает определение типа токсина с помощью реакции нейтрализации, что важно для специфического лечения. Для обнаружения реакции нейтрализации применяют сухие диагностические антитоксические сыворотки, которые смешивают с физиологическим раствором. Если сыворотка действует, то в исследуемой пробе токсин нейтрализуется.

Материал для исследования помещают в 6 пробирок, в пять из них добавляют противоботулинические сыворотки типа А, В, С, Е, F, а в шестую нормальную сыворотку. Пробирки опускают в термостат на 30 минут, а затем вводят по 1 мл жидкости белым мышам. Грызуны, которым была введена подходящая противоботулиническая сыворотка, не погибают.

Ботулинический токсин снижает фагоцитарную активность лейкоцитов. Для выявления данного свойства кровь предполагаемого больного смешивают с цитратом натрия, в пробирки добавляют поливалентную или типовую сыворотку и помещают в термостат на полчаса, для уничтожения токсина. Затем в исследуемый материал вводит стафилококк и опять опускают в термостат на 20 минут для окончания фагоцитоза.

Делают мазок из каждого образца и подсчитывают количество стафилококков, захваченных в среднем одним лейкоцитом. Если в крови присутствовал ботулинический токсин, то фагоцитарный показатель низкий. Если же добавлялась типовая сыворотка в пробирки, то там, где сыворотка соответствовала токсину, произойдет нейтрализация и фагоцитарный показатель будет существенно выше.

В разгар заболевания можно обнаружить токсин в крови с помощью РОПГА с антительным эритроцитарным диагносикумом. Дело в том, что эритроциты сенсибилизируются специфическими антителами и склеивание происходит, если в образце материала присутствуют антигены. Тест позволяет обнаружить даже минимальное количество токсина в исследуемом материале, поскольку обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

В кровь, взятую из вены, добавляют антитела, которые помечены ферментами. На них реагируют бактериальные антигены и образуют с ними иммунные комплексы, что вызывает изменение цвета материала. Специалисты по интенсивности окраски делают вывод о присутствии в образце специфических антител к ботулистическому токсину.

Метод дот-иммуноанализа позволяет распознать ботулизм уже через три часа после получения для исследования материала. С помощью теста можно проверить на токсины не только кровь, но и продукты питания, которые предположительно стали источником инфекции.

На нитроцеллюлозный мембранный фильтр, на котором находятся меченные противоботулиническе антитела, наносится исследуемый материал. После этого, фильтр обрабатывают специальным составом, который темнеет, если в жидкостях присутствует токсин. Концентрация яда определяется при сравнении с контрольной школой.

Лабораторная диагностика ботулизма подтвердит или опровергнет заболевание, что необходимо для назначения адекватного лечения, которое заключается в приеме противоботулинической сыворотки. На сегодняшний день не составляет труда определить присутствие в крови ботулотоксина, но заболевание развивается стремительно, поэтому необходимо знать, как распознать болезнь, чтобы вовремя обратиться к врачу.

Нанотехнологии в медицине
Экспресс-диагностика токсинов ботулизма c помощью микрочипов

П.Ляхов, под редакцией П.Горелова
Москва 2014
Введение

Ботулизм - опасное для жизни человека инфекционное заболевание. В случае несвоевременной диагностики инфекции летальный исход возможен в 60 % случаев. Болезнь развивается стремительно – нередко всего за несколько часов после попадания возбудителя в организм человека, поэтому очень важно на ранней стадии поставить точный диагноз.
Поскольку традиционные лабораторные методики диагностики занимают больше одного дня, большой интерес представляют новые приборы, выполняющие экспресс-анализ с помощью микрочипов. В частности, анализатор токсинов и патогенов ePaTOX II позволяет определить ботулинический токсин типа A, В, Е и F в течение 20 минут, провести своевременные мероприятия по его нейтрализации и облегчить страдания больных.

Павел Ляхов. "Shadows of the Past". Холст, масло. 73,5х81 см. 2006 г.

Ботули́зм (от лат. botulus — колбаса) — тяжелое токсико-инфекционное заболевание, характеризующееся поражением нервной системы (преимущественно продолговатого и спинного мозга). Источником заражения могут быть пищевые продукты, вода, аэрозоли, содержащие ботулотоксин, который продуцируется спорообразующей палочкой Clostridium botulinum. Несмотря на то, что случаи заболевания ботулизмом регистрируется реже, чем другие кишечные инфекции и отравления, болезнь продолжает оставаться опасной для жизни человека 1.

Отравление токсином возможно только при употреблении продуктов, в которых в анаэробных условиях произошло размножение Cl.botulinum и накопление токсина. Обычно такие условия возникают при несоблюдении санитарных норм приготовления пищи. Часто источником токсина становятся консервы домашнего производства [5].

Известно семь типов возбудителя — А, В, С (подтипы С1 и С2), D, Е, F и G, различающиеся по антигенной структуре выделяемого экзотоксина [6]. Вспышки ботулизма чаще всего вызваны токсином типа А, реже – типами В, С, E и F. Токсин D вызывает заболевания только у животных и водоплавающих птиц [1].

Симптомы заболевания ботулизмом проявляются внезапно – это сухость во рту, слабость в мышцах, нарушение зрения, затруднение глотания, изменение высоты и тембра голоса, учащенное дыхание. Болезнь развивается стремительно и может продлиться от одного до двух месяцев. Летальные исходы возникают в основном вследствие дыхательной недостаточности. Инкубационный период протекает от нескольких часов до 2-5 дней, составляя в среднем 18-24 часов.

Павел Ляхов. ИНТЕРЕСНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ Бумага, акварель. 85,8х61 см. 2009 г.

Используемые сегодня методы диагностики ботулизма характеризуются длительностью анализа от 1 до 10 дней, что как минимум в два раза дольше инкубационного периода заболевания. Материалом для бактериологического исследования служат фекалии и рвотные массы больного, промывные воды желудка и кишечника, содержимое ран (при раневом ботулизме), подозреваемая пища [7].

Известны следующие методы диагностики токсина ботулизма [8]:

• клинические – наблюдение за зараженными возбудителем подопытными животными (белыми мышами, морскими свинками, кроликами), взятие крови, гипериммунизация;

• бактериологические – посевы Cl.botulinum на МПА с 2% глюкозой в среду Китта-Тароцци, бульон Хоттингера с 1% глюкозой, выделение чистых культур, получение и наработка бактериальной массы и продуцируемого токсина;

• культурально-морфологические и биохимические – изучение сахаролитических и протеолитических свойств штаммов Cl.botulinum;

• микроскопические – световая и люминесцентная микроскопия;

• серологические – постановка РН, РНГА, ИФА;

• радиобиологические – инактивация возбудителя Cl.Botulinum на гамма-установке "Исследователь" с источником излучения 60 Сo;

• химические – инактивация возбудителя Cl.botulinum и перевод токсинов в анатоксины с использованием 40% раствора формалина;

• диагностика с использованием микрочипов [9].

Диагностика с использованием микрочипов

Наиболее современный метод диагностики ботулизма основан на использовании приборов со специальными микрочипами. В частности, этот принцип реализован в универсальном портативном анализаторе ePaTOX II, который предназначен для высокочувствительного обнаружения белков, токсинов, нуклеиновых кислот и других биомолекул в образцах разных видов. Прибор позволяет определить ботулинический токсин типов А, В, Е и F, и может использоваться как в стационарных лабораториях, так и в переносных системах [9].

Принцип чип-обнаружения в ePaTOX II основывается на электрохимической реакции. Для ее проведения используют микросхемы с наноразмерной структурой электродов, изготовленных на кремнии по современной полупроводниковой технологии.

Биочип содержит 16 точек измерения, заполненных различными рецепторными молекулами. Конфигурация биочипа позволяет параллельно выявлять несколько токсинов или патогенов. Исследуемый образец в ходе анализа автоматически покрывает всю поверхность чипа, что дает возможность молекулам-мишеням связываться с комплементарными рецепторными молекулами (например, с антителами, олигонуклеотидами), которые иммобилизуются на поверхности чипа. Затем следует маркировка энзимов.

Фиксируемый на чипе энзим преобразуется в субстрат, который может быть идентифицирован в результате электрохимической реакции. Электродная структура на чипе позволяет измерять электрический сигнал, величина которого прямо пропорциональна концентрации молекул-мишеней в образце. Электрохимический принцип обнаружения позволяет достичь высокой аналитической точности, а результирующая система не подвержена оптическим помехам, например помутнению. Полное время анализа при обнаружении ботулинических токсинов занимает около 20 минут.

ePaTOX II прост в использовании и комплектуется интуитивно понятным аналитическим программным обеспечением.

Таким образом, современный инновационный метод диагностики ботулизма с помощью анализатора токсинов и патогенов на основе микрочипа позволяет значительно сократить время анализа и своевременно приступить к лечению инфекции, облегчив течение заболевания. Также возможна профилактика путем анализа пищевых продуктов на наличие ботулотоксина, что дает возможность предотвратить заболевание. Чувствительность определения ботулинических токсинов с помощью прибора ePaTOX II

Читайте также: