Набор реагентов диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный ви-антигенный жидкий

Описание

Диагностикум Сальмонеллезный ВИ-антигенный (ВИ-Диагностикум)

сальмонеллезный Ви

Набор реагентов Диагностикум Сальмонеллезный ВИ-антигенный предназначен для выявления в сыворотке крови человека специфических антител к Ви-антигену сальмонелл тифа в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).

2.1. Принцип метода.

Действующим началом Диагностикум Сальмонеллезный ВИ-антигенный является Ви-антиген, фиксированный на поверхности эритроцитов. При взаимодействии с сыворотками, содержащими антитела к Ви-антигену, наблюдается феномен агглютинации эритроцитов.

2.2. СОСТАВ НАБОРА

Реагенты	Количество
Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный Ви-антигенный жидкий — представляет собой 1% взвесь формалинизированных и сенсибилизированных Ви-антигеном сальмонелл тифа эритроцитов барана в фосфатном буферном растворе (рН 7,2 + 0,2; концентрация 0,06 моль/л). Гомогенная суспензия коричневого цвета без хлопьев; при отстаивании образуется 2 слоя: плотный коричневый осадок эритроцитов и прозрачная желтоватая надосадочная жидкость	1 флакон — 6 мл
Сыворотка диагностическая сальмонеллезная адсорбированная рецептор Ви сухая — гомогенная масса от белого с коричневатым оттенком до бежевого цвета	1 флакон – из 0,1 мл
1 % взвесь формалинизированных, несенсибилизированных эритроцитов барана — гомогенная суспензия коричневого цвета без хлопьев; при отстаивании образуется 2 слоя: плотный коричневый осадок эритроцитов и прозрачная желтоватая надосадочная жидкость	1 флакон – 1 мл
Раствор для разведений сыворотки и постановки РПГА — 0,9 % раствор натрия хлорида — прозрачная бесцветная жидкость, рН от 6,5 до 7,5	2 флакона – по 8 мл
Планшет круглодонный для иммунологических реакций однократного применения — состоит из 8 рядов, каждый из которых включает в себя 12 лунок с прозрачным, бесцветным, круглым дном	1 шт

3.1. Диагностикум должен агглютинироваться в РПГА сывороткой диагностической сальмонеллезной адсорбированной рецептор Ви сухой в разведении не менее чем 1:160.

Условным уровнем диагностической характеристики сыворотки крови здоровых людей следует считать разведение сыворотки не выше 1:20.

3.2. Время проведения анализа – 2 ч.

3.3. Набор рассчитан на 8 определений.

При работе с набором следует соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР (М., 1981 г.).

Анализируемые сыворотки, а также находящиеся с ними в контакте реагенты следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять или передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусной инфекции — обращаться с ними следует осторожно:

• работать в резиновых перчатках;
• при пипетировании необходимо пользоваться автоматическими дозаторами;
• при завершении работы анализируемые сыворотки и находящиеся с ними в контакте реагенты, инструменты подвергать обработке дезинфицирующим раствором
• оборудование до и после работы протирать 70 % этиловым спиртом.

Анализируемые сыворотки должны быть инактивированы при температуре 56 0 С в течение 30 мин.

Входящая в состав набора сыворотка диагностическая сальмонеллезная адсорбированная рецептор Ви сухая инактивирована.

Объективные результаты анализа гарантируются при выполнении следующих условий:

• хранение всех реагентов набора осуществлять при температуре от 2 до 8 0 С;
• не использовать реагенты с истекшим сроком годности;
• не использовать реагенты набора при отсутствии на их упаковке соответствующей маркировки;
• для проведения РПГА использовать реагенты, входящие только в данный набор.

Диагностикум Ви-антигенный эритроцитарный сальмонеллезный жидкий для РПГА. (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера)

Набор реагентов "Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный Vi-антигенный для РПГА" (СЭД-Vi)

Набор реагентов предназначен для выявления антител к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа в сыворотках крови в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).

При наличии антител к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа наблюдается гемагглютинация куриных эритроцитов, сенсибилизированных Vi-антигеном. Это приводит к образованию на дне лунок планшета с U-образным дном "зонтика" из осевших эритроцитов. При отсутствии антител к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа осевшие эритроциты образуют "точку".

Набор рассчитан на исследование 42 сывороток крови в варианте скрининга или 10 сывороток крови в варианте их раститровки.

Набор предназначен только для in vitro диагностики. Компоненты набора безопасны, однако исследуемые сыворотки крови, а также находившиеся с ними в контакте реагенты, оборудование и инструменты могут представлять собой потенциально инфекционный материал. При работе с ними следует принимать следующие меры предосторожности:

* работать в резиновых перчатках;

* после завершения работы исследуемые образцы сыворотки крови, находившиеся с ними в контакте реагенты и инструменты дезинфицировать растворами 6 % перекиси водорода или 70 % этилового спирта, или 3 % хлорамина Б в соответствии с СП 1.3.2322-08.

При работе с набором следует соблюдать "Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР" (Москва, 1981 г.).

Подготовка исследуемых образцов

Исследуемые образцы сыворотки крови хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 3 суток от момента взятия крови. Допускается хранение сыворотки в замороженном состоянии при температуре минус 18 °С и ниже не более 1 года. Перед использованием образцы размораживают при комнатной температуре и перемешивают встряхиванием. Повторное замораживание не допускается. Нельзя использовать образцы с выраженным бактериальным проростом.

Подготовка контрольной сыворотки (К+)

Готовят рабочий раствор сыворотки сальмонеллезной адсорбированной рецептор Vi (К+) в разведении 1:10. Для этого содержимое флакона с К+ растворяют добавлением 1 мл раствора ФБР. Хранят (аликвотами по 0,2 мл) в замороженном состоянии при температуре минус 18 °С и ниже не более 6 месяцев.

Подготовка эритроцитарного диагностикума (СЭД)

К содержимому флакона с СЭД добавляют 0,6 мл дистиллированной воды и оставляют для гидратации на 2 ч при комнатной температуре. Затем к раствору добавляют 2,4 мл раствора ФБР. Хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 6 месяцев. Замораживание не допускается.

Постановка РПГА при скрининге сывороток

Сыворотки крови для скринингового исследования разводят в парных лунках планшета (на каждую сыворотку используется две лунки) следующим образом:

* предварительные разведения 1:20 готовят в первых лунках, внося в них сначала по 190 мкл раствора РИП, а затем - по 10 мкл исследуемых сывороток, и перемешивают трехкратным пипетированием (цвет растворов в лунках после добавления сывороток должен измениться с сине-фиолетового на зеленый);

* скрининговые разведения 1:40 готовят во вторых лунках, внося в них сначала по 25 мкл раствора ФБР, а затем - по 25 мкл предварительно разведенных сывороток, и перемешивают трекратным пипетированием.

При каждой постановке РПГА необходимо проводить контрольное определение титра К+. Для этого в 8 лунок длинного ряда вносят по 50 мкл раствора ФБР. Затем в первую лунку вносят 50 мкл рабочего раствора К+, перемешивают пипетированием и переносят в следующие лунки по 50 мкл, получая 2-кратные разведения от 1:20 до 1:2560. Еще в 4 лунки вносят по 50 мкл раствора ФБР для контроля СЭД на отсутствие спонтанной агглютинации.

В лунки со скрининговыми разведениями исследуемых сывороток и контролями вносят по 25 мкл СЭД. Суспензию СЭД во флаконе или ванночке перед использованием перемешать! После внесения СЭД содержимое лунок перемешивают постукиванием о край планшета. Планшет выдерживают при комнатной температуре в течение 30 - 40 минут.

Учет результатов при скрининге сывороток крови

Учет результатов проводят по условной шкале четырех крестов:

* ++++ (4+) - эритроциты образуют на дне лунки перевернутый "зонтик", края его опадают;

* +++ (3+) - эритроциты образуют на дне лунки перевернутый "зонтик", края его ровные;

* ++ (2+) - эритроциты образуют на дне лунки тонкое кольцо;

* + (1+) - эритроциты образуют на дне лунки плотное кольцо или диск;

* (-) - эритроциты образуют на дне лунки точку.

Положительным результатом считают гемагглютинацию не менее, чем на 3 (+++) креста.

Контролем качества диагностикума служат 4 лунки контрольного ряда, в которые вносили только раствор ФБР и СЭД. В этих лунках не должно быть спонтанной агглютинации (-). В этом случае следует повторить исследование. Если при повторном исследовании появляется агглютинация, то препарат не используют.

Сыворотки с отрицательным результатом следует считать не содержащими антител к Vi-антигену в диагностическом титре 1:40 и ниже.

Сыворотки, дающие положительный результат в разведении 1:40, необходимо исследовать повторно в варианте с раститровкой сыворотки для установления ее титра.

Результаты можно считать достоверными только в том случае, если титр прилагаемой контрольной сыворотки (К+) не ниже, чем ½ титра, указанного на ее этикетке.

Поствновка РПГА при раститровке сывороток крови

Раститровку исследуемых сывороток и рабочего раствора К+ проводят в коротких рядах планшета. Еще один короткий ряд используют для контроля на отсутствие спонтанной агглютинации СЭД.

В первые лунки коротких рядов для раститровки исследуемых сывороток вносят 180 мкл раствора РИП. Во все остальные лунки вносят по 50 мкл раствора ФБР.

В лунки короткого ряда для контроля диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации вносят по 50 мкл раствора ФБР.

В лунки с раствором РИП вносят 20 мкл исследуемых сывороток. Каждую сыворотку вносят индивидуальным наконечником и перемешивают раствор в лунке трехкратным пипетированием (цвет растворов в лунках должен измениться с сине-фиолетового на зеленый).

В первую лунку короткого ряда для раститровки К+ вносят 100 мкл рабочего раствора К+, в остальные лунки вносят по 50 мкл раствора ФБР.

Затем из первых лунок коротких рядов для исследуемых сывороток и контрольной сыворотки переносят по 50 мкл в следующие лунки рядов, получая двукратные разведения от 1:20 до 1:1280. В конце титрования из последних лунок растворы в объеме 50 мкл удаляют.

Во все лунки кроме первых лунок каждого короткого ряда вносят по 25 мкл СЭД. Суспензию СЭД во флаконе или ванночке перед использованием перемешать! После внесения СЭД содержимое лунок перемешивают постукиванием о край планшета. Планшет выдерживают при комнатной температуре в течение 30 - 40 минут.

Учет результатов при раститровке сывороток крови

Титром сыворотки считается ее разведение, дающее гемагглютинацию не менее, чем на 3 (+++) креста.

Контролем качества диагностикума служат лунки короткого ряда для контроля СЭД. В этих лунках не должно быть спонтанной агглютинации (-). В противном случае следует повторить исследование с диагностикумом другой серии.

Лица, у которых обнаружены антитела к Vi-антигену в титре 1:40 и выше, рассматриваются как подозрительные на хроническое носительство возбудителя брюшного тифа. Для окончательной постановки диагноза необходимо углубленное бактериологическое обследование.

Результаты можно считать достоверными только в том случае, если титр прилагаемой контрольной сыворотки (К+) не ниже, чем ½ титра, указанного на ее этикетке.

Условия транспортирования и хранения, срок годности

* Транспортирование в соответствии с СП.3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 °С. Допускается кратковременное (в течение до 10 сут.) транспортирование при температуре от 10 до 35 °С.

* Хранение в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 °С.

Срок годности - 1 год. По истечению срока годности набор реагентов использованию не подлежит.

Действующим началом диагностикума является Ви-антиген, фиксированный на поверхности эритроцитов. При взаимодействии с сыворотками, содержащими антитела к Ви-антигену, наблюдается феномен агглютинации эритроцитов.

Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный Ви-антигенный, который представляет собой 0,75 % взвесь формалинизированных и сенсибили-зированных Ви-антигеном эритроцитов человека О (I) группы крови в фос-фатном буферном растворе (рН- 7,2 ± 0,2; концентрация - 0,06 моль/л). Консервант - формалин. Гомогенная суспензия коричневого цвета без хлопьев; при отстаивании обра¬зуется 2 слоя: плотный коричневый осадок эритроцитов и прозрачная желто¬ватая надосадочная жидкость 1 флакон-3 мл.

Сыворотка диагностическая сальмонеллезная адсорбированная рецептор Ви сухая - гомогенная масса от белого с коричневатым оттенком до бежевого цвета. 1 флакон - из 0,1 мл.

Поддерживающий раствор - 0,9 % раствор натрия хлорида - прозрачная бесцветная жидкость, рН от 6,5 до 7,5. 2 флакона -по 8 мл.

Планшет круглодонный для иммунологических реакций однократного применения - состоит из 8 рядов, каждый из которых включает в себя 12 лунок с прозрачным, бесцветным, круглым дном. 1 шт.

Диагностикум должен агглютинироваться в РПГА сывороткой диагностической сальмонеллезной адсорбированной рецептор Ви сухой в разведении не ниже 1/2 их титра, но не менее, чем 1/160. Диагностикум не должен агглютинироваться сыворотками диагностичесскими сальмонеллезными адсорбированными сухими для РА: О рецептор 9 - в разведении 1:40 и выше, Н рецептор d - в разведении 1:10 и выше.

В качестве анализируемых образцов используют образцы сыворотки крови человека.
Анализируемый образец хранят в условиях, предотвращающих бактериальный пророст при температуре от 2 до 8 °С не более 72 часов. Допускается замораживание, замороженные анализируемые образцы перед исследованием разморозить при комнатной температуре.
Анализ образцов с выраженным гемолизом, бактериальным проростом, а также длительно хранившихся без замораживания или повторно замораживаемых не допускается.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Приготовление растворов для РПГА.
Флаконы с сывороткой диагностической сальмонеллезной адсорбированной рецептор Ви сухой вскрыть и добавить 1 мл прилагаемого 0,9 % раствора натрия хлорида, получив, таким образом, разведение 1:10, являющееся рабочим разведением.
Вскрытый флакон с сывороткой диагностической сальмонеллезной адсорбированной рецептор Ви сухой при разведении 1:10 в закрытом виде можно хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение одного месяца.
Диагностикум готов к применению. Перед вскрытием флакон с диагностикумом необходимо осторожно встряхнуть до получения гомогенной суспензии. В ходе работы встряхивание рекомендуется повторять.
Вскрытый флакон с диагностикумом в закрытом виде можно хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение одного месяца.
0,9 % раствор натрия хлорида. Готов к применению.

Проведение РПГА.
При контроле любого количества анализируемых сывороток обязательна постановка 1 ряда агглютинации с сывороткой диагностической сальмонеллезной адсорбированной рецептор Ви сухой.
Для постановки РПГА используют планшет для иммунологических реакций одно-кратного применения. Готовят двукратные серийные разведения анализируемых сывороток в 0,05 мл прилагаемого 0,9 % раствора натрия хлорида начиная с 1:10 до 1:2560 и 1 ряд двукратного серийного разведения сыворотки диагностической сальмонеллезной адсорбирован-ной рецептор Ви сухой, начиная с разведения 1:10, до удвоенного титра, указанного на этикетке флаконов данной сыворотки.
В каждую из лунок с разведениями сыворотки прибавляют по 0,025 мл диагностикума.

Обязательными контролями являются:
1. Контроль сыворотки диагностической сальмонеллезной адсорбированной рецептор
Ви сухой и анализированной сыворотки, которые в разведении 1:10 в объеме 0,05 мл вносят
в две контрольные лунки.
2. Проверка отсутствия спонтанной агглютинации диагностикума, для чего в две лунки, содержащие по 0,05 мл 0,9 % раствора натрия хлорида добавляют по 0,025 мл диагностикума.
Планшет встряхивают и помещают на 1,5-2,0 ч в термостат при температуре (37+1) °С.

Входящие в состав набора сыворотка диагностическая сальмонеллезная адсорбирован-ная рецептор Ви сухая инактивирована.
Анализируемые сыворотки должны быть инактивированы при температуре 56° С в течение 30 минут.
Анализируемые сыворотки, а также находящиеся с ними в контакте реагенты, оборудование и инструменты, могут представлять собой потенциально инфекционный материал, и обращаться с ним следует осторожно:
- работать в резиновых перчатках;
- при пипетировании необходимо пользоваться автоматическими устройствами;
- при завершении работы анализируемые сыворотки и находящиеся с ними в контакте реагенты, инструменты подвергать обработке дезинфицирующим раствором;
- оборудование до и после работы протирать 96 % этиловым спиртом.

Объективные результаты анализа гарантируются при выполнении следующих условий:
- хранение всех реагентов набора осуществлять при температуре от 2 до 8 °С;
- не использовать реагенты с истекшим сроком годности;
- не использовать реагенты набора при отсутствии на их упаковке соответствующей маркировки;
- для проведения РПГА использовать реагенты, входящие только в данный набор.

Назначение

Набор реагентов "Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный Vi-антигенный для РПГА" (СЭД-Vi) предназначен для выявления антител к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа в сыворотках крови людей реакцией пассивной гемагглютинации (РПГА).

Характеристика набора

При наличии антител к возбудителю брюшного тифа наблюдается гемагглютинация сенсибилизированных Vi-антигеном куриных эритроцитов, что приводит к образованию на дне U-образных лунок планшета "зонтика" из осевших эритроцитов. При отсутствии антител к возбудителю брюшного тифа осевшие эритроциты образуют "точку".

Наименование реагента	Описание	Количество в наборе
Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный Vi-антигенный, сухой 6 % (СЭД)	Формалинизированные куриные эритроциты, сенсибилизированные Vi-антигеном S.typhi. Сухая гигроскопическая масса коричневого цвета. После растворения — суспензия красно-коричневого цвета.	1 фл., из 0,6 мл
Сыворотка диагностическая сальмонеллезная адсорбированная, рецептор Vi, сухая (в разведении 1:20, (К+))	Кроличья сыворотка сальмонеллезная адсорбированная, рецептор Vi, в разведении 1:20. Сухая гигроскопичная пористая масса белого цвета. После растворения — прозрачная жидкость желтоватого цвета или бесцветная.	1 фл., из 0,3 мл
Разбавитель исследуемых проб (РИП)	Прозрачная жидкость сине-фиолетового цвета.	1 фл., 10 мл
Фосфатный буферный раствор (ФБР)	Прозрачная бесцветная жидкость.	1 фл., 10 мл
Планшет полимерный для иммунологических реакций однократного применения	Планшет полимерный для иммунологических реакций однократного применения из прозрачного бесцветного полистирола.	1 шт.

Диагностические характеристики

Диагностикум должен агглютинироваться в РПГА сывороткой диагностической сальмонеллезной адсорбированной, рецептор Vi, сухой (в разведении 1:20), до титра, указанного на этикетке сыворотки. Условным уровнем диагностической характеристики сыворотки крови здоровых людей следует считать разведение сыворотки не выше 1:20. Время проведения анализа – 3040 минут. Набор рассчитан на исследование 42 сывороток крови в варианте скрининга или 10 сывороток крови в варианте их титрования.

Набор предназначен только для in vitro диагностики. Входящие в компоненты набора вещества инактивированы и безопасны. При работе с набором следует соблюдать СП 1.3.2322-08 и СанПиН 2.1.7.2790-10.

Оборудование, материалы, растворы:

• дозаторы пипеточные 1-канальные с варьируемым объёмом дозирования 5 — 40 мкл; 40 — 200 мкл; 200 — 1000 мкл и 1000 — 5000 мкл;
• дозаторы пипеточные 8- или 12-канальные с варьируемым объемом дозирования 5 — 40 мкл и 40 — 200 мкл;
• вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72).

Исследуемые образцы сыворотки крови хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 3 суток от момента взятия крови. Допускается хранение сыворотки в замороженном состоянии при температуре не выше минус 18 °С не более 1 года. Перед использованием образцы размораживают при температуре от 16 до 25 °С и перемешивают встряхиванием. Повторное замораживание не допускается. Нельзя использовать образцы с бактериальным проростом и гемолизом. Перед постановкой реакции испытуемые сыворотки прогревают при 56 °С в течение 30 минут.

Готовят рабочий раствор сыворотки диагностической сальмонеллезной адсорбированной, рецептор Vi, сухой (в разведении 1:20) из 0,3 мл (К+). Для этого к содержимому флакона с К+ добавляют 0,3 мл фосфатного буферного раствора (ФБР). Оставшееся количество сыворотки можно аликвотировать и хранить в замороженном состоянии при температуре не выше минус 18 °С не более 6 месяцев.

Для приготовления рабочего разведения суспензии диагностикума эритроцитарного сальмонеллезного к содержимому флакона с сухим 6 % СЭД добавляют 0,6 мл дистиллированной воды и оставляют для гидратации на 2 часа при температуре от 16 до 25 °С. Затем к раствору добавляют 2,4 мл фосфатного буферного раствора (ФБР). Рабочий раствор хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 1 мес. Замораживание не допускается.

Сыворотки крови для скринингового исследования разводят в лунках планшета следующим образом:

• предварительные разведения 1:20 готовят в первых лунках планшета, внося в них сначала 190 мкл раствора РИП, затем – по 10 мкл исследуемых сывороток. Каждую сыворотку вносят отдельным наконечником и тщательно пипетируют (при этом цвет раствора в лунках после добавления сывороток должен измениться с сине-фиолетового на зеленый);
• скрининговые разведения 1:40 готовят во вторых лунках, внося в них сначала по 25 мкл раствора ФБР, а затем по 25 мкл предварительно разведенных сывороток и тщательно пипетируют.

При каждой постановке РПГА необходимо проводить контрольное определение титра К+. Для этого в 8 лунок длинного ряда вносят по 50 мкл раствора ФБР. Затем в первую лунку вносят 50 мкл рабочего раствора К+ (1:20), тщательно пипетируют и переносят в следующие лунки по 50 мкл, получая 2-кратные разведения от 1:40 до 1:5120. Еще в 4 лунки вносят по 50 мкл раствора ФБР для контроля СЭД на отсутствие спонтанной гемагглютинации.

Во все лунки планшета со скрининговыми разведениями исследуемых сывороток (кроме первых, содержащих РИП) и контролями вносят по 25 мкл СЭД. Суспензию СЭД во флаконе или ванночке перед использованием перемешать! Планшет тщательно встряхивают и оставляют при температуре от 16 до 25 °С на 30 - 40 минут до полного оседания эритроцитов в контроле.

Титрование исследуемых сывороток и рабочего раствора К+ проводят в коротких рядах планшета. Еще один короткий ряд используют для контроля на отсутствие спонтанной гемагглютинации СЭД.

В первые лунки коротких рядов для титрования исследуемой сыворотки вносят 180 мкл раствора РИП. Во все остальные лунки вносят по 50 мкл раствора ФБР.

В лунки с раствором РИП вносят 20 мкл исследуемых сывороток (получают разведение 1:10). Каждую сыворотку вносят своим наконечником и тщательно пипетируют (цвет раствора в лунках должен измениться с сине-фиолетового на зеленый). Затем из первых лунок переносят по 50 мкл в следующие лунки рядов, получая двукратные разведения от 1:20 до 1:1280. В конце титрования из последних лунок растворы в объеме 50 мкл удаляют.

При каждой постановке РПГА необходимо проводить контрольное определение титра К+. Для этого в 8 лунок длинного ряда вносят по 50 мкл раствора ФБР. Затем в первую лунку вносят 50 мкл рабочего раствора К+ (1:20), тщательно пипетируют и переносят в следующие лунки по 50 мкл, получая 2-кратные разведения от 1:40 до 1:5120.

Для контроля диагностикума на отсутствие спонтанной гемагглютинации во все лунки короткого ряда вносят по 50 мкл раствора ФБР.

Во все лунки (кроме первых лунок каждого ряда для исследуемых сывороток, содержащих РИП) вносят по 25 мкл СЭД. Суспензию СЭД во флаконе или ванночке перед использованием перемешать! Планшет тщательно встряхивают и оставляют при температуре от 16 до 25 °С на 30 — 40 минут до полного оседания эритроцитов в контроле.

Учет и интерпретация результатов

Учет результатов проводят по условной шкале четырех крестов. Титром сыворотки считается ее разведение, дающее гемагглютинацию не менее чем на 3 (+++) креста.

Положительным результатом считают гемагглютинацию нагруженных Vi-антигеном эритроцитов не менее, чем на 3 креста (+++).

Контролем качества диагностикума служат 4 лунки контрольного ряда, в которые вносили только раствор ФБР и СЭД. В этих лунках не должно быть спонтанной гемагглютинации — реакция отрицательная (-). В противном случае следует повторить исследование. Если при повторной постановке появляется гемагглютинация, то препарат не используется.

Сыворотки с отрицательным результатом следует считать не содержащими антител к Vi-антигену в диагностическом титре 1:40 и ниже.

Сыворотки, дающие положительный результат в разведении 1:40, следует исследовать повторно в варианте с титрованием сыворотки для установления ее титра.

Результаты можно считать достоверными только в том случае, если титр прилагаемой контрольной сыворотки (К+) соответствует титру, указанному на этикетке.

Титром сыворотки считается ее разведение, дающее гемагглютинацию не менее, чем на 3 (+++) креста.

Контролем качества диагностикума служат лунки ряда для контроля СЭД. В этих лунках не должно быть спонтанной гемагглютинации — реакция отрицательная (-). В противном случае следует повторить исследование. Если при повторной постановке появляется гемагглютинация, то препарат не используется.

Лица, у которых обнаружены антитела к Vi-антигену в титре 1:40 и выше, рассматриваются как подозрительные на хроническое носительство возбудителя брюшного тифа. Для окончательной постановки диагноза необходимо углубленное бактериологическое обследование этих лиц.

Результаты можно считать достоверными только в том случае, если титр прилагаемой контрольной сыворотки (К+) соответствует титру, указанному на этикетке.

Утилизация отходов после использования набора реагентов осуществляется в соответствии с СанПиН 2.1.7.279010 ("Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами").

Диагностикум Ви-антигенный эритроцитарный сальмонеллезный жидкий для РПГА. (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера)

Набор реагентов "Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный Vi-антигенный для РПГА" (СЭД-Vi)

Набор реагентов предназначен для выявления антител к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа в сыворотках крови в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).

При наличии антител к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа наблюдается гемагглютинация куриных эритроцитов, сенсибилизированных Vi-антигеном. Это приводит к образованию на дне лунок планшета с U-образным дном "зонтика" из осевших эритроцитов. При отсутствии антител к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа осевшие эритроциты образуют "точку".

Набор рассчитан на исследование 42 сывороток крови в варианте скрининга или 10 сывороток крови в варианте их раститровки.

Набор предназначен только для in vitro диагностики. Компоненты набора безопасны, однако исследуемые сыворотки крови, а также находившиеся с ними в контакте реагенты, оборудование и инструменты могут представлять собой потенциально инфекционный материал. При работе с ними следует принимать следующие меры предосторожности:

* работать в резиновых перчатках;

* после завершения работы исследуемые образцы сыворотки крови, находившиеся с ними в контакте реагенты и инструменты дезинфицировать растворами 6 % перекиси водорода или 70 % этилового спирта, или 3 % хлорамина Б в соответствии с СП 1.3.2322-08.

При работе с набором следует соблюдать "Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР" (Москва, 1981 г.).

Подготовка исследуемых образцов

Исследуемые образцы сыворотки крови хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 3 суток от момента взятия крови. Допускается хранение сыворотки в замороженном состоянии при температуре минус 18 °С и ниже не более 1 года. Перед использованием образцы размораживают при комнатной температуре и перемешивают встряхиванием. Повторное замораживание не допускается. Нельзя использовать образцы с выраженным бактериальным проростом.

Подготовка контрольной сыворотки (К+)

Готовят рабочий раствор сыворотки сальмонеллезной адсорбированной рецептор Vi (К+) в разведении 1:10. Для этого содержимое флакона с К+ растворяют добавлением 1 мл раствора ФБР. Хранят (аликвотами по 0,2 мл) в замороженном состоянии при температуре минус 18 °С и ниже не более 6 месяцев.

Подготовка эритроцитарного диагностикума (СЭД)

К содержимому флакона с СЭД добавляют 0,6 мл дистиллированной воды и оставляют для гидратации на 2 ч при комнатной температуре. Затем к раствору добавляют 2,4 мл раствора ФБР. Хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 6 месяцев. Замораживание не допускается.

Постановка РПГА при скрининге сывороток

Сыворотки крови для скринингового исследования разводят в парных лунках планшета (на каждую сыворотку используется две лунки) следующим образом:

* предварительные разведения 1:20 готовят в первых лунках, внося в них сначала по 190 мкл раствора РИП, а затем - по 10 мкл исследуемых сывороток, и перемешивают трехкратным пипетированием (цвет растворов в лунках после добавления сывороток должен измениться с сине-фиолетового на зеленый);

* скрининговые разведения 1:40 готовят во вторых лунках, внося в них сначала по 25 мкл раствора ФБР, а затем - по 25 мкл предварительно разведенных сывороток, и перемешивают трекратным пипетированием.

При каждой постановке РПГА необходимо проводить контрольное определение титра К+. Для этого в 8 лунок длинного ряда вносят по 50 мкл раствора ФБР. Затем в первую лунку вносят 50 мкл рабочего раствора К+, перемешивают пипетированием и переносят в следующие лунки по 50 мкл, получая 2-кратные разведения от 1:20 до 1:2560. Еще в 4 лунки вносят по 50 мкл раствора ФБР для контроля СЭД на отсутствие спонтанной агглютинации.

В лунки со скрининговыми разведениями исследуемых сывороток и контролями вносят по 25 мкл СЭД. Суспензию СЭД во флаконе или ванночке перед использованием перемешать! После внесения СЭД содержимое лунок перемешивают постукиванием о край планшета. Планшет выдерживают при комнатной температуре в течение 30 - 40 минут.

Учет результатов при скрининге сывороток крови

Учет результатов проводят по условной шкале четырех крестов:

* ++++ (4+) - эритроциты образуют на дне лунки перевернутый "зонтик", края его опадают;

* +++ (3+) - эритроциты образуют на дне лунки перевернутый "зонтик", края его ровные;

* ++ (2+) - эритроциты образуют на дне лунки тонкое кольцо;

* + (1+) - эритроциты образуют на дне лунки плотное кольцо или диск;

* (-) - эритроциты образуют на дне лунки точку.

Положительным результатом считают гемагглютинацию не менее, чем на 3 (+++) креста.

Контролем качества диагностикума служат 4 лунки контрольного ряда, в которые вносили только раствор ФБР и СЭД. В этих лунках не должно быть спонтанной агглютинации (-). В этом случае следует повторить исследование. Если при повторном исследовании появляется агглютинация, то препарат не используют.

Сыворотки с отрицательным результатом следует считать не содержащими антител к Vi-антигену в диагностическом титре 1:40 и ниже.

Сыворотки, дающие положительный результат в разведении 1:40, необходимо исследовать повторно в варианте с раститровкой сыворотки для установления ее титра.

Результаты можно считать достоверными только в том случае, если титр прилагаемой контрольной сыворотки (К+) не ниже, чем ½ титра, указанного на ее этикетке.

Поствновка РПГА при раститровке сывороток крови

Раститровку исследуемых сывороток и рабочего раствора К+ проводят в коротких рядах планшета. Еще один короткий ряд используют для контроля на отсутствие спонтанной агглютинации СЭД.

В первые лунки коротких рядов для раститровки исследуемых сывороток вносят 180 мкл раствора РИП. Во все остальные лунки вносят по 50 мкл раствора ФБР.

В лунки короткого ряда для контроля диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации вносят по 50 мкл раствора ФБР.

В лунки с раствором РИП вносят 20 мкл исследуемых сывороток. Каждую сыворотку вносят индивидуальным наконечником и перемешивают раствор в лунке трехкратным пипетированием (цвет растворов в лунках должен измениться с сине-фиолетового на зеленый).

В первую лунку короткого ряда для раститровки К+ вносят 100 мкл рабочего раствора К+, в остальные лунки вносят по 50 мкл раствора ФБР.

Затем из первых лунок коротких рядов для исследуемых сывороток и контрольной сыворотки переносят по 50 мкл в следующие лунки рядов, получая двукратные разведения от 1:20 до 1:1280. В конце титрования из последних лунок растворы в объеме 50 мкл удаляют.

Во все лунки кроме первых лунок каждого короткого ряда вносят по 25 мкл СЭД. Суспензию СЭД во флаконе или ванночке перед использованием перемешать! После внесения СЭД содержимое лунок перемешивают постукиванием о край планшета. Планшет выдерживают при комнатной температуре в течение 30 - 40 минут.

Учет результатов при раститровке сывороток крови

Титром сыворотки считается ее разведение, дающее гемагглютинацию не менее, чем на 3 (+++) креста.

Контролем качества диагностикума служат лунки короткого ряда для контроля СЭД. В этих лунках не должно быть спонтанной агглютинации (-). В противном случае следует повторить исследование с диагностикумом другой серии.

Лица, у которых обнаружены антитела к Vi-антигену в титре 1:40 и выше, рассматриваются как подозрительные на хроническое носительство возбудителя брюшного тифа. Для окончательной постановки диагноза необходимо углубленное бактериологическое обследование.

Результаты можно считать достоверными только в том случае, если титр прилагаемой контрольной сыворотки (К+) не ниже, чем ½ титра, указанного на ее этикетке.

Условия транспортирования и хранения, срок годности

* Транспортирование в соответствии с СП.3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 °С. Допускается кратковременное (в течение до 10 сут.) транспортирование при температуре от 10 до 35 °С.

* Хранение в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 °С.

Срок годности - 1 год. По истечению срока годности набор реагентов использованию не подлежит.