Метод экспресс для диагностики холеры
Мазки обрабатывают люминесцентной сывороткой и рассматривают в люминесцентном микроскопе. При наличии в исследуемом материале холерного вибриона в первом мазке произойдет свечение вибрионов, во втором - свечение отсутствует.
2. Реакция пассивной гемагглютинации.
Для обнаружения холерных вибрионов в содержимом кишечника используют антителъный диагностикум, т.е. эритроциты, на которых предварительно адсорбируют соответствующе антитела. Реакцию ставят по обычной методике. При наличии в исследуемом материале холерных вибрионов происходит агглютинация эритроцитов.
Для серологической диагностики холеры можно использовать реакцию агглютинации, реакцию обнаружения копроантител и реакцию определения титра вибриоцидных антител (бактериолизинов).
Реакцию агглютинации ставят по обычной методике с сывороткой больного, инактивированной нагреванием. В качестве антигена используют 5-часовую агаровую культуру холерного вибриона штамма Огава и отдельно штамма Инаба. Антитела в крови больного появляется с 5-го дня от начала заболевания. Реакция считается положительной при титре сыворотки 1:40 и выше.
0-агглютинины у больных и вибрионосителей можно определить также в инактивированной сыворотке, разведенной 1%-ной пептонной водой от 1:10 до 1:1280 в объеме 1 мл. В пробирки вносят по 0,1 мл 3-часовой бульонной культуры холерных вибрионов. После 2 часов инкубирования при 37° и выдерживания на холоде в течение ночи учитывают результат.
Для определения титра вибриоцидных антител (бактериолизинов) инактивированную сыворотку больного разводят на холоде в растворе комплемента 1:20 в объеме 0,45 мл от 1:10 до 100000. В качестве комплемента использует сыворотку морской свинки, проверенную на отсутствие естественных бактериолизинов. К каждому разведению сыворотки добавляют 0,05 мл суточной агаровой культуры холерных вибрионов с концентрацией 20000 микробных тел в 1 мл. Контролями служат пробирка, в которой отсутствует сыворотка, и пробирка, в которой отсутствует комплемент. Все пробирки инкубируют при 37º в течение 1 часа, затем помещают на холод и микропипеткой высевают по 0,05 мл из каждой пробирки на чашки с питательным агаром. Чашки помещают в термостат и инкубируют при 37°. Через 24 часа подсчитывают количество колоний, выросших на чашках с посевами из опытных и контрольных пробивок. За титр вибриоцидных антител (бактериолизинов) принимают то максимальное разведение сыворотки, при высеве из которого вырастает в 2 раза меньше колоний, чем при высеве из контрольных пробирок.
По аналогичной методике можно определить содержание вибриоцидных антител и в фильтрате содержимого кишечника (испражнений) больного холерой.
Можно определить титр вибриоцидных антител и без предварительной инактивации комплемента и без добавления стандартного комплемента. Исследуемую сыворотку в этом случае наносят каплями (в соответствующем разведении) на чашку с питательной средой, на которую предварительно наносят каплю свежей культуры и рассевают её по всей поверхности среды с помощью шпателя. На месте нанесения капель сыворотки, в которых еще содержатся вибриоцидные антитела и комплемент в достаточном количестве, чтобы вызвать лизис вибриона, роста его не будет ("стерильные пятна").
Для обнаружения антител к холерогену (антитоксинов) в настоящее время применяются иммунофлуоресцентный и иммуноферментный методы.
Кроме того, для обнаружения гена, контролирующего синтез холерогена, разработан метод ДНК-зонда.
Контрольные вопросы.
Каковы морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические особенности холерного вибриона?
Каково антигенное строение холерного вибриона?
По каким признакам отличают семейство Vibrionaceae от семейств Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae?
По каким признакам отличают род Vibrio от родов Aeromonas, PLesiomonas?
По каким признакам отличают холерный вибрион от холероподобных?
Какие существуют биотипы холерного вибриона?
Как происходит заражение при холере?
Где в организме больного локализуется холерный вибрион?
Какие микробиологические методы применяют для диагностики холеры?
Какой материал берут от больного для исследования?
Какой трупный материал подвергают исследованию?
Какие правила следует соблюдать при взятии, пересылке и исследовании материала при подозрении на холеру?
Какие питательные среды применяют для выделения холерного вибриона?
Как выделяют чистую культуру холерного вибриона?
На основании каких признаков идентифицируют холерный вибрион?
Какова сущность иммунофлуоресцентного метода ускоренного обнаружения холерного вибриона?
По каким признакам отличают классический вибрион от вибриона Эль Тор?
Какие токсины образует холерный вибрион? Какое действие оказывает энтеротоксин (холероген) на организм человека?
В чем заключается принцип патогенетического лечения больных холерой?
Как ставят пробу со специфическими холерными монофагами?
В чем заключается биологический метод определения энтеротоксигенности (холерогенности) вибрионов?
Какие серотипы различают у холерных вибрионов?
Какие основные биологические свойства парагемолитических вибрионов? Как происходит заражение ими и какие они вызывают заболевания?
Какое основное отличие галофильных вибрионов от холерных и холероподобных?
Какие метода обнаружения холерогена Вы знаете?
Какова природа и структура холерного энтеротоксина (холерогена)?
Каковы косвенные доказательства отсутствия токсигенных свойств у холерного вибриона?
Какими функциями обладают фрагменты А и В холерогена?
С чем связана способность некоторых холероподобных вибрионов вызывать холероподобные диареи?
Каким образом идентифицируют холероподобные, т.е. не относящиеся к 01-группе, вибрионы?
Холера — особо опасное, карантинное инфекционное заболевание, вызываемое Vibrio cholerae биоваров cholerae и eltor, проявляющееся в виде острого гастроэнтерита с выраженной интоксикацией и обезвоживанием (эксикозом) в результате нарушения водно-электролитного обмена, cвязанного с выработкой вибрионами холерного энтеротоксина (холерогена).
Основной метод лабораторной диагностики холеры – бактериологический.
Исследования на холеру проводятся круглосуточно в специальной лаборатории медицинскими работниками, прошедшими подготовку по особо-опасным инфекциям. Методы, применяемые для микробиологической диагностики холеры, представлены в схеме 13.
Бактериологический метод состоит из нескольких этапов.
Первый этап. Исследуемый материал засевают на щелочные (элективные) плотные питательные среды (щелочной агар Монсура – МПА с триптиказой, хлоридом натрия, таурохолатом натрия, карбонатом натрия; TCBS - тиосульфат-цитрат-бромтимол-сахарозный агар;щелочной МПА) и жидкие среды обогащения (1% щелочная пептонная вода).
Третий этап выполняется через 12— 14 ч от начала анализа. Производится пересев из верхней части 2-й среды накопления на плотные элективные питательные среды. Изучают и отбирают для исследования типичные для холерного вибриона колонии на плотных средах, засеянных нативным материалом.
|
Четвертый этап. (через 18-24 ч от начала анализа). Изучают и отбирают с помощью стереомикроскопа типичные для холерного вибриона колонии на всех плотных средах. Холерный вибрион образует прозрачные, круглые, диаметром 1-2 мм, гладкие, плоские, гомогенные, с ровными краями колонии, имеющие голубоватый оттенок и маслянистую консистенцию. На агаре TCBSколонии холерного вибриона ярко-желтые на зеленом фоне среды, на среде Монсура — полупрозрачные бесцветные с темным центром. Колонии проверяют на наличие оксидазы (холерные вибрионы оксидазоположительны), ставят РА на стекле с холерными сыворотками О-1, О-139 и RO, а также специфическую иммунофлюоресценцию.
Положительная РА или ИФМ в сочетании с типичными морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами выделенной культуры позволяет выдать предварительный положительный ответ.
Пятый этап проводится через 24 —36 ч от начала исследования. На этом этапе изучают и отбирают характерные для холерного вибриона культуры на среде Ресселя, на которой холерный вибрион расщепляет сахарозу, что сопровождается покраснением среды в столбике без образования газа, но не ферментирует лактозу (отсутствие изменений скошенной части среды). Со среды Ресселя готовят мазки в окраске по Граму с целью обнаружения характерных по морфологическим свойствам вибрионов, проверяют наличие подвижности и оксидазы, ставят РА с холерными сыворотками (О-1, RO,Огава, Инаба, при отрицательном результате - с сывороткой О-139) и при наличии положительных результатов выдают ответ о выделении соответствующего холерного вибриона.
Окончательную идентификацию оксидазопопожительных культур проводят, используя сокращенную или полную схемы (табл. 15).
Таблица 15.Дифференциация холерных вибрионов
| Тесты | V.cholerae asiaticae | V.cholerae el-tor | НАГ |
| Агглютинация О-сывороткой | + | + | - |
| Агглютинация сыворотками Инаба и Огава | + | + | - |
| Лизис фагами: Холерный фаг С (фаг IV) Фаг Эль-Тор | + - | - + | + + |
| Агглютинация куриных эритроцитов | - | + | + |
| Гемолиз эритроцитов барана | - | + | + |
| Рост на среде с полимиксином | - | + | + |
| Гексаминовый тест | - | + | + |
| Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) | - | + | + |
Сокращенная схема предполагает постановку развернутой РА с сыворотками Инаба и Огава, пробы с диагностическими холерными фагами, определение ферментативной группы по Хейбергу. Полная схема дополнительно включает тесты для дифференциации биоваров холерного вибриона (классического и Эль-Тор), в частности, определение гемагглютинирующих и гемолитических свойств, чувствительности к полимиксину, способности давать положительную реакцию Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола - ацетоина из глюкозы). Ацетоин определяют добавлением в культуру, выращенную на глюкозо-фосфатном бульоне Кларка, 5% α-нафтола и 40%-го гидроксида калия; при встряхивании пробирок среда окрашивается в розовый или рубиново-красный цвет.
Для ускоренной биохимической идентификации холерных вибрионов и их дифференциации от холероподобных и нехолероподобных вибрионов используют систему индикаторных бумажных дисков (СИБ), в состав которой входят тесты на оксидазу, индол, ферментацию лактозы, глюкозы, сахарозы, маннозы, арабинозы, маннита, инозита, аргинина, лизина и орнитина.
Шестой этап (выполняется через 36-48 ч от начала анализа) - окончательная идентификация выделенных культур, определение их чувствительности к антибиотикам, формулировка окончательного ответа о выделении холерного вибриона с указанием биовара, серогруппы (серовара) и эпидемической значимости по косвенным биологическим признакам (гемолитической активности, группе Хейберга и др.). Типичные культуры Vibrio cholerae представляют собой грамотрицательные изогнутые в виде запятой или прямые полиморфные активно подвижные палочки, обладающие оксидазой, разлагающие глюкозу с образованием кислоты без газа, декарбоксилирующие лизин и орнитин, но не ферментирующие аргинин, принадлежащие к 1-й (реже 2-й) группе Хейберга, агглютинирующиеся холерными сыворотками и лизирующиеся диагностическими фагами. Если выделенная культура не агглютинируется сыворотками к О1 и О139, ее относят к группе НАГ-вибрионов, а при наличии соответствующих сывороток определяют ее принадлежность к другой серогруппе. Токсигенные штаммы холерных вибрионов серогрупп Ои О139 обычно не лизируют бараньи эритроциты, относятся к 1-й группе Хейберга (ферментируют маннозу и сахарозу, но не арабинозу), лизируются определенными фагами в комплексном методе с применением ХДФ.
Вирулентность холерных вибрионов определяют в специализированных лабораториях путем внутрикишечного заражения кроликов-сосунков, а также методами генодиагностики (ПЦР или ДНК-ДНК-гибридизация с целью определения гена, ответственного за выработку токсина).
Серодиагностикаявляется дополнительным методом лабораторной диагностики холеры. Исследуют парные сыворотки крови больных, взятые с интервалом в 6-8 дней, с целью выявления агглютининов с помощью РА (диагностический титр 1:40 и выше), антитоксинов с помощью РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (диагностический титр - 1: 160) и вибриоцидных антител с помощью реакции иммобилизации вибрионов (диагностический титр1:1000). Учитывается также нарастание титра антител (не менее чем в 4 раза) в процессе инфекции.
Самостоятельная работа студентов
1. Микроскопический метод. Промикроскопировать и зарисовать демонстрационный микропрепарат холерного вибриона V.cholerae, окрашенный по Граму. Холерный вибрион - грамотрицательная изогнутая палочка.
2. Бактериологический метод. Ознакомиться с основными биологическими свойствами классического биовара холерного вибриона и биовара Эль-Тор:
· фаголизабельность. Классический холерный вибрион лизируется фагом С и нечувствителен к действию фага Эль-Тор II. Вибрион Эль-Тор лизируется фагом Эль-Тop и нечувствителен к фагу С (демонстрация);
· чувствительность к полимиксину. Учесть рост классического холерного вибриона и вибриона Зль-Тор на среде с добавлением полимиксина. Вибрион Эль-Тор к полимиксину не чувствителен, классический холерный вибрион – чувствителен;
· гемолитические свойства. Вибрион Эль-Тор лизирует эритроциты; классический холерный вибрион, как правило, нет (демонстрация);
· определение серовара холерного вибриона. Учесть развернутую реакцию агглютинации c сыворотками Инаба и Огава (демонстрация).
3. Изучить биопрепараты, используемые для диагностики, лечения и профилактики бактериальной дизентерии и холеры:
· люминесцирующая холерная сыворотка для постановки реакции иммунофлюоресценции с целью выявления вибрионов;
· агглютинирующие холерные сыворотки Инаба и Огава (для постановки реакции агглютинации при идентификации холерного вибриона);
· холерные фаги: классический (фаг С) и Эль-Тор. Используются для фагодиагностики;
· поливалентный холерный бактериофагдля лечения и профилактики;
· холерная вакцина.Создано 3 вакцины против холеры (убитая Эль-Тор; холероген- анатоксин, обогащенный О-антигеном холерного вибриона для подкожных инъекций; холероген-анатоксин, обогащенный О-антигеном холерного вибриона таблетированный). Используются для специфической профилактики холеры.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Вид: Микроскопическое изучение Кал, рвотные массы, желчь,
(рисового отвара)
I этап:
Подвижность РИФ, РНИФ
Посев на комплект сред:
Б/фаг
МукарджиIV
Пептон 1% пепт. 1% пепт. 5% кров. Щелочной МПА с
1% вода вода + вода + МПА с дисками антибиотиков
01 сывор. 0,5% эритроцитами (полимиксин) и б/фагом
II этап: Учет по принципу I этапа каждые 4-6 часов в течение суток.
Пленчатый рост Агглютинат 01 При добавлении Гемолиз Индивид. рез-ты
Подвижны Нет его – при Нет синевы при Нет его - полимиксину и
не 01 вибрионах х.в. 01 холерный б/фагу;
Синева – при вибрион Эль-Тор – нет
За сутки этим методом можно получить окончательные результаты
Экспресс-методы диагностики вибрионов
Люминесцентно-серологический (РИФ, РНИФ).
Иммобилизация вибрионов типовыми сыворотками.
Иммобилизация вибрионов типовыми бактериофагами.
Развернутая реакция агглютинации в бульоне.
Метод микроагглютинации материала.
Выявление вибрионов в воде реакцией агглютинации.
Исследование воды путем подращивания на мембранных фильтрах с помощью люминесцентной микроскопии.
Особенности иммуно-люминисцентной диагностики холеры – риф и рниф
РИФ – реакция прямой иммуно-флюоресценции при холере ставится по классической методике путем микроскопического выявления возбудителя в зафиксированном и обработанном ФИТЦ – препаратом мазке. Эта особенность (обязательная фиксация) связана с эпидемической опасностью работы с ООИ.
РНИФ – непрямая реакция иммунофлюоресценции ставится в случае отсутствия меченой ФИТЦ противохолерной иммунной сыворотки, но при наличии специфической не меченой и меченой противоиммуноглобулиновой видовой к белкам того вида животного, который использован для получения иммунных противохолерных антител. Эта реакция разработана Кунсом. Она выявляет антитела к Ig в иммунной сыворотке, среагировавшие в мазке с возбудителем.
Питательные среды
Жидкие среды обогащения:
1% пептонная вода.
Пептонная вода с теллуритом калия.
Щелочной агар (рН = 8-8,2).
Щелочной агар с теллуритом калия.
Желточно-солевой агар (ЖАС).
Среда Дьедонне (щелочной МПА с дефибринированной кровью быка или барана).
Среда Монсура (таурохолат-теллуритовая).
Среда Аронсона (щелочной агар с сахарозой, сернокислым натрием, фуксином). Холерные вибрионы дают розовые колонии.
Среда Оттоленги (щелочной МПБ с бычьей желчью).
Висмут-сульфитная среда Рида.
Висмут-сульфитная среда с маннозой Вильсона и Рейли, рН-8,8.
Среда Венкатрамена и Рамакришнона (щелочной бульон с морской солью).
Холера – острая кишечная антропонозная особо опасная карантинная инфекция.
Характеристика возбудителей холеры.
Таксономия. Возбудитель холеры – холерный вибрион Vibrio cholerae относится к отделу Gracilicutes, семейству Vibrionaceae, роду Vibrio. Внутри вида Vibrio cholerae различают два биовара: biovar cholerae classic (выделенный Р. Кохом) и biovar eltor (открытый супругами Готшлих).
Морфологические и тинкториальные свойства. Это небольшие (2-4 х 0,5 мкм) изогнутые в виде запятой грамотрицательные палочки, очень полиморфные, не образуют спор, капсул. Монотрихи, обладают высокой подвижностью, что является важным диагностическим признаком.
Культуральные свойства. Холерный вибрион – факультативный анаэроб, предпочитающий аэробные условия и быстро погибающий в анаэробных. К питательным средам неприхотлив.
Сахаролитические свойства. Холерный вибрион сбраживает с образованием кислоты многие углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннит, лактозу, гликоген, крахмал и др.).
Холерные вибрионы разлагают только маннозу и сахарозу и принадлежат к I группе Хейберга.
Протеолитические свойства. Холерные вибрионы разжижают желатин, свертывают молоко, расщепляют белки до NH3 и индола. H2S не образуют. Восстанавливают нитраты в нитриты образуют оксидазу.
Антигенная структура. Холерные вибрионы имеют термостабильные О- и термолабильные Н-антигены.
Факторы патогенности. Основной фактор патогенности – способность к токсинообразованию. Холерные вибрионы образуют эндо- и экзотоксин.
Эндотоксин – термостабильный липополисахарид с иммуногенными свойствами (индуцирует синтез вибриоцидных антител), но в патогенезе существенной роли не играет.
Экзотоксин – термолабильный белок, состоящий из нескольких фракций, наиболее важной из которых является холероген.
Холерные вибрионы секретируют также экзотоксины, аналогичные токсинам токсигенных эшерихий, шигелл, сальмонелл, в частности, экзотоксины с цитотоксическим действием, вызывающим гибель клеток эпителия тонкой кишки.
Возбудители холеры продуцируют ферменты агрессии – фибринолизин, плазмокоагулазу, лецитиназу, нейраминидазу, коллагеназу, гиалуронидазу
Патогенность для животных. В естественных условиях животные не болеют холерой.
Эпидемиология. Источник инфекции – больной или вибрионоситель. Механизм передачи- фекально-оральный. Пути передачи - водный(основной), пищевой, контактно-бытовой.
Факторы передачи – загрязненные выделениями больного руки, предметы обихода, вода, пищевые продукты, мухи. Установлено, что возбудитель холеры Эль-Тор способен размножаться в организме рыб, ракообразных, простейших, в сине-зеленых водорослях и других обитателях водоемов.
В настоящее время наиболее распространена холера, вызываемая возбудителем Эль-Тор.
Заболевание чаще отмечается в теплое время года. Восприимчивость к инфекции высокая.
Патогенез. Заражение происходит перорально. Большинство вибрионов гибнет в кислой среде желудка. Однако при снижении желудочной секреции (как функциональном разбавление желудочного содержимого водой, пищей так и патологическом например, гастрит со сниженной кислотностью) вибрионы проходят через желудок, попадают в тонкую кишку, где прикрепляются к энтероцитам, размножаются и поражают их ферментные системы без развития воспалительного процесса.
Ведущую роль в патогенезе играет холероген, который нарушает водно-солевой обмен, приводит к резкому обезвоживанию организма и ацидозу.
Клиника. Инкубационный период от нескольких часов до 5 суток. Заболевание начинается остро, часто внезапно, в ночные или утренние часы с безболезненного поноса и редко (в 10-20% случаев) – повышения температуры. .
Первая стадия – холерный энтерит, характеризуется диареей с частотой дефекации не более 10раз в сутки, продолжается 1-3 дня. На этой начальной стадии заболевание может закончиться (легкая форма холеры) или перейти в следующую стадию – стадию гастроэнтерита (форма средней тяжести). На этой стадии к поносу присоединяется повторная рвота без чувства тошноты. Больной теряет до 30 литров жидкости в сутки.
Появляется тахикардия, кровяное давление падает, уменьшается количество мочи (олигурия) вплоть до анурии.
Иммунитет непрочный и непродолжительный. Нередко отмечают случаи повторного заражения. Лабораторная диагностика. Материалом для исследования являются испражнения рвотные массы, желчь, пищевые продукты, вода, секционный материал, смывы с объектов внешней среды, гидробионты, мухи и др.
Основным в лабораторной диагностике холеры является бактериологический метод.
К экспресс-методам диагностики холеры относятся:
1. Иммобилизация вибрионов противохолерными сыворотками и типовыми холерными фагами.
2. Иммунофлюоресцентный метод.
Препараты из исследуемого материала обрабатывают флюоресцирующей противохолерной сывороткой и исследуют в люминесцентном микроскопе. В положительном случае в препарате наблюдается яркое желто-зеленое свечение в виде блестящего ободка по периферии клетки.
3. Метод микроагглютинации нативного материала.
Реакция ставится на стекле с использованием холерной О-сыворотки. При наличии в нативном материале вибрионов через 5-10 минут в капле с сывороткой выпадают хлопья.
4.Определение антигена возбудителя в исследуемом материале с помощью ДНК-зондов.
Препараты для лечения и профилактики. Терапия предусматривает восполнение жидкости и электролитов плазмозамещающими жидкостями (глюкозосолевыми растворами). Проводят антибактериальную терапию препаратами тетрациклинового ряда, левомицетином, фторхинолонами.
Для специфической иммунопрофилактики имеются:
1) убитая вакцина из штаммов Огава и Инаба;
2) холероген – анатоксин;
3) бивалентная вакцина из анатоксина и О-антигена Огава и Инаба.
Эффективность вакцинации не превышает 60-70%. Невосприимчивость после их применения сохраняется в течение 3-6 месяцев, поэтому вакцинопрофилактика имеет вспомогательное значение и применяют ее по эпидемическим показаниям.
В очагах холеры хороший профилактический эффект дает прием тетрациклина.
Для лечебно-профилактических целей используется поливалентный холерный бактериофаг.
Холеру вызывают два биовара Vibrio cholerae. Один из них, выделенный Кохом в Египте в 1883 году, назвали классическим, другой, полученный Ф.Готшлихом на карантинной станции Эль-Тор в Северной Африке в 1906 году - V.eltor. оба биовара неагглютинирующиеся вибрионы (НАГи), галофильные парагемолитические вибрионы, продуцирующие гемолизин, и нехолерные вибрионы-кислотообразователи включены в род Vibrio семейства Vibrionaceae.
Это острая кишечная инфекция, сопровождающаяся резким обезвоживанием и обессоливанием организма. Источником инфекции является человек - больной или носитель. Механизм передачи фекально-оральный.
Возбудители имеют соматический О- и жгутиковый Н-антигены. О-антиген обладает видовой и типовой специфичностью. По строению О-антигена различают долее 40 сероваров. Развивающийся к холере иммунитет носит гуморальный характер.
Материал для исследования: испражнения, рвотные массы, трупный материал.
Метод массового исследования на вибриононосительство. Материал берется непосредственно из кишечника при помощи стеклянной трубочки диаметром 0,5 см (для детей), 1,5 см (для взрослых) и длиной 15 см с оплавленными концами (при отсутствии трубочек используют ватные тампоны на деревянных палочках). Трубочку немедленно погружают во флакон, содержащий 100 - 200 мл 1% пептонной воды и агглютинирующую холерную О-сыворотку в разведении до половины ее титра. В один и тот же флакон берут материал от 10 лиц. Флаконы помещают в термостат при 37 0 С. Через 3 - 4 часа холерные вибрионы начинают агглютинироваться и постепенно (в течение ближайших 2 часов) падают в виде хлопьев на дно флакона. Исследуя под микроскопом окрашенные мазки и “висячую каплю”, обнаруживают склеившихся и частично свободных вибрионов. Через 6 часов дается ответ и в случае обнаружения холерных вибрионов немедленно производится посев индивидуально от каждого из 10 лиц. Такой метод дает возможность исследовать до 16 000 человек за 3 - 4 дня.
Метод иммунодиагностической микропленки. Изучение антигенных свойств холерных вибрионов проводят путем постановки пробирочной или пластинчатой реакции агглютинации с использованием сухих лиофилизированных диагностических агглютинирующих холерных 0-сывороток и сывороток Огава и Инаба. Сыворотку разводят в физиологическом растворе или дистиллированной воде и смешивают при постановке агглютинации на стекле с исследуемой культурой вибрионов. При подготовке сыворотки используется дополнительная посуда, что усложняет работу бактериолога, а в оставшейся разведенной сыворотке быстро прорастает бактериальная микрофлора и инактивирует ее.
Для изучения антигенной структуры холерных вибрионов были разработан иммунодиагностический препарат в виде микропленок разового применения, который обладал достаточной специфичностью, демонстративностью и экономичностью. Иммунодиагностические холерные микропленки (ИХМП) в виде полимерной пленки с нанесенными высушенными каплями, фиксированными на бумаге, содержат минимальное количество сыворотки, пленкообразующий компонент и консервант. Пленкообразующий компонент связывает, склеивает и фиксирует микроколичества ингредиентов к поверхности носителя, исключает крошение микропленок; консервант предохраняет препарат от разрушения при длительном хранении.
Концентрация диагностической сыворотки в ИХМП является достаточной, поскольку после эмульгирования в капле физраствора, антитела содержатся в титре 1:100, что полностью обеспечивает ход реакции. Тем самым обеспечивается достаточная концентрация антител, снижается, расход диагностической сыворотки и исключается возможность ее неиспользования. При этом создаются условия для быстрого растворения ИХМП, контакта ее с холерными вибрионами и проведения реакции непосредственно на полимерной пленке.
Готовые ИХМП хранят в темном сухом месте при 4-- 7°С в картонных коробках (срок годности 3 года -- срок наблюдения) и по мере надобности ИХМП используют для определения холерных вибрионов. Для исключения случайного заражения окружающих предметов ИХМП помещают в чистую чашку Петри. На поверхность ИХМП наносят каплю физиологического раствора, в которой растворяют ее. Разведенную сыворотку смешивают с изучаемой культурой вибрионов, снятой бактериологической петлей с питательной среды. При другом варианте постановки реакции ИХМП снимают скальпелем с бумажной подложки и переносят на предметное стекло, растворяют в капле физиологического раствора и смешивают с изучаемой культурой вибрионов.
При положительной реакции через 1--3 мин появляются зерна агглютината, окрашенные в зеленый цвет, а капля просветляется. При отрицательной реакции капля остается гомогенно-мутной.
Использованную часть полимерной пленки отрезают, а оставшуюся часть пленки с ИХМП сохраняют в той же чашке Петри для дальнейших исследований. Использование ИХМП в исследованиях вибрионов и других микроорганизмов позволяет получить статистически достоверные результаты, сэкономить дорогостоящие диагностические сыворотки, повысить качество и эффективность исследований.
Реакция агглютинации микрометодом. В последнее время в бактериологической практике нашел довольно широкое применение микрообъемный метод постановки серологических реакций с использованием специальных планшеток и микротитровальных игл .
Реакции агглютинации микрометодом ставят с холерными агглютинирующими референс-сыворотками в полистроловых микротитровальных планшетках с плоским или V-образ-ным дном, предназначенных для иммунологических реакций, используются мпкротитровальные планшетки с объемом лунок 0,4 мл и в пробирках параллельно. Предварительно планшетки тщательно промывfют проточной водой, каждую лунку прополаскивали дистиллированной водой и хорошо просушивали, затем делали надписи простым карандашом.
Во все лунки четырех рядов пипеткой-капельницей из микротитратора Такачи вносят 0,85% раствор хлористого натрия (рН 7,2) в объеме 0,05 мл, затем в первую лунку каждого ряда -- того же объема соответствующей сыворотки в разведении 1:25 и проводят ее титрацию микротитроваль-ной иглой с головкой (объем 0,05 мл), удаляя из последней лунки по 0,05 мл.
После титрации сывороток во все лунки, кроме их контролей, вносят 0,05 мл взвеси исследуемой агаровой культуры. Эту манипуляцию проводят на подносе.
По окончании титрации планшет накрывают крышкой и ставят на подносе в термостат при 37° С. После 2-часовой экспозиции проводят окончательный учет реакции под стереомикроскопом (МБС-1, МБС-2) в косопроходящем свете. При учете реакции крышку с планшетки не снимают, в случае ее запотевания заменяют другой.
После учета реакции планшетку и крышку складывают в кювет и заливают 5'% хлорамином так, чтобы все лунки планшетки были заполнены дезраствором.
Исследования показали, что все холерные вибрионы классического и эльтор биоваров агглютинируются холерной видовой 0-сывороткой в микрообъемах.
Что касается агглютинабельности типоспецифическими сыворотками, то прослеживается следующая закономерность:
при постановке с сывороткой Инаба в микрометоде агглютинировались 100, а в пробирках--90% штаммов классического холерного вибриона серовара Инаба. Холерные вибрионы биовара эльтор серовара Инаба агглютинировались в планшетках и пробирках соответственно в 95 и 96% случаев. У холерных вибрионов классического и эльтор биоваров серовара Огава соотношения в обеих методиках были практически те же.
Интересен факт, что при постановке реакции агглютинации с RO-сывороткой наибольшее число штаммов, агглютинирующихся RO-сывороткой до титра, было выявлено в микрометоде; в пробирках агглютинация установлена у одного штамма.
Все штаммы вибрионов 040--056 сероваров в микрометоде не агглютинировались холерными агглютинирующими сыворотками, а в пробирках штамм II 258-1099 (040 серовара) агглютинировался всеми холерными сыворотками.
Большинство изученных штаммов представителей семейства Enterobacteraceae также не агглютинировалось холерными агглютинирующими сыворотками, за исключением Sh. flexneri 2503, у которого в пробирках была выявлена агглютинация со всеми сыворотками, и штамма S. typhimurium 21, у которого отмечена неспецифическая реакция агглютинации со всеми сыворотками как в пробирках, так и в планшетках.
При пользовании этим методом расход агглютинирующих сывороток уменьшается в 10 раз, значительно сокращается время, необходимое для постановки реакции, и ускоряется срок выдачи ответа. Кроме того, описанный метод менее трудоемок. Таким образом, стандартность, достоверность полученных результатов, высокая экономичность метода позволяют рекомендовать его при идентификации холерных вибрионов, изучении штаммов и популяции штаммов холерных вибрионов по признаку агглютинабельности.
Иммобилизация вибрионов холерными сыворотками и типовыми холерными фагами. Капли испражнений или материала с поверхности пептонной воды обрабатывают холерной О-сывороткой, типовыми сыворотками Огава и Инаба или типовыми холерными фагами. Готовят из них препараты “раздавленная капля”, которые исследуют с помощью темнопольной и фазовоконтрастной микроскопии. В положительном случае через 3-5 минут движение вибрионов прекращается.
РИФ. Препараты из исследуемого материала обрабатывают флюоресцирующей противохолерной сывороткой и исследуют в люминесцентном микроскопе.
Положительным результатом считается обнаружение в препарате даже единичных вибрионов с ярким желто-зеленым свечением в виде блестящего ободка по периферии клетки. Положительный результат можно получить через 1-2 часа после начала исследования при концентрации вибрионов не менее 10 6 клеток в 1 мл., поэтому рекомендуется предварительно подращивание материала на питательных средах.
Читайте также: