Мук 4 2 2410-08 организация и проведение вирусологических исследований материалов от больных полиомиелитом
| Статус документа: | Введен впервые |
| Дата начала действия: | 01 сен. 2008 г. |
| Количество страниц: | 37 стр. |
| Когда и где опубликован: | Роспотребнадзор, 2011 год |
| Разработан: |
|
| Издан: |
|
| Утвержден: |
|
| Содержание: | 1. Область применения 2. Общие положения 3. Организация вирусологических исследований материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого вялого паралича на полиовирусы, другие (неполно) энтеровирусы 4. Правила сбора, маркировка, хранения и транспортирования материалов для исследования 4.1. Клинические материалы 4.2. Изоляторы полиовирусов, других (неполио) энтеровирусов 4.3. Маркировка материалов 4.4. Упаковка и транспортирование материалов для исследования 5. Порядок проведения вирусологических исследований 5.1. Получение и подготовка проб для исследования 5.1.1.Получение и регистрация проб 5.1.2. Подготовка фекальных проб для исследования в культуре клеток 5.1.3. Приготовление проб, отобранных с помощью ректального тампона 5.1.4. Приготовление секционных проб 5.2. Выделение и идентификация вирусов 5.2.1. Клеточные линии, рекомендуемые для выделения полиовирусов. Основные принципы работы 5.2.2. Выделение полиовирусов, других (неполио) энтеровирусов 5.2.3. Идентификация выделенных полиовирусов 5.2.4. Идентификация выделенных других (неполно) энтеровирусов 5.3. Внутритиповая дифференциация полиовирусов 5.4. Сроки хранения материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом ОВП, а также от лиц общавшихся с ними 5.5. Выявление и титрование нейтрализующих антител к полиовирусу 6. Обеспечение биологической безопасности при проведении вирусологических исследований материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого вялого паралича Приложение 1. Нормативные ссылки Приложение 2. Определение приоритетного ("горячего") случая острого вялого паралича Приложение 3. Приготовление сред и растворов Приложение 4. Направление на лабораторное исследование Приложение 5. Приготовление и титрование референс-штаммов (вакционных штаммов Сэбина) вируса полиомиелита типов 1,2 и 3 Приложение 6. Проведение реакции нейтрализации для определения титра нейтрализующих антител к полиовирусу Приложение 7. Список лабораторий Российской Федерации, осуществляющих вирусологические исследования материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого вялого паралича |
| Ссылки в документе: |
|
| Разделы классификатора: |
|
Отзывы
Нет отзывов, пока еще.
МУК 4.2.2410-08 Организация и проведение вирусологических исследований материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого вялого паралича (ОВП)
Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор за полиомиелитом, острыми вялыми параличами в рамках Национального плана действий по поддержанию свободного от полиомиелита статуса Российской Федерации, а также могут быть использованы специалистами организаций здравоохранения, сотрудниками научно- исследовательских институтов и других заинтересованных организаций. В методических указаниях определены требования к порядку сбора, упаковки, хранения, транспортирования и проведения вирусологических исследований материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого вялого паралича (ОВП) в целях установления этиологических агентов заболеваний, а также изучения циркуляции полиовирусов, других (неполио) энтеровирусов среди населения.
Методическое письмо
Нормативные и методические документы:
- Е.П. Деконенко - Руководителем клинического отдела ГУ ИПиВЭ им. М.П. Чумакова РАМН, председателем комиссии по диагностике полиомиелита и ОВП, доктором медицинских наук, профессором;
- В.П.Грачевым - Главным научным сотрудником ГУ ИПиВЭ им. М.П. Чумакова РАМН, доктором биологических наук, профессором ;
- Шакаряном А.К. - Научным сотрудником клинического отдела ГУ ИПиВЭ им. М.П. Чумакова РАМН,
- Чернявской О.П. - Заведующей отделом обеспечения эпидемиологического надзора ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора,
- Морозовой Н.С. - Заведующей отделением кишечных инфекций ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора,
- Петиной В.С. - Заместителем начальника отдела эпидемиологического надзора Управления Роспотребнадзора по г. Москве.
Общие сведения об остром полиомиелите
Острый полиомиелит относится к инфекционным заболеваниям вирусной этиологии и характеризуется разнообразием клинических форм - от абортивных до паралитических. Паралитические формы возникают при поражении вирусом серого вещества, расположенного в передних рогах спинного мозга и двигательных ядрах черепно-мозговых нервов. Клинически это выражается развитием вялых или периферических парезов и параличей. Наиболее часто острый полиомиелит возникает в результате инфицирования одним из трёх типов вируса полиомиелита.
Резервуаром и источником возбудителя является человек, больной или носитель. Полиовирус появляется в отделяемом носоглотки через 36 ч., а в испражнениях 72 ч. после заражения и продолжает обнаруживаться в носоглотке в течение одной, а в испражнениях - в течении 3-6 нед. Наибольшее выделение вируса происходит в течение первой недели заболевания.
Механизм передачи возбудителя фекально-оральный, пути передачи -водный, пищевой и бытовой. Важное значение имеет и аспирационный механизм с воздушно-капельным и воздушно-пылевым путями передачи.
Естественная восприимчивость людей высокая, однако клинически выраженная инфекция встречается гораздо реже носительства: на один манифестный случай приходится от 100 до 1000 случаев бессимптомного носительства полиовируса. Поэтому, с точки зрения эпидемиологической значимости, случаи бессимптомного носительства или бессимптомной инфекции представляют большую опасность.
Постинфекционный иммунитет типоспецифический пожизненный.
Основные эпидемиологические признаки.
В довакцинальный период распространение заболевания носило повсеместный и выраженный эпидемический характер. В условиях умеренного климата наблюдалась летне-осенняя сезонность.
Поствакцинальный период характеризуется резким снижением заболеваемости. Заболевание регистрируется в основном у детей, не привитых против полиомиелита или привитых с нарушением календаря профилактических прививок.
Длительность инкубационного периода при остром полиомиелите колеблется от 4 до 30 дней. Наиболее часто этот период длится от 6 до 21 дня. Первичное размножение и накопление вируса происходит в глотке и кишечнике. В последующем, вирус попадает в лимфатическую систему и затем в кровь. Следующим за вирусемией этапом развития болезни является проникновение вируса в центральную нервную систему. Это происходит через эндотелий мелких сосудов или по перефирическим нервам.
Типичным для острого полиомиелита является поражение вирусом крупных двигательных клеток - мотонейронов, расположенных в сером веществе передних рогов спинного мозга и ядрах двигательных черепно-мозговых нервов в стволе головного мозга. Частичное повреждение мотонейронов или полная гибель их приводит к развитию вялых парезов или парличей мышц лица, туловища, конечностей. Воспалительный процесс по типу серозного менингита развивается и в оболочках мозга. Мозаичность поражения нервных клеток находит своё клиническое отражение в ассиметричном беспорядочном распределении парезов и относится к типичным признакам острого полиомиелита.
Улучшение санитарно-гигиенических условий способствует ограничению распространения полиовируса, однако единственным специфическим средством предупреждения паралитического полиомиелита остается иммунизация живой оральной полиомиелитной вакциной (ОПВ) из аттенуированных штаммов Сэбина или инактивированной полиомиелитной вакциной (ИПВ). Вакцинация проводится в соответствии с Национальным календарем профилактических прививок.
Клиническая картина непаралитических форм острого полиомиелита
Инапарантная форма протекает как вирусоносительство и не сопровождается клиническими симптомами. Диагностика осуществляется только по данным вирусологического обследования.
Абортивная форма (малая болезнь) характеризуется следующими симптомами: умеренная лихорадка, интоксикация, головная боль, иногда незначительные катаральные явления со стороны верхних дыхательных путей, разлитые неинтенсивные боли в животе, дисфункция кишечника. Признаки поражения нервной системы отсутствуют.
Менингиальная форма протекает с синдромом серозного менингита. Ликвор сохраняет прозрачность, давление обычно повышено. Количество клеток в ликворе увеличивается от нескольких десятков до 200-300 в 1 см 3 . Белок в ликворе сохраняется нормальным или умеренно повышается, что особенно характерно для случаев с болевым синдромом.
Клинические формы острого паралитического полиомиелита
На правах рукописи
Иванова Ольга Евгеньевна
Вирусологический мониторинг
как ключевой элемент контроля выполнения в Российской Федерации
программы ликвидации полиомиелита
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН.
Научный консультант: доктор медицинских наук,
профессор, академик РАМН
Дроздов Сергей Григорьевич
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,
профессор, академик РАМН
Семёнов Борис Фёдорович
доктор медицинских наук,
Карпович Лидия Григорьевна
доктор биологических наук,
Тихонова Нина Тимофеевна
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат биологических наук Медведкина О.А.
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. ХХ век был ознаменован фундаментальными открытиями в области биологии и медицины, которые предоставили новые возможности для всестороннего изучения, диагностики, терапии и предупреждения инфекционных заболеваний. Впечатляющим итогом борьбы с инфекциями стала успешное завершение в 1980 г. Программы Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) по ликвидации оспы. В 1988 г. Всемирная Ассамблея Здравоохранения приняла решение о глобальной ликвидации полиомиелита (Resolution WHA 41.28. WHO, 1988), а страны-члены ВОЗ, в том числе Российская Федерация (РФ), приступили к его выполнению. Так как вирус полиомиелита (полиовирус, ПВ) вызывает клинически выраженное заболевание только у незначительного числа инфицированных, критерием ликвидации полиомиелита является ликвидация дикого ПВ. Поэтому для реализации программы ликвидации полиомиелита было необходимо создание и практическое внедрение чувствительной, достоверной, максимально полной системы вирусологического подтверждения отсутствия а) случаев заболевания, вызванных диким ПВ, и б) дикого ПВ в любых возможных материалах (клинических пробах, пробах из объектов окружающей среды). Учитывая глобальный характер программы, система должна отвечать таким требованиям, как стандартность используемых реагентов, диагностических методов, систем и лабораторных процедур, скорость выполнения исследований, возможность анализа и оценки получаемых результатов экспертами ВОЗ.
Для максимально полного слежения за ПВ стратегия ВОЗ основывается не на клинической диагностике, как это было при ликвидации оспы, а на эпидемиологическом надзоре за заболеваниями с синдромом острого вялого паралича (ОВП). Этот вид надзора является менее специфическим, но, при соблюдении необходимых критериев (выявление не менее 1 случая ОВП на 100 тыс. детей в возрасте до 15 лет) более чувствительным (de Quadros et al., 1997; Aylward et al., 2000). Так как заболевание с синдромом ОВП может быть следствием многих причин - инфицирования ПВ, неполиомиелитными энтеровирусами (НПЭВ), другими нейротропными вирусами, бактериальными и паразитарными организмами, воздействия токсинов, травматических поражений и т.д. (Marx et al., 2000), каждый случай ОВП должен быть вирусологически исследован для установления этиологии заболевания. Если данные надзора за ОВП в течение 3-х лет подтверждают отсутствие дикого ПВ на определённой территории (регионе, стране), то ВОЗ рассматривает их как доказательство прекращения циркуляции на этой территории.
Национальная программа ликвидации полиомиелита РФ, принятая в 1996 г. (Приказ МЗ РФ № 336/142, 1996), явилась частью Европейской региональной и Глобальной программы ликвидации этого заболевания. К этому времени в РФ проблема полиомиелита как инфекционного заболевания, поражающего ежегодно сотни тысяч детей, была практически решена благодаря массовой вакцинации с помощью оральной полиовирусной вакцины (ОПВ). В 1990-94 гг. ежегодно регистрировали от 3 до 17 случаев паралитического полиомиелита, показатель заболеваемости на 100 тыс. не превышал 0,01-0,05 (Онищенко и др., 2008). Однако политические и социальные изменения, произошедшие в странах, прежде объединённых в составе СССР, привели к разрушению системы вакцинопрофилактики и негативно отразились на ситуации с полиомиелитом. В 1994-95 гг. на долю бывших республик СССР (Таджикистан, Узбекистан, Украина, Азербайджан, Туркменистан) приходилось более 80% случаев полиомиелита в Европейском регионе ВОЗ (Королёва и др., 1993; Sutter et al., 1997; Oblapenko and Sutter, 1997). Методы лабораторной диагностики полиомиелита были достаточно хорошо разработаны и внедрены в практику ещё в 60-70-х гг. ХХ века, однако системы вирусологического мониторинга ПВ, предназначенной не только для вирусологических исследований заболеваний с типичными клиническими проявлениями, а для выявления и характеристики всех циркулирующих ПВ, в РФ не существовало.
Поэтому целью данной работы явилось создание системы вирусологического мониторинга ПВ, способной решать задачи программы ликвидации полиомиелита в РФ, а, следовательно, региональной и глобальной программ ВОЗ.
В задачи работы входило:
- Внедрить в РФ предложенный ВОЗ алгоритм вирусологического исследования материалов, полученных при выполнении эпидемиологического надзора за полиомиелитом и ОВП.
- Проводить в Национальной лаборатории по диагностике полиомиелита (НЛ) в ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН вирусологические исследования всех материалов, собранных при выполнении программы ликвидации полиомиелита в РФ.
- Создать в НЛ базу для обеспечения вирусологических лабораторий РФ, участвующих в реализации Программы ликвидации полиомиелита, референс-материалами (культурами клеток, вакцинными штаммами Сэбина, диагностическими и тестовыми материалами и т.д.), необходимыми для проведения вирусологических исследований.
- Проводить координационное и методическое руководство вирусологическими лабораториями РФ, участвующими в реализации Программы ликвидации полиомиелита, разработать предложения для совершенствования надзора за ПВ в РФ. Проводить анализ качества работы Национальной лабораторной сети по полиомиелиту (НЛС).
- Провести вирусологический и эпидемиологический анализ случаев заболевания полиомиелитом в РФ, установить основные характеристики случаев вакциноассоциированного паралитического полиомиелита (ВАПП) для обоснования предложений по совершенствованию вакцинопрофилактики полиомиелита в РФ.
- Обосновать необходимость проведения надзора за ПВ с помощью исследования сточных вод как важной составляющей вирусологического мониторинга ПВ.
- Получить данные о циркуляции НПЭВ в РФ.
Научная новизна.
Показано, что для получения наиболее полных сведений о циркулирующих ПВ необходима система мониторинга, которая включает исследование материалов, полученных при выполнении надзора за полиомиелитом и ОВП и исследовании сточных вод, а также вирусологический анализ всех ПВ, выделенных в лабораториях страны, в соответствии с алгоритмом вирусологических исследований, предложенным ВОЗ.
Впервые проведены широкомасштабные, систематические наблюдения за циркуляцией ПВ на территории РФ в период применения ОПВ (с 1999 по 2007 гг.). Выполнены вирусологические исследования всех материалов (образцов фекалий, сточных вод, сывороток крови, выделенных штаммов ПВ), собранных при выполнении программы ликвидации полиомиелита в РФ и направленных в НЛ в соответствии с нормативно-методическими документами РФ. Впервые установлено происхождение ПВ, выделенных из разных источников (от случаев ОВП, контактных с ними здоровых лиц, сточных вод) на территории РФ с 1999 по 2007 г.
На примере вспышки полиомиелита в Чеченской республике (ЧР) в 1995 г. впервые дана характеристика вспышки, возникшей на ограниченной территории, детское население которой имело недостаточный уровень охвата прививками против полиомиелита и низкий уровень коллективного иммунитета, при общем высоком уровне коллективного иммунитета в стране. Установлена возможность быстрого глобального распространения дикого ПВ из эндемичного региона, формирования очага циркуляции, возникновения вспышечной заболеваемости. Впервые показано, что такая вспышка имеет основные характеристики, свойственные вспышкам полиомиелита в развивающихся странах в до-вакцинальную эру.
Система мониторинга ПВ позволила впервые установить существование длительной скрытой циркуляции вирусов-производных ОПВ, которая может приводить к формированию высоко нейровирулентных вариантов вакцинородственных полиовирусов (VDPV), в популяции с высоким (более 95%) уровнем охвата прививками против полиомиелита.
Впервые установлен уровень заболеваемости и основные характеристики ВАПП в РФ в период применения для вакцинации против полиомиелита ОПВ (1998-2005 гг.). Впервые проведён анализ состояния иммунитета и преморбидного статуса детей, заболевших ВАПП.
Показано, что для эффективного мониторинга ПВ необходимо вирусологическое исследование сточных вод. Информативность и чувствительность исследований может быть повышена за счёт обследования сточных вод от отдельных групп населения, в которых наиболее вероятна циркуляция ПВ. В полевых наблюдениях выполнено сравнение эффективности 2-х методов концентрирования сточных вод.
Практическая значимость работы
Создана система вирусологического мониторинга ПВ, которая включает исследование материалов, полученных при выполнении эпидемиологического надзора за полиомиелитом и ОВП, дополнительного надзора за ПВ с помощью исследования сточных вод, анализ всех штаммов ПВ выделенных в РФ, в соответствии с алгоритмом вирусологических исследований, рекомендованным ВОЗ.
Вспышка полиомиелита в ЧР в 1995 г. показала, что при недостаточном уровне коллективного иммунитета в регионе или стране, свободной от дикого ПВ, возможно межконтинентальное распространение вируса из пока ещё существующих эндемичных резервуаров и возникновение вспышечной заболеваемости. Для предупреждения такого развития событий необходимо продолжать вакцинацию против полиомиелита и надзор за ПВ на уровне, рекомендованном ВОЗ. Существование длительной скрытой циркуляции вирусов-производных ОПВ, которая может приводить к формированию высоконейровирулентных вариантов вакцинородственных ПВ, является веским доказательством необходимости продолжения этих мероприятий.
В полевых исследованиях показано, что эффективность двух методов концентрирования сточных вод (одномоментного и сорбционного) сопоставима; оба метода могут быть использованы для мониторинга ПВ.
Результаты анализа случаев ВАПП стали основанием для изменения схемы вакцинации против полиомиелита в РФ: с 2008 г. введена 3-х кратная вакцинация с помощью инактивированной полиовирусной вакцины (ИПВ) и ревакцинация ОПВ.
Результаты исследований были использованы при подготовке нормативных и методических документов:
Санитарные правила
- Безопасность работы с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом. СП.1.3.1325-03.-Москва.-2003.
- Профилактика полиомиелита в постсертификационный период. СП 3.1.2343-08.-Москва.-2008.
- Порядок учёта, хранения, передачи и транспортирования материалов, инфицированных или потенциально инфицированных диким полиовирусом. СП 3.1.2260-07.-Москва.-2008.
Методические указания
- Сбор и концентрирование кишечных вирусов из воды с помощью водопроницаемых пакетов с сорбентом.-Минск-1997.
- Энтеровирусные заболевания: клиника, лабораторная диагностика, эпидемиология, профилактика. МУ 3.1.1.2130-06.-Москва.-2006.
- Санитарно-вирусологический контроль водных объектов. МУК 4.2.2029-05.-Москва.-2006.
- Эпидемиологический надзор и профилактика энтеровирусной (неполио) инфекции. МУ 3.1.1.2363-08.-Москва.-2008.
- Организация и проведение вирусологических исследований материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого вялого паралича (ОВП). МУК 4.2.2410-08.-Москва.-2008.
- Организация и проведение вирусологических исследований на полиомиелит, другие(неполио) энтеровирусы материала из объектов окружающей среды. МУ 3.1.1.2357-08.-Москва.-2008.
- Эпидемиологический надзор за полиомиелитом и острыми вялыми параличами в постсертификационный период. МУ 3.1.1.2360-08.-Москва.-2008.
Основные положения, выносимые на защиту
Апробация работы состоялась на заседании межлабораторного Учёного совета Учреждения Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН 28 апреля 2009 г.
Материалы исследований были представлены и обсуждены:
- на совещаниях ВОЗ – 1-м Совещании Европейской Региональной Комиссии по сертификации ликвидации полиомиелита (Париж, Франция, 1996); Совещании по совершенствованию надзора за полиомиелитом и контролю за дифтерией (Берлин, 1996); 3-м совещании ВОЗ по вопросам координации операции МЕКАКАР (Ташкент, Узбекистан, 1996); 2-м консультативном совещании Глобальной лабораторной сети ВОЗ по полиомиелиту (Женева, Швейцария, 1996); 1-м совещании рабочей группы по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде (Женева, Швейцария, 1997); Внутрирегиональном координационном совещании ВОЗ по вопросам эпиднадзора и сертификации ликвидации полиомиелита (Киев, Украина, 1998); Совещании Региональной сертификационной комиссии по ликвидации полиомиелита по рассмотрению документации отдельных стран СНГ и Югославии (Кишинёв, Молдова, 2000); Суб-Региональном совещании координаторов по безопасному лабораторному хранению диких полиовирусов (Вена, Австрия, 2001); Совещании по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде (Копенгаген, Дания, 2002); 12-м консультативном совещание глобальной лабораторной сети по полиомиелиту ВОЗ (Женева, Швейцария, 2006); Совещании Европейской Региональной лабораторной сети по диагностике полиомиелита (Рим, Италия, 2006); Объединённом совещании по вопросам контейнмента и лабораторной сети по полиомиелиту Европейского региона ВОЗ (Мальта, Ст.Джулиан, 2007);
Публикации. По результатам работы опубликовано 70 печатных работ; основные материалы представлены в 26 статьях в реферируемых научных журналах, из них 8 опубликованы за рубежом, в одной монографиии, 2 статьях в сборниках.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 273 страницах машинописного текста, состоит из введения, 7 глав (6 глав включают данные литературы, описание использованных материалов и методов, результаты собственных исследований), обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 284 источника (67 отечественных и 217 иностранных). Работа содержит 39 таблиц и 17 рисунков.
Содержание работы
Материалы и методы исследований
Алгоритм вирусологического исследования образцов фекалий (сточных вод) соответствовал рекомендациям ВОЗ (WHO, 1997; WHO, 2004; WHO, 2003) и включал следующие этапы: подготовку фекальных проб (проб сточных вод) для исследования; выделение вируса на культуре клеток; идентификацию вируса; внутритиповую дифференциацию (ВТД) ПВ; генетическую характеристику (при получении противоречивых результатов в одном из двух методов ВТД).
Использовали культуры клеток, референс-штаммы (вакцинные штаммы Сэбина 3-х типов) и диагностические системы, рекомендованные и полученные из источников ВОЗ. Выделение ПВ и НПЭВ из образцов фекалий и сточных вод проводили на культурах клеток RD, HEp-2, L20B, полученных из RIVM, Bilthoven, Нидерланды и CDC, Атланта, США. Идентификацию выделенных изолятов проводили в реакции нейтрализации микрометодом. Для идентификации ПВ использовали поликлональные моноспецифические кроличьи анти-сыворотки (RIVM), для идентификации НПЭВ – пулы иммунных к НПЭВ лошадиных сывороток (RIVM), позволяющих идентифицировать 20 серотипов вирусов ЕСНО (Е), вирус Коксаки А9 (САV9), серотипы 1-6 вирусов группы Коксаки В (СВV). Идентификацию штаммов НПЭВ, которые не могли быть идентифицированы в реакции нейтрализации, выполняли методом анализа частичной нуклеотидной последовательности для области генома VP1 (Nix et al, 2006; секвенирование выполнено А.Н.Лукашевым).
ВТД проводили с помощью а) иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием перекрёстно-адсорбированных кроличьих антисывороток к вакцинным и диким штаммам ПВ трёх серотипов (van Wezel and Hazendonk, 1979; van der Avoort et al., 1995) производства RIVM и б) метода диагностической полимеразной цепной реакции (ПЦР), разработанного Yang et al., 1991, с праймерами, специфичными к вакцинным штаммам Сэбина,
Таблица 1
Виды материалов и объем выполненных исследований
Методы вирусологической (в том числе и серологической) диагностики полиомиелита применяются в зависимости от задач, которые возникают в каждом отдельном случае. При наличии ясной клинической характеристики в типичных паралитических случаях болезни следует определить иммунологический тип и генетические признаки вирусного штамма, вызвавшего данное заболевание. Но, конечно, в этих случаях клиницист не очень заинтересован в вирусологическом подтверждении диагноза и обычно удовлетворяется результатами обследования на антитела в парных пробах крови. Следует указать на возможность ошибочного клинического диагноза полиомиелита даже в паралитических случаях, т. к. описаны сходные с полиомиелитом заболевания, вызванные вирусами из группы Коксаки и ЕСНО (М.П. Чумаков, М.К. Ворошилова и др., 1959). Поэтому необходимо вирусологическое подтверждение даже в ясных для клинициста случаях.
В непаралитических и абортивных случаях полиомиелита, когда клиническая и клинико-лабораторная диагностика недостаточно обоснована, выделение из патологических субстратов и определение типа вируса в сочетании с результатами серологического обследования может подтвердить или отвергнуть предполагаемый диагноз полиомиелита, что имеет практическое значение (например, для организации противоэпидемических мероприятий).
Многие агенты могут вызывать синдром асептического менингита, который нельзя без лабораторного исследования отличить от непаралитической формы полиомиелит. Серозный менингит, не отличимый от непаралитической формы полиомиелита, могут вызывать следующие вирусы: возбудители свинки (паротита), лпмфоцитарного хориоменингита, ряд вирусов из групп ЕСНО и Коксаки, герпес простой, герпес зостер, вирусные энцефалиты, кроме того, лептоспиры и др. Чаще всего приходится проводить одновременное обследование материала на присутствие вируса полиомиелита и других энтеровирусов (Коксаки, ЕСНО, РЭО-групп). И, наконец, вирусологические, серологические методы исследования приобретают особое значение для контроля качества профилактических прививок пероральной полиомиелитной живой вакциной, напр. для определения частоты хорошей прививаемости живой вакцины по результатам выделения вакцинных штаммов из кишечного содержимого или из глоточного отделяемого у привитых и контактирующих с ними лиц, а также по динамике нарастания уровней антител в крови у вакцинированных людей. Периодически могут потребоваться выборочные обследования здорового населения на распределение уровней антител к разным типам полиовирусов, а также на частоту спонтанного носительства штаммов вируса полиомиелита и других энтеровирусов.
Материал для обследования. Полиовирус можно выделить заражением обезьяны или восприимчивых тканевых культур, в отдельных случаях также хлопковых крыс и новорожденных белых мышей (для штаммов II и IV типов). Вирусы ЕСНО и нескольких типов Коксаки могут быть выделены заражением культур, а большинство вирусов Коксаки группы А только заражением новорожденных белых мышей. Фекалии больного или здорового человека в очаге инфекции представляют наиболее богатый и регулярный источник для изоляции полиовируса и других энтеровирусов. Полиовирус в фекалиях может обнаруживаться в течение 2—3 недель, иногда 12 недель и больше после начала болезни или скрытой инфекции; максимальное количество полиовируса в фекалиях — до 10 инфекционных доз в 1 г.Выделение энтеровирусов возможно также из сточных вод канализации, из мух и других объектов внешней среды, которые могут быть загрязнены фекалиями. Полиовирус можно выделить также из носоглоточных смывов и тампонов из зева вскоре после начала заболевания или при скрытой инфекции (примерно в течение первой недели).
Исследование крови на присутствие вируса полиомиелита (например, вакцинного штамма) чрезвычайно трудоемкое, сложное и возможно только при решении экспериментальных задач в особых условиях. Исследование спинномозговой жидкости при полиомиелите нецелесообразно.
В секционных случаях следует получить асептично пробы из спинного (шейного и поясничного отделов) и продолговатого мозга по 2 см 3 (способ сохранения при 1° 4° в 50% растворе нейтрального глицерина или в замороженном состоянии без глицерина); кроме того, следует в этих случаях обследовать на вирус содержимое кишечника (5—15 г)пли отмытую ткань кишечной стенки на разных уровнях. Все пробы должны пересылаться в лаборатории и сохраняться на холоду (при 1° от -(-4 0 до +8°) или в замороженном виде (от —20° до -70°).
Подготовка обследуемых материалов для заражения культур или животных предусматривает обязательное удаление бактериальных контаминантов путем обработки проб антибиотиками (смесью пенициллина от 500 до 10 000 ЕД в 1 мл,стрептомицина — 500—2000 [в 1 мли, возможно, других антибиотиков). Раньше для этих целей применялась обработка проб эфиром, но она уступает антибиотикам по эффективности. До обследования экстракты фекалий с антибиотиками (20 или 10% взвеси) следует освободить от грубых частиц путем центрифугирования.
Методика исследования. При первичном выделении вирусов из группы Коксаки заражаются в мозг и подкожно новорожденные белые мыши в возрасте не старше 24 час. Молодые белые мыши и хлопковые крысы могут быть заражены материалом, содержащим полиовирус II типа, в головной мозг или в спинной мозг и в брюшную полость, или внутримышечно. Для перевивки вируса от заболевших к свежим животным используется взвесь спинного и головного мозга.
Обезьяны макаки (любой вид), мартышки и др. могут быть заражены материалом, содержащим вирус полиомиелита, разными путями: в головной или в спинной мозг (по 1,0 или 0,2 млсоответственно), через нос под легким наркозом (можно 3—5 дней подряд), в брюшную полость и внутримышечно. В пассажах на обезьянах используется ткань спинного и продолговатого мозга заболевших животных.
Наиболее употребительны в наст, время культуральные пробирочные методы вирусологической и серологической диагностики как самые дешевые и доступные для обследования большого числа проб. Благодаря целой серии исследований Эндерса, Солка, Янгнера, Мельника, Дульбекко и многих других в 1949—1955 гг. были разработаны эффективные методики выделения, размножения и идентификации энтеровирусов в культурах клеток.
Выделение и размножение вируса полиомиелита для лабораторных целей возможно в первичных культурах нормальных тканей от человека (хирургические отходы и эмбрионы) или разных видов обезьян. Для этого чаще всего использовались фибробласты кожно-мышечной ткани, клетки почек, семенника, амниона и др. Кроме того, могут с успехом использоваться вторичные культуры или лабораторные линии непрерывно растущих клеток ракового происхождения (часто применялись лабораторные линии клеток человеческого рака: Не1а, НЕР-2, КВ, НЬ8, Детройт-6 и др.), а также непрерывные линии клеток, происходящих от нормальных тканей (напр., клетки амниона человека и клетки СОЦ— из сердца обезьяны циномольгус). Кроме того, оказалось, что в ряде случаев непрерывные лабораторные линии клеток, происходящие от животных (кроликов, свиней), не восприимчивых к полиомиелиту, могут становиться полностью восприимчивыми к заражению полиовирусом в результате происходящей трансформации (возможно ма-лигнизации ткани) в процессе длительных пассажей непрерывно растущих клеток.
Культуры клеток в подходящей жидкой среде для размножения полиовируса могут изготовляться асептично разными методами (взвесь фрагментов ткани, однослойная клеточная мембрана на стекле; фиксирование фрагментов в куриной плазме; покрытие агаром клеточного слоя на стекле и т. п.) в герметически закрытых стерильных сосудах. Добавление небольшого количества антибиотиков (100—200 ЕД пенициллина, 50 цг стрептомицина на 1 млсреды) надежно предохраняет большинство асептично приготовленных культур клеток от случайного прорастания ми-кробами-контаминантами из воздуха.
О присутствии активного полиовируса в растущей культуре клеток можно судить по наступающей дегенерации клеток в результате цитопатогенного действия вируса. При этом необходимо сравнение с контрольными незараженными клетками и последующая проверка специфичности цитопатогенного эффекта в опыте нейтрализации типовой иммунной сывороткой.
Кроме того, цитопатогенное действие полиовируса во взвеси клеток можно зарегистрировать с помощью наблюдений за изменениями цвета фенолрот или другого индикатора рН среды, а именно клетки во взвеси, не содержащей полиовируса, постепенно в течение нескольких дней сдвигают рН среды в кислую сторону и цвет фенолрот меняется из красного в желтый; в то же время в пробирках с активным вирусом полиомиелита клетки быстро дегенерируют, метаболизм прекращается, кислотность среды не изменяется, и исходный красный цвет среды (с индикатором фенолрот около 0,004%) сохраняется до конца наблюдения. На этой основе разработана методика так наз. цветной пробы (или рН-тест) для выделения и титрования вируса полиомиелита, а также для определения титра антител в сыворотке. В цветной пробе могут ставиться и опыты нейтрализации с целью определения иммунологического типа обследуемого вируса.
Вирус полиомиелита можно обнаруживать и по образованию изолированных колоний, или бляшек, в культурах однослойных клеток, покрытых слоем питательного агара. Бляшкообразование в агаровых культурах растущих клеток с индикатором нейтральрот используется для точного определения титра полиовируса в материале или для дифференциации выделенных штаммов по чувствительности к снижению концентрации бикарбонатов и катионов.
Ход исследования материала в пробирочных культурах ткани на вирус полиомиелита включает следующие методики: предварительное выращивание в течение нескольких дней незараженных клеточных культур, внесение в хорошо развившиеся культуры исследуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками и др., инкубирование зараженных культур при 1° 37° и наблюдение за состоянием клеток культуры примерно в течение 10 дней. Некоторые пробы фекалий токсичны для культур, что обычно выявляется через 24 часа, и в этих случаях следует перевить материал культуры на 5-й день. Специфическое действие вируса на клетки обычно выявляется на 3—5-й день, иногда на 6—8-й день после заражения; при отсутствии дегенерации в культурах первого заражения можно попытаться продолжить наблюдение за культурами после замены среды свежей питательной жидкостью. При обнаружении дегенерации клеток зараженных культур проводится перевивка жидкости из таких культур на свежие культуры и определение в серии культур титра выделенного цитопатогенного вируса, а затем опыт нейтрализации с включением специфических иммунных сывороток. Выделение и типирование вируса можно проводить одновременно, добавляя в питательную среду культур разные виды типоспецифических иммунных сывороток; при этом вирус будет подавляться в культурах с гомотиповои иммунной сывороткой и проявлять свое действие в культурах с гетеротиповыми иммунными сыворотками или без сыворотки.
Читайте также: