Лабораторная диагностика стафилококка и стрептококка
Микробиологическая диагностика стрептококковыхинфекцийотражена в схеме 2. Выполняются следующие методы исследования.
Бактериоскопический метод– выявление в мазке из гноя патогенных кокков, располагающихся в виде небольших цепочек. Типичное расположение в виде цепочек характерно для чистых культур стрептококка (рис. 2 цветная вкладка).
| Схема 2. Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций | |
| Материал: гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, кровь, мокрота, моча, ликвор, рвотные массы, испражнения, остатки пищи. | |
| Микроскопический метод. Выявление грамположительных кокков в виде цепочек в мазках из материала от больного. Бактериологический метод. 1. день. Посев материала на чашки кровяным МПА, пробирки или флаконы с сахарным МПБ. 2 день -учет характера роста колоний (на кровяном МПА - зоны гемолиза, в МПБ –равномерное помутнение). В мазке из колоний в окраске по Граму – кокки в виде цепочек. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный МПА для получения чистой культуры. Пересев с сахарного МПБ на кровяной МПА | 3 день - идентификация выделенной культуры стрептококка, дифференциация основных видов, определение чувствительности к антибиотикам. Выделение чистой культуры с кровяного МПА. 4 день.Заключение о виде стрептококка. Идентификация культуры, выделенной из сахарного МПБ 5 день.Заключение о виде стрептококка, выделенного из сахарного МПБ. Серологический метод Реакция нейтрализации (РН) для определения антистрептолизина-О (гемолизина) и антигиалуронидазы в сыворотке крови больных стрептококковыми инфекциями. |
Бактериологический метод.Исследуемый материал засевают на кровяной МПА в чашках Петри. После выращивания в термостате при 37 0 С в течение суток учитывают характер роста колоний (колонии очень мелкие, величиной с булавочную головку, круглые, мутноватые, матовые). Слизистые колонии типичны для свежевыделенных штаммов, стрептококка, матовые – для вирулентных стрептококков с высоким содержанием М-протеина, блестящие – для невирулентных штаммов. На кровяном МПА стрептококки вызывают α–гемолиз (зеленоватая зона вокруг колоний) или β-гемолиз (полностью прозрачная зона гемолиза). Негемолитические стрептококки обычно непатогенны. Из типичных для стрептококка колоний готовят мазок в окраске по Граму и после микроскопии (Streptococcus pyogenes окрашивается по Граму положительно, располагается в виде цепочек) делают пересев в пробирки с сахарным МПБ и кровяным МПА. На 3 день учитывают характер роста (на сахарном МПБ рост стрептококка в виде придонно-пристеночного осадка, сама среда прозрачна), готовят мазок в окраске по Граму и проводят идентификацию выделенной культуры стрептококка по антигенным свойствам. Серогруппу стрептококков определяют в реакциях преципитации, латекс-агглютинации или коагглютинации с целью выявления группоспецифического полисахаридного антигена А, используя группоспецифические сыворотки (обычно групп A, B, C, F, G). Большинство патогенных для человека стрептококков являются β-гемолитическими и относятся к группе A. Серовар выделенной культуры стрептококка выявляют с помощью реакции агглютинации (выявление типового протеинового антигена М, по которому выделяют около 100 сероваров) с типоспецифическими стрептококковыми сыворотками.
Для идентификации β-гемолитических стрептококков применяют PYR-тест (на пирролидониламидопептидазу), CAMP-тест (на белок синергидного гемолиза), тест Фогес-Проскауэра (на образование ацетоина), чувствительность к бацитрацину (0,04 ЕД на диск), галотолерантность (рост в присутствии 6,5% хлорида натрия), гидролиз гиппурата натрия, ферментацию трегалозы, сорбита и т.д. α -гемолитические стрептококки идентифицируют, используя тесты на чувствительность к желчи, оптохину, на гидролиз эскулина и т.д. (табл. 3).
PYR -mecm. В МПБ, содержащий 0,01 % L-пирролидонил- β –нафтиламин, вносят петлю агаровой культуры стрептококка, инкубируют при 37 0 С в течение 4 ч. Положительная реакция характеризуется появлением ярко-красного окрашивания после внесения 1 капли специального реактива.
Таблица 3 .Дифференциальные признаки стрептококков
| Свойства | Микроорганизмы | |||
| S. pyogenes | S. agalactiae | Стрептококки групп C и G | S. bovis | |
| Вид гемолиза | Β | β, α | β | α , |
| Гидролиз гиппурата натрия | - | + | - | - |
| CAMP-тест | - | + | - | - |
| PYR-тест | + | - | - | - |
| Желчно-эскулиновый тест | - | - | - | + |
| Рост в солевом МПБ | - | + | - | - |
| Чувствительность к бацитрацину | + | - | - | - |
| Чувствительность к сульфаметоксазолу и триметоприму | - | - | + | + |
Обозначения:(+) - постоянный признак, (-) – отсутствие признака
Исследование крови.Для выделения гемокультуры посев обычно производят в сахарный бульон. При наличии стрептококка на дне флакона появляется хлопьевидный придонный осадок, а в мазках обнаруживаются длинные цепочки стрептококков. Для выделения чистой культуры и определения характера гемолиза делают пересев в чашку с кровяным агаром. Через сутки (3-й день исследования) появляются типичные мелкие колонии, окруженные зоной гемолиза. Дальнейший ход исследования аналогичен описанному выше.
Генодиагностика. Разработан метод ДНК-ДНК-гибридизации для обнаружения специфических фрагментов ДНК стрептококка в исследуемом материале, что дает основание поставить предварительный диагноз стрептококковой инфекции.
Серодиагностика(определение антител к гемолизину – стрептолизину-О) проводится при подозрении на ревматизм. Сущность реакции заключается в нейтрализации антителами сыворотки крови больного гемолитической активности стрептококкового стрептолизина-О. Титр антистрептолизина-О у здоровых людей – до 250 АЕStO. При ревматизме с первых дней болезни титр антистрептолизина-О составляет 500 АЕStO и выше.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Стрептококковые инфекции продолжают оставаться в числе наиболее острых проблем здравоохранения во всех странах мира. Бактерии рода Streptococcus классифицируют по антигенным свойствам (на основании имеющихся полисахаридов), выделяя серогруппы, изучают биохимические и гемолитические свойства. Наиболее патогенным для человека является Streptococcus pyogenes группы А, вызывающий у человека гнойно-воспалительные и инфекционно-аллергические заболевания. Диагностика стрептококковых инфекций включает использование бактериоскопического метода, определение стрептококковых антигенов в патологическом материале с помощью ИФА или латекс-агглютинации, бактериологического метода идентификации возбудителей инфекции и серологического метода по определению антител к стрептококкам группы А. В последнее время широко распространен метод ПЦР, позволяющий установить диагноз заболевания в 3 раза чаще по сравнению с классическими бактериологическими методами исследований [1, 2, 4]. Эти данные свидетельствуют о необходимости совершенствования микробиологической диагностики стрептококковых инфекций. Стрептококки колонизируют кожные покровы, слизистые оболочки, носоглотку, желудочно-кишечный тракт и влагалище [5]. Для возбудителей инфекции характерна множественность механизмов и факторов передачи, но наиболее характерен воздушно-капельный механизм передачи. У школьников в холодный сезон года носительство стрептококков в носоглотке достигает 25% [6].
В большинстве случаев возникновение стрептококковых инфекций связано с оказанием медицинской помощи (ИСМП). Причинами роста заболеваемости гнойно-воспалительными стрептококковыми инфекциями являются селекция и формирование госпитальных штаммов, обладающих высокой вирулентностью и множественной лекарственной устойчивостью, что требует совершенствования систем надзора и контроля за ИСМП [7].
Описан общепринятый способ получения чистой культуры стрептококков [6], который имеет следующие недостатки: изолированные колонии можно получить только на 3-й день микробиологического исследования, в процессе культивирования бактерий не удаляется посторонняя сопутствующая микрофлора слизистых оболочек зева и миндалин, на 2-й день пересева материала на кровяной мясопептонный агар (МПА) не всегда удается определить микробы, подозрительные на стрептококк, и поэтому приходится делать пересев на кровяной МПА бактерий, не относящихся к стрептококкам, что требует большего расхода питательных сред для выделения изолированной колонии стрептококков. Известно также, что гемолитические свойства стрептококков не являются диагностическим тестом для выявления патогенных стрептококков. Патогенные стрептококки под влиянием антибиотиков и факторов внешней среды могут утратить гемолитическую активность, что существенно затрудняет выделение стрептококков из исследуемого материала.
А.С. Лабинская [3] предложила способ получения изолированных колоний стрептококков по результатам выделения возбудителя со слизистых оболочек носоглотки при посеве на чашки Петри с 3% кровяным МПА с последующим изучением культуральных свойств и морфологических признаков стрептококков. Исследуемый материал вносили на чашки Петри с 3% кровяным МПА методом отпечатков, а затем шпателем распределяли микробные клетки по всей поверхности питательной среды. Через 18-20 часов роста в условиях термостата при температуре 37°С учитывали рост колоний. Идентифицировали штаммы стрептококков серологической группы А, образующие колонии трех видов: мукоидные, шероховатые и гладкие. Предложенный способ не обеспечивает 100% выделение стрептококков из исследуемого материала, так как методом отпечатков тампоном удается произвести посев лишь небольшого количества бактерий, находящихся на поверхности слизистых оболочек носоглотки; не удаляется выделенная со слизистых оболочках носоглотки сопутствующая микрофлора, обладающая антагонистическими свойствами, а также удается идентифицировать только штаммы стрептококков серологической группы А, а патогенные для человека штаммы стрептококков серогруппы С и G не определяются. Использование предложенных питательных сред и культивирование в аэробных условиях не позволяет выделять стрептококки с анаэробным типом дыхания.
Итак, сложность лабораторной диагностики и эпидемиологические предпосылки циркуляции стрептококков в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ) дают основания для совершенствования методов лабораторной диагностики стрептококковых инфекций.
Цель исследования - повышение эффективности выделения возбудителей стрептококковых инфекций из исследуемого материала при возникновении ИСМП.
Задача исследования. На основании изучения антибиотикограмм сопутствующей микрофлоры стрептококковым инфекциям выявить антибиотик, обладающий бактерицидным действием на сопутствующую микрофлору, но не влияющим на снижение репродуктивной активности стрептококков. Добавление данного антибиотика в питательную среду для роста стрептококков позволит разработать способ получения изолированных колоний стрептококков.
Материал и методы исследования
В период с 1997 по 2011 г. обследовано 5300 больных. В содержимом из зева выделена сопутствующая микрофлора стрептококковой инфекции. Для определения чувствительности выделенной сопутствующей микрофлоры к антибиотикам использовали диско-диффузионный метод. В опытах использовано 16-20 часовых культур бактерий. Концентрацию бактерий доводили по стандарту мутности до 0,5 ед. по McFarland на физиологическом растворе хлорида натрия (рН 7,2-7,4). Приготовленную взвесь вносили на чашки Петри с 5% кровяным МПА в количестве 0,2 мл и равномерно распределяли на поверхности питательной среды. Через 15 минут на поверхность питательной среды наносили диски с антибиотиками. Посевы инкубировали при 37°С в течение 24 часов с последующим определением задержки роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками. Использовали следующие диски с антибиотиками: стрептомицин, эритромицин, гентамицин, амикацин, линкомицин, бензилпенициллин, олеандомицин, цефаклор, цефуроксим, цефатоксим, цефалексин.
Для выделения стрептококков, обладающих анаэробными свойствами, проводили посев исследуемого материала на печеночный бульон Китта-Тароцци. Через 18‒20 часов роста бактерий при 37°С проводили пересев взвеси бактерий со среды Китта-Тароцци на 5% кровяной МПА. На поверхность кровяного МПА вносили 0,1 мл взвеси бактерий и шпателем равномерно распределяли их по поверхности плотной питательной среды. На поверхность посевов помещали диски с гентамицином в количестве 8-9 штук на чашку Петри и распределяли их на равном расстоянии друг от друга. Через 18-20 часов роста бактерий при температуре 37°С вокруг дисков с гентамицином отмечался рост изолированных колоний стрептококков, обладающих анаэробными свойствами.
Предложенный способ получения изолированных колоний стрептококков поясняется графическим материалом. На рисунке представлена схема получения изолированных колоний стрептококков.
Схема получения изолированных колоний стрептококков. Обозначения: 1 - сбор исследуемого материала от больного (слизь из зева и с миндалин), 2-5% кровяной МПА, 3 - среда Кита-Тароцци для выращивания бактерий с анаэробным типом дыхания, 4 - диски с гентамицином, 5 - выросшие изолированные колонии стрептококков на кровяном МПА, обладающих аэробными и анаэробными свойствами
Результаты исследований и их обсуждение
Результаты исследований показали, что в мазках из зева сопутствующая микрофлора была чувствительна к гентамицину в 90-96% случаев, а выделенные культуры стрептококков были резистентны к гентамицину. На основании результатов анализа антибиотикограмм сопутствующей микрофлоры стрептококковой инфекции предложен способ выделения изолированных колоний стрептококков из смешанных микробных популяций. Способ заключается в следующем: с помощью тампона берут налет, слизь с миндалин и слизистых оболочек зева, затем методом штриха проводят посев исследуемого материала на 5% кровяной МПА, равномерно распределяя бактерии по поверхности питательной среды. На поверхность кровяного МПА с посевом исследуемого материала наносили диски с гентамицином в количестве 8-9 штук, равномерно распределяя их на поверхности питательной среды. Через 18-20 часов роста бактерий при температуре 37°С на поверхности кровяного МПА вокруг дисков с гентамицином наблюдался рост изолированных колоний стрептококков. Для выделения стрептококков, обладающих анаэробными свойствами, предварительно делали посев исследуемого материала на печеночный бульон Китта-Тароцци, а затем через 18-20 часов роста бактерий при 37°С проводили пересев взвеси бактерий со среды Китта-Тароцци на 3% кровяной МПА. На поверхность кровяного МПА вносили 0,1 мл взвеси бактерий, равномерно распределяя их на поверхности плотной питательной среды. На посевы с микробной взвесью помещали диски с гентамицином в количестве 8-9 штук. Через 18-20 часов роста бактерий при температуре 37°С вокруг дисков с гентамицином отмечался рост изолированных колоний стрептококков, обладающих анаэробными свойствами. С помощью предложенного метода выделено 34 культуры стрептококков.
По сравнению с традиционными методами микробиологической диагностики стрептококковых инфекций предложенный способ позволяет уменьшить расход питательных сред, повысить процент выделения стрептококков из исследуемого материала, что позволяет своевременно и в более полном объеме проводить противоэпидемическое расследование и осуществлять мероприятия, направленные на предупреждение возникновения ИСМП стрептококковой этиологии.
Следует отметить, что сложность и низкая эффективность выделения стрептококков из исследуемого материала при диагностике инфекционных заболеваний связана с тем, что сопутствующая микрофлора по сравнению со стрептококками более устойчива во внешней среде, неприхотлива к питательным средам, как правило, обладает антагонистическими свойствами и поэтому при инфекционных заболеваниях выделенную микрофлору от больных часто выделяют и идентифицируют преимущественно из группы условно-патогенной сопутствующей микрофлоры. При обследовании ожоговых больных в популяциях сопутствующей микрофлоры наиболее часто определялся эпидермальный стафилококк.
Итак, стрептококки, в отличие от условно-патогенной микрофлоры и стафилококков, менее устойчивы во внешней среде, часто обладали анаэробными свойствами и медленнее размножались на питательных средах. Поэтому не всегда удается выделять чистую культуру стрептококков традиционными микробиологическими методами.
Предложенный способ позволил повысить процент выделения стрептококков из исследуемого материала, сократить время проведения микробиологических исследований по выделению изолированных колоний стрептококков, уменьшить количество ложноотрицательных результатов исследований и снизить расход питательных сред в процессе лабораторной диагностики стрептококковых инфекций. Сокращение сроков проведения лабораторных исследований позволяет в ранние сроки и в более полном объеме проводить противоэпидемические мероприятия при возникновении ИСМП, вызываемых стрептококками.
Род Streptococcus, семейство Streptococcaceae включает 21 вид. Чаще всего вызывают заболевания: S.pyogenes, agalacticae, faecalis, зеленящие (pneumoniae).
Морфология. Гр+, шаровидной или овальной формы. В мазках располагаются парами или короткими, 6–8 клеточными, цепочками. Имеют капсулу, но входящая в ее состав гиалуроновая кислота не антигенна. Неподвижны, спор не образуют.
Стрептококки КУЛЬТИВИРУЮТСЯ на питательных средах с добавлением глюкозы, сыворотки или крови. На поверхности плотных сред образуют мелкие (до 1 мм)бесцветные колонии, в жидких средах – придонный, пристеночный рост, при этом среда прозрачная. По характеру роста на кровяном агаре различают: бета-гемолитические – вокруг колоний образуется прозрачная зона гемолиза; альфа-гемолитические – неширокая, зеленоватая зона; негемолитические – среда не изменяется.
Продуцируют ряд ферментов, дифференциально-диагностическое значение имеет лактаза и сахараза.
АГ. По АГ составу полисахоридной клеточной стенки (субстанция С) стрептококки разделяют на 20 серогрупп (обозначают заглавными буквами латинского алфавита А–V). Внутри серогрупп стрептококки разделяют на серовары (обозначают цифрами). Большинство возбудителей стептококковых инфекций относится к серогруппе А.
АГ свойствами обладают Ig-новые Fc-рецепторы клеточной стенки, липотейхоевые кислоты, а также токсины и ферменты, секретируемые в окружающую среду при размножении микроорганизмами. Патогенность для человека определяется образованием токсинов, внеклеточных ферментов и свойствами самих бактериальных клеток. Перечень заболеваний, вызываемых стрептококками, довольно большой: ангины, хронический тонзиллит, скарлатина, гнойные поражения кожи, флегмоны, сепсис, нефрит, ревматизм, отит и др. Попытки найти дифференциальные признаки стрептококков, вызывающих столь разнообразные по клиническим проявлениям болезни, оказались безуспешными. Только в отношении скарлатинозного стрептококка установлено, что они могут выделять эритрогенный токсин, другие признаки одинаковы с другими стрептококками СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ГРУППЫ А. Нефритогенными считаются стрептококки серовара 12, продуцирующие цитотоксин.
Стрептококки серогруппы В (S. agalactia) могут вызывать послеродовые инфекции и сепсис новорожденных, эрозивный стоматит, урогенитальные инфекции у женщин, сепсис, менингит.
С – возбудители респираторных инфекций, заболеваний МПС.
Н и К – выделены при эндокардитах.
D (энтерококки) – обитают в кишечнике здорового человека, вызывают поражения желчевыводящих путей, могут вызвать эндокардит, попадая в раны гнойно-воспалительную инфекцию. При генерализации – сепсис.
Некоторые (S.mutans, S.salivarius и др.), не содержащие группового Аг, обитают в полости рта. S.mutans участвует в развитии кариеса зубов и пародонтоза.
Стрептококки других серогрупп редко обнаруживаются у человека.
Факторы патогенности. Адгезины – это липидный компонент комплекса липотейхоевой кислоты с белками клеточной стенки, обеспечивают взаимодействие с мембраной эпителия и колонизацию. Защиту от фагоцитоза обеспечивают:
1) антихемотаксический фактор;
2) Ig-новый Fc-рецептор (к IgG) – подавляет фагоцитоз, разрушает комплемент, вызывает дисбаланс иммуноглобулинов;
3) капсула (у серогрупп А и В) – защищает от фагоцитов;
4) М-белок, позволяет расти и размножаться в крови человека, лишенные М-белка клетки фагоцитируются без участия антител. М-белок обеспечивает т/же способность проникать в клетки микроорганизмов и размножаться в них.
ФЕРМЕНТЫ: гиалуронидаза (фактор распространения) и стрептокиназа (фибринолизин) – разрушает фибрин, ограничивающий местный очаг воспаления, способствуя генерализации процесса.
Стрептококки СЕРОГРУППЫ А образуют ряд ТОКСИНОВ:
О-стрептолизин (термолабильный белок) – выделяется при размножении, вызывает лизис эритроцитов, разрушает мембраны других клеток, а также мембраны лизосом, обладает кардиотоксическим действием. Этот токсин является АГ и стимулирует синтез анти-О-стрептолизин.
S-стрептолизин (нуклеопротеид), антигенными свойствами не обладает, вызывает лизис эритроцитов, разрушает лизосомы, мембраны митохондрий клеток человека.
Лейкоцидин лизирует полиморфноядерные лейкоциты, выключает фагоцитоз.
Цитотоксины (пептиды) – повреждают клетки. Один из этих токсинов способен повреждать почечную ткань, он выделяется нефритогенными штаммами стрептококков серовара 12.
Эритрогенный токсин (скарлатинозный). Информация об образовании данного токсина поступает в клетку с геномом умеренного фага. Термостабильная фракция эритрогенного токсина стимулирует реакцию ГЗТ.
Экология и распространение. Выделяют возбудителей заболеваний только человека, человека и животных и условно-патогенные для человека. Обитают в полости рта, на слизистых оболочках верхних дыхательных путей, на коже, в кишечнике. Источник – больные и бактерионосители. Путь распространения – воздушно-капельный. Значительная часть заболеваний – эндогенные инфекции, возникают у лиц с иммунодефицитными состояниями.
В окружающей среде (на предметах обихода, в пыли) могут сохраняться в течение нескольких дней, хорошо выдерживают высушивание (сохраняют жизнеспособность, но теряют вирулентность). Чувствительны к нагреванию и дезинфектантам.
Иммунитет. На развитие стрептококковых инфекций влияет состояние микроорганизмов. Часто заболевание развертывается на фоне предварительно возникшей сенсибилизации (повторные ангины, рожистые воспаления, хронические инфекции – тонзиллит, нефрит, ревматизм). Возможно участие аутоиммунных процессов (ревматизм). Имеют АГ, перекрестно реагирующий с сарколеммой мышечных волоконсердца.
Антитела вырабатываются на все БАВ стрептококка (токсины, ферменты). Иммунитет после перенесенных инфекций (кроме скарлатины) малонапряженный и носит типовой антимикробный характер (к М-антигену). Антитела к ферментам, токсинам стрептококков протективными свойствами практически не обладают. Уровень напряженности сенсибилизации проверяют в аллергических пробах.
Лабораторная диагностика. Материалом для БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО исследования служат слизь из зева, гной, отделяемое ран, кровь и др. Выделенные чистые культуры идентифицируют, определяют основные их свойства: морфологию, гемолитическую активность, чувствительность к антимикробным препаратам.СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА – выявление антител к токсинам и ферментам. При ревматизме – нарастание титров анти-О-стрептолизинов, анти-ДНКазы, антигиалуронидазы в парных сыворотках.
Профилактика и лечение. Специфическая профилактика не разработана. Для предупреждения хронических стрептококковых инфекций, связанных с персистенцией возбудителя и образованием L-форм, используют антибиотикотерапию. За детьми, перенесшими повторные ангины, скарлатину, устанавливается диспансерное наблюдение (профилактика ревматизма). Стрептококки серогруппы А высокочувствительны к пенициллину (бактерицидное действие), устойчивость к пенициллину не приобретается. Сульфаниламиды оказывают бактериостатическое действие на стрептококки. К ним микроорганизмы легко приобретают резистентность.
Особое место занимает СКАРЛАТИНА – острое инфекционное заболевание, возбудитель – гемолитический стрептококк группы А любого серовара, способный продуцировать эритрогенный токсин.
Патогенез. Скарлатина – острозаразное заболевание, протекает циклически со сменой симптомов. На 1 этапе проявляется действие эритрогенного токсина (интоксикация, ангина, мелкоточечная сыпь на гиперемированном фоне).
2 период сопровождается осложнениями в рез действия самих стрептококков (гнойные лимфаденит, мастоидит, отит), т.к. антимикробный иммунитет не выражен, и заражение стрептококками других сероваров, к которым нет соответствующих антител.
Иммунитет. В отличие от других стрептококковых инфекций остается прочный антитоксический иммунитет, т.к. эритрогенный токсин стрептококков всех сероваров АГ-но идентичен. Антимикробный иммунитет типоспецифичен и не защищает от возникновения других стрептококковых заболеваний.
Напряженность антитоксического иммунитета к эритрогенному токсину проверяется внутрикожными пробами. При отсутствии иммунитета самая малая доза токсина дает покраснение и припухлость кожи. Если же в крови есть антитоксины, реакции на введение токсина не возникает.
Стрептококки пневмонии (ПНЕВМОКОККИ). S.pneumoniae – вызывают воспаление легких – пневмонию, что объясняется специфичностью адгезинов, взаимодействующих с рецепторами клеток лёгких.
Морфология, физиология. Им вытянутую форму, напоминающую пламя свечи. Располагаются попарно, каждая пара окружена капсулой. Под капсулой расположен М-белок, по свойствам схожий с S.pyogenes, но имеющий свою АГ специфичность.
На плотных питательный средах, в которые добавлена сыворотка или кровь, пневмококки растут, образуя мелкие колонии, окруженные зоной позеленения (на кровяном агаре). В жидких средах дают равномерную муть.
БХ активность выражена умеренно – расщепляют ряд углеводов и образуют гиалуронидазу, муромидазу, пептиназу.
Имеют 3 основных АГ: полисахаридный АГ клеточной стенки, капсульный антиген и М-белок. По капсульному АГ разделяются на 84 серовара.
Экология и распространение. Обитают в верхних дыхательных путях человека, попадают в нижние дыхательные пути и при застойных явлениях в легких, снижении активности SIgA и макрофагов, разрушении сурфактанта возникает эндогенная пневмония. Заражение воздушно-капельным путем.
Вне организма пневмококки быстро погибают. Они не выдерживают нагревания, дезинфекции. В высушенной мокроте могут сохраняться длительное время. Чувствительны к пенициллину, макролидам.
Иммунитет. Типоспецифический и нестойкий, это объясняет повторное возникновение и возможность перехода в хроническую форму.
Лабораторная диагностика. Для выделения клеток возбудителя необходимо: оптимальная для размножения питательная среда, условия культивирования, правильное взятие исследуемого материала. Выделенные клетки идентифицируют по ряду признаков и дифференцируют от зеленящего (альфа-гемолитического) стрептококка, энтерококков. Пневмококки, имеющие капсулу, подвергают серологическому типированию и определяют чувствительность микроорганизмов к антимикробным препаратам.
Профилактика и лечение. Специфическая профилактика не разработана. В каждом частном случае имеют значение неспецифические мероприятия, направленные на предупреждение возможности возникновения эндогенной инфекции: у больных, вынужденных длительное время лежать, находящихся на гормональной, лучевой терапии, и при снижении общей резистентности организма проводится стимуляция естественных защитных механизмов (режим питания, витаминизация, усиление вентиляции легких массажем и прочими воздействиями). Для лечения пневмонии используют пенициллин, макролидные антибиотики.
ЭНТЕРОКОККИ. S.faecalis (фекальные стрептококки, энтерококки) являются обитателями кишечника человека и теплокровных животных. Входят в группу D.
Морфологически – это шаровидные или овальные бактерии, при делении соединяются в пары или короткие цепочки. Полиморфны, некоторые штаммы подвижны, имеют 1–4 жгутика.
Ферментация отдельных углеводов – непостоянный признак.
Экология и распространение. Энтерококки более устойчивы к действию факторов окружающей среды, чем другие стрептококки. Они выдерживают нагревание до 60°С в течение 30 мин, способны размножаться в средах с 6,5 % NaCI, 40% желчи, при рН 9,5–10,0. Теллурит калия, азид натрия, желчные соли, кристаллический фиолетовый, налидиксовая кислота, а также пенициллин, неомицин не угнетают роста энтерококков, что используется для создания элективных питательных сред.
Патогенез. Способны размножаться в пищевых продуктах, при употребление зараженной пищи развивается пищевая токсикоинфекция. Чаще ее вызывают протеолитические варианты.
Для лабораторного анализа используются микроскопический, бактериологический и серологический методы диагностики.
Назначение, особенности и диагностическая ценность микроскопического исследования такие же, как и при стафилококковых инфекциях.
1. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Для выделения чистой культуры стрептококков важное значение имеет создание оптимальной питательной среды, так как стрептококки предъявляют к ней особые требования. Им необходимо значительное количество углеводов и нативного белка. Поэтому наряду с общепринятыми сахарным МПБ, кровяным МПА, молочно-солевым МПА и МПБ (см. рецепты выше) при стрептококковых инфекциях применяются асцитические и сывороточные среды.
АСЦИТИЧЕСКИЙ МПБ И МПА готовятся с добавлением отчетной жидкости, получаемой стерильно из брюшной полости больных терапевтического и хирургического профиля. Жидкость прогревают 3 дня при +56-58 °C по 1 часу, стерилизуют фильтрованием через фильтр Зейтца или добавляют 40% глицерина и хранят на холоду. Для приготовления асцит-бульона и асцит-агара 1 часть жидкости смешивают с 2-3 частями МПБ (или Хоттингеровского бульона) или растопленного и остуженного МПА.
СЫВОРОТОЧНЫЙ МПБ готовят из простого свежего мясопептонного бульона с pH 7,6, к 1 части которого добавляют 2 части свежей сыворотки человека или лошади. Сыворотку перед прибавлением к среде инактивируют при + 56 °C в течение 30 минут.
При осложнении капельных стрептококковых инфекций сепсисом необходим и посев крови. Для бактериологического исследования крови Э. Г. Кассирская рекомендует комплексное использование трех видов питательных субстратов, засеваемых из расчета 1 часть патологического материала на 10-15 частей среды. В качестве последней используются 0,2% полужидкий агар с 10% асцитической жидкости, бульон Левинталя с кровью и печеночная среда Китт-Тароцци.
ДЛЯ БУЛЬОНА ЛЕВИНТАЛЯ отдельно готовят следующие компоненты: № 1 - к 100 мл мясного фарша добавляют 300 мл дистиллированной воды и 10 мл нормального раствора соды; № 2 - 0,5 г панкреатина растворяют в 20-30 мл воды с 2 мл 1 N раствора соды и 10 мл хлороформа; № 3 - буферный раствор фосфорно-кислого натрия в дистиллированной воде (разведение 8:1000). С помощью раствора НСl устанавливают pH, равное 5,6-6.
В первый день смесь № 1 инкубируют в термостате при + 37 °C 1-2 часа, добавляют к ней раствор № 2, перемешивают и при тех же условиях выдерживают еще 24 часа. Сосуд со средой периодически встряхивают. После этого берут равные количества мясной кашицы и буферного раствора № 3. Кипятят, фильтруют. Устанавливают рН-7,2-7,4. Вновь кипятят. Разливают по пробиркам и стерилизуют 2 дня подряд по 30 минут текучим паром.
СРЕДУ КИТТ-ТАРОЦЦИ готовят из говяжьей печени или мяса. Последние нарезают кусочками, взвешивают, заливают тройным количеством МПБ (рН-7,4-7,6) кипятят 30 минут. Затем бульон фильтруют, кусочки печени отмывают водопроводной водой. Далее пробирки с 3-4 кусочками печени, залитыми 7-8 мл фильтрата и слоем вазелинового масла, стерилизуют под давлением 1 атм. в течение 30 минут.
Высеваемость стрептококков возрастет при использовании ПОЛУЖИДКОГО АГАРА ГАРОЦЦИ: в бульон Мартена (рН-7,6-7,8) добавляют 0,3-0,5% глюкозы и 0,1-0,15% агар-агара. В стерильные пробирки помещают кусочки печени или вареного мяса, добавляют по 9 мл среды и стерилизуют при температуре +120 °C в течение 30 минут.
Зеленящий стрептококк, выделяемый при септическом эндоркардите, развивается очень медленно. В связи с этим посевы крови выдерживают 2-3 суток в термостате.
В некоторых случаях выделить культуру стрептококка при широкой аэрации не удается. Более успешным оказывается применение анаэробиоза. Для создания последнего можно использовать три простейших способа.
I. ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ ЗАСЕВАЮТ В ПРОБИРКУ с 0.25% глюкозным бульоном и быстро всасывают его в стерильные пастеровские пипетки, концы которых тотчас же запаивают над пламенем горелки. Пипетки устанавливают вертикально в термостате. Через 24 часа нижние концы пипеток отламывают (стрептококки растут только внизу), первые капли используют для микроскопии и дальнейшего выделения чистой культуры возбудителя.
2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПОСЕВОВ В АТМОСФЕРЕ, НАСЫЩЕННОЙ УГЛЕКИСЛЫМ ГАЗОМ. Необходимую концентрацию СО2 получают при добавлении в загруженный пробирками эксикатор вначале 1г двууглекислой соды на 1 литр объема, а затем из того же расчета 8-9 мл 10% Н2SO4 или HCl.
3. ДОВОЛЬНО ПРОСТ и менее эффективен следующий прием: на дно неплотно закрытого эксикатора ставят зажженную свечку. Она горит 1-3 минуты и гаснет. По окончании первой или второй процедуры эксикаторы покрывают крышками, края которых смазаны вазелином и помещают в термостат.
Выделение чистой культуры
Биохимическая активность стрептококков непостоянна и ее выяснение не имеет диагностического значения. Изучение стрептококков в этом плане используется лишь для дифференциации с энтерококками (табл. 1.).
| Таблица 1. Дифференциация стрептококков от энтерококков | ||
| Критерии Шермена для различия стрептококков группы А (истинные) oт группы Д (энтрококки) | ||
| Тесты | Группы | |
| Группа А (стрептококки) | Группа Д (энтерококки) | |
| Длина цепочек | длинные (5-12 звена) | короткие (1-2 звеньев) |
| Рост на солевом МПА с 6,5% | + | - |
| Рост на желчно-кровяном МПА Д. Э. Беленького к П. Н. Поповой | - | + |
| Рост на молоке с метиленовой синькой | - | + (редукция) |
| Рост на МПБ с pH - 9,6 (в присутствии 0,05 М р-ра Na2CO3) | - | + |
| Чувствительность к пенициллину | + | - |
| Термоустойчивость при +60 °C в течение 30 минут. | - | + |
Состав дифференциально-диагностических сред, применяемых для этой цели следующий.
- ЖЕЛЧНЫЙ И ЖЕЛЧНО-КРОВЯНОЙ МПА Д. 3. Беленького и Н. Н. Поповой готовятся из расплавленного и отфильтрованного 3% МПА с любой бульонной основой. К 60 мл этого МПА добавляют 40 мл нативной профильтрованной желчи, разливают по флаконам и стерилизуют при давлении в 1 атм. 30 минут. Для приготовления агара с кровью к этому желчному МПА добавляют 5% дефибринированной крови.
- МОЛОКО С МЕТИЛЕНОВЫМ СИНИМ приготовляется из обезжиренного стерильного молока, к 100 мл которого добавляют 2 мл 10% водного раствора метиленового синего.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУЛЕНТНОСТИ СТРЕПТОКОККОВ
Для доказательства патогенности стрептококков важное значение имеют гиалуронидазная активность, выявление стрептокиназы или фибринокиназы, плазмокоагулазы, лейкотоксическое действие стрептококка, наличие гемолизина. Определение этих показателей осуществляется по методикам, описанным выше, но выявление гемолизирующей активности стрептококка лучше идет на средах с человеческой кровью.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИДИНА. Берут цитратную кровь человека или какого-либо животного, центрифугируют, верхний желтый слой лейкоцитов отсасывают пипеткой, переносят в другую пробирку и готовят 2-5% лейкоцитарную взвесь. Последнюю разливают по 1-1,5 мл в узкие пробирки. Сюда же вносят 1 петлю 1-2 млрд. суточной культуры стрептококка и на 1 час помещают в термостат при +37 °C. После инкубации, из лейкоцитарно-микробной массы делают мазки (по типу мазков из цельной крови), высушивают, фиксируют 15 мин. в смеси Никифорова, окрашивают 45-60 минут по Романовскому-Гимза, микроскопируют. Массовое разрушение лейкоцитов свидетельствует о наличии лейкоцидина.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ выделенных культур к лекарственным веществам производится общепринятыми способами.
СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ТИПИЗАЦИЯ обнаруженных стрептококков после их изоляции требуется только для особых эпидемиологических целей и применяется редко.
II. СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ СТЕПТОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ
Ферменты вирулентности стрептококков (гиалуронидаза, фибринокиназа, плазмокоагулаза) и их токсины (например, гемотоксин) являются мощными антигенами, в ответ на действие которых вырабатываются соответствующие антитела: антигиалуронидаза, антистрептокиназа, антистрептолизин и т. д. По обнаружению этих антител можно диагностировать заболевание и фазу развития инфекционного процесса.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИСТРЕПТОЛИЗИНА (АНТИГЕМОЛИЗИНА)
Стрептолизин представляет собой разновидность гемотоксина. Его присутствие проверяют на эритроцитариой массе. В ответ на действие этого антигена в организме формируются антитела, способные нейтрализовать его гемолизирующую активность. При выявлении антистрептолизина необходимы: сыворотка больного с антистрептолизинами (антителами); стрептолизин (очищенный), стандартный, лиофилизированный; 5% взвесь кроличьих, бараньих или человеческих эритроцитов; фосфатный буфер для разведения сывороток и приготовления взвеси эритроцитов: в 1 л дистиллированной воды растворяют 7,6 NaCl, 3,17 г КН2Р04 и 1,81 г Na2HPO4, добавляют по каплям концентрированную NaОН и доводят pH до 6.5-6,7. Буферный раствор сохраняется в рефрижераторе при -4 °C 2-3 недели.
Определение антистрептолизина складывается из двyx этапов: первый - установление титра и рабочей дозы стандартного стрептолизина, второй - выявление и количественное определение антистрептолизина. Схемы их выполнения приводятся ниже.
| Схема определения рабочей дозы стандартного стрептолизина | |||||||
| Компоненты в мл | Пробирки | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |
| (контроль эритроцитов) | |||||||
| Стрептолизин | 0,6 | 0,7 | 0,8 | 0,9 | 1,0 | 1,1 | - |
| Буферный раствор | 0,9 | 0,8 | 0,7 | 0,6 | 0,5 | 0,4 | 1,5 |
| Взвесь эритроцитов | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| В термостат на 15 минут при +37 °C, встряхнуть, снова в термостат на 30 минут. | |||||||
| Результат | - | - | - | - | гемолиз | гемолиз | - |
Титром и рабочей дозой стрептолизина считается его минимальное количество, давшее четкий гемолиз эритроцитов. В данном примере они равны 1,0 мл.
В последнее время выпускается стандартный лиофилизированный стретолизин, на флаконе с которым и в приложенной инструкции указан способ разведения препарата для получения рабочей дозы. Такой стрептолизин обеспечивает хорошую повторяемость результатов.
| Схема постановки реакции для определения антистрептолизина | ||||||
| Компоненты в мл | Пробирки | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | Контроль | ||
| 5 | 6 | |||||
| стрептолизина | эритроцитов | |||||
| Буферный раствор | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Сыворотка больного | 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | - |
| Стрептолизин в раб. дозе. | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | - |
| Встряхнуть, в термостат при + 37 °C на 15 минут. | ||||||
| Взвесь эритроцитов | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| В термостат на 45 минут при +37 °C с периодическими встряхиваниями. | ||||||
| Результат | - | - | гемолиз | гемолиз | гемолиз | - |
Антистрептолизин в данной пробе сыворотки обследуемого больного обнаружен в титре 1:200.
Принцип выявления основан на регистрации разрушительного действия фермента гиалуронидазы на гиалуроновый субстрат. Антитела сыворотки больного, направленные против этого фермента, нейтрализуют его и гиалуроновая кислота остается неизмененной.
Необходимые реактивы: сыворотка больного с антителами (антигиалуронидазой); экстракт гиалуроновой кислоты с известной рабочей дозой (способ описан выше); гиалуронидаза (химически чистый препарат); 15% уксусная кислота - индикатор; физиологический раствор.
Определение антигиалуронидазы состоит из трех этапов: первый - определение титра и рабочей дозы гиалуроновой кислоты, второй - гиалуронидазы, третий - выявление наличия и титра антигиалуронидазы.
Титрование гиалуронового субстрата описано выше. Титр и рабочая доза стандартной гиалуронидазы соответствует тому минимальному ее количеству, которое способно разрушить гиалуроновую кислоту, взятую в рабочей дозе.
После выяснения титра гиалуронидазы проводят определение титра антигиалуронидазы.
| Схема постановки реакции определения титра сывороточной антигиалуронидазы | ||||||||
| Ингредиенты в мл | Пробирки | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | Контроль | ||
| 7 | 8 | |||||||
| гиалуронидаза | гиалуроновая кислота | |||||||
| Физ. раствор | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,7 |
| Сыворотка больного в разведении 1:25 | 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1600 | ||
| Гиалуронидаза в рабочей дозе | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | - |
| В термостат при + 37°C на 30 минут. | ||||||||
| Гиалуроновая кислота в рабочей дозе | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 |
| В термостат при +37 °C на 30 минут. 15% уксусная кислота по 2-3 капли в пробирку. | ||||||||
| Результаты | сгусток | сгусток | сгусток | - | - | - | - | сгусток |
В данном примере титр антигиалуронидазы в сыворотке крови больного 1:200. Это количество антител при указанном разведении сыворотки еще обладает нейтрализующим действием в отношении гиалуронидазы и предотвращает разрушение гиалуроновой кислоты. Ее целостность регистрируется по образованию сгустка после добавления индикатора - 15% раствора уксусной кислоты.
Источник: Мотавкина Н.С., Пьянова Р.Е. Микробиологическая диагностика некоторых капельных инфекций и токсоплазмоза. Методическая разработка для студентов. ВГМУ, 1973
Читайте также: