Определение стафилококков в воздухе

Стафилококки являются одним из наиболее распространенных микроорганизмов в воздухе закрытых помещений, что обусловливается значительной устойчивостью их к различным факторам окружающей среды. Обнаружение патогенных стафилококков в воздухе закрытых помещений имеет санитарно-показательное значение и свидетельствует об эпидемическом неблагополучии. Отбор проб воздуха проводится с помощью аппарата Кротова в количестве 250 л на 2-3 чашки с молочно-желточно-солевым агаром (или молочно-солевым, желточно-солевым) и на чашку с кровяным агаром. Чашки инкубируют при температуре 37 °С в течение 48 часов. Изучают культуральные признаки всех видов колоний, из подозрительных готовят мазки и окрашивают по Граму. Помимо качественной характеристики отдельных колоний, подсчитывают количество выросших колоний стафилококков в 1 м 3 воздуха.

Бактериальные инфекции, вызываемые стафилококками, характеризующиеся преимущественно гноеродными процессами различной локализации, проявляются в виде абсцессов, флегмон, маститов, метритов, пневмоний, сепсиса. Токсигенные штаммы стафилококков могут вызвать пищевые отравления у людей.

Возбудители стафилококкозов в основном штаммы S. aureus, реже S. epidermidis и некоторые другие виды рода Staphylococcus, семейства Micrococcaceae.

Лабораторная диагностика стафилококкозов основана на результатах бактериологического исследования.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Мазки окрашивают по Граму и на капсулу, микроскопируют. Клетки стафилококков грамположительные, сферической формы, диаметром 0,5-1 мкм, располагаются в виде скоплений неправильной формы, а также единично, парами и цепочками из трех-четырех микротел, спор нет, вирулентные штаммы могут образовывать капсулу.

Культуральные свойства. Стафилококки - факультативные анаэробы, температурный оптимум 30-37 °С, pH 7,2-7,4, к питательным средам неприхотливы, могут расти при повышенном содержании хлорида натрия. Исследуемый материал высевают на МПА, в МПБ, посевы культивируют в условиях обычной атмосферы. При загрязнении материала посторонней микрофлорой используют питательные среды с селективными свойствами: солевые МПА, МПБ (8-10 % хлорида натрия), желточно-солевой агар (ЖСА), 3,5 %-ный МПА с добавлением 3 мл 0,1 %-ного раствора кристаллвиолета (на этой среде патогенные стафилококки образуют колонии фиолетового или оранжевого цвета). Широко используют посев исходного материала на кровяной МПА.

На плотных средах через 18-24 часа инкубирования вырастают колонии правильной круглой формы, выпуклые, с гладкой поверхностью, ровными краями, диаметром 2-7 мм, непрозрачные. Цвет колоний зависит от типа вырабатываемого пигмента. Staphylococcus aureus синтезирует золотистый и белый пигмент. На кровяном МПА вирулентные штаммы обычно растут, формируя широкую зону гемолиза. На ЖСА вокруг колоний стафилококков, обладающих леци- тиназной активностью, образуются зоны помутнения с перламутровым оттенком. В МПБ рост стафилококков сопровождается интенсивным помутнением среды и образованием значительного осадка.

Из культур, выросших на питательных средах, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При обнаружении бактерий с типичными для стафилококков культуральноморфологическими признаками приступают к изучению свойств, прямо или косвенно свидетельствующих о патогенности выделенного стафилококка.

Патогенные стафилококки в отличие от непатогенных образуют капсулу (S. aureus), выделяют гемолизин, фибринолизин (стафи- локиназу), гиалуронидазу, плазмокоагулазу, желатиназу, ДНК-азу, лецитиназу, ферментируют маннит. Важнейшим из перечисленных факторов считают плазмокоагулазу: у 90-95 % плазмокоагулирующих стафилококков выражена способность продуцировать энтеротоксин.

Биопроба. Заражают лабораторных животных для подтверждения токсигенных свойств выделенного стафилококка.

Энтеротоксин продуцируют токсигенные штаммы. Пробу на энтеротоксин ставят при отравлениях. Культуру стафилококка выращивают на специальной питательной среде (пептон, хлорид натрия, хлорид магния, дигидрофосфат калия, 0,8 % агар-агара, pH 7,2), в атмосфере, содержащей 20 % оксида углерода (IV), в течение трех суток. Затем культуру стерилизуют фильтрованием, 10-15 мл фильтрата смешивают с равным объемом молока и скармливают 4-8-недельным котятам. При наличии энтеротоксина через 1-2 часа у животных возникают симптомы гастроэнтерита и рвота.

Для идентификации стафилококков применяют их фаготипиро- вание.

3.22. Методы определения Staphylococcus aureus

Средства контроля и вспомогательные устройства. Аппаратура, материа­лы, реактивы по ГОСТ 9225 со следующими дополнениями:

Питательные среды. Гидролизованное и стерильное обезжиренное молоко по ГОСТ 10444.11.

Желточную эмульсию готовят следующим образом. Свежее куриное яйцо моют водопроводной водой, затем протирают ваткой, смоченной в спирте, и обсушивают. Отделяют желток и вносят его в 100 см 3 сте­рильного раствора хлористого натрия по ГОСТ 9225. Тщательно пере­мешивают. Приготовленная эмульсия может храниться при темпера­туре 0–5 °С не более 72 ч.

Солевой бульон (допускается применение солевого бульона, который готовится согласно указанию на этикетке). Состав: натрий хлористый (NaCl) – 7,5 г; питательный сухой бульон – 1,5 г (или гидролизован­ное молоко – 100 см 3 ).

Приготовление: в 100 см 3 дистиллированной воды вносят 1,5 г сухо­го питательного бульона, кипятят 1–2 мин, фильтруют через ватный тампон, добавляют 7,5 г NaCl, устанавливают рН (6,9 ± 0,1).

Разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение(10 ± 1) мин.

Или к 100 см 3 гидролизованного молока добавляют 7,5 г NaCl, уста­навливают рН (6,9 ± 0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.

Желточно-солевой агар [1] . Состав: питательный агар [2] для культи­вирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) – 35 г или питательный агар II 8 (на основе гидролизата кормовых дрожжей) 24 г; натрий хлористый (NaCl) – 75 г; эмульсия желточная – 50,0 см 3 ; вода дистиллированная – 1 дм 3 .

Приготовление: в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 г пита­тельного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г пи­тательного агара сухого II, добавляют 75 г хлористого натрия (NaCl), кипятят до полного расплавления агара, фильтруют через ватный там­пон, разливают во флаконы или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин. После стерилизации охлаждают до температуры (45 ± 1) °С и добавляют 50 см 3 предварительно под­готовленной желточной эмульсии. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.

Молочно-солевой агар [3] . Состав: питательный агар [4] для культиви­рования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) – 35 г; или питательный агар II 10 (на основе гидролизата кормовых дрож­жей) – 24,0 г; натрий хлористый (NaCl) – 75,0 г; молоко обезжирен­ное – 100 см 3 ; вода дистиллированная – 1 дм 3 .

Приготовление: среду готовят, как указано выше, но после охлажде­ния до температуры (45 ± 1) °С добавляют вместо желточной эмульсии 100 см 3 стерильного обезжиренного молока. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.

Агар Байрд-Паркера. Среда готовится согласно указанию на этикет­ке. Состав. Основа среды: триптон – 10,0 г; дрожжевой экстракт – 1,0 г; мясной экстракт – 5,0 г; литий хлористый гексагидрат – 5,0 г; агар – 12,0–20,0 г; вода дистиллированная – 1 дм 3 .

Раствор пирувата натрия: пируват натрия – 20,0 г; вода дистилли­рованная –100 см 3 .

Раствор глицина: глицин – 20,0 г; вода дистиллированная – 100,0 см 3 .

Приготовление основы среды: в 1 дм 3 дистиллированной воды вно­сят 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара.

При отсутствии мясного экстракта, триптона и дрожжевого экстрак­та вместо дистиллированной воды применяют 1 дм 3 мясопептонного бульона или питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой или питательный агар сухой II.

Все компоненты, внесенные в 1 дм 3 дистиллированной воды (мясопептонный бульон), нагревают и перемешивают до полного рас­творения, охлаждают до температуры 50–60 °С. Устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают в колбы или бутылки по 90 см 3 и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин.

При использовании сухой среды в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганиз­мов или 24 г питательного агара сухого II, добавляют 5 г хлористого лития. Нагревают до полного растворения, охлаждают до температуры 50–60 °С, устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают и стерилизуют как указано выше.

Готовую основу среды хранят не более 30 сут при температуре (6 ± 2) °С.

Перед использованием к 90 см 3 расплавленной основы среды добав­ляют асептически стерилизованные фильтрованием через мембран­ный фильтр растворы: 6,3 см 3 раствора глицина, 5 см 3 раствора пирува­та натрия; 1 см 3 раствора теллурита калия; 5 см 3 желточной эмульсии.

Допускается растворы глицина, пирувата натрия, теллурита калия и желточную эмульсию готовить в асептических условиях на стериль­ной дистиллированной воде.

После тщательного перемешивания приготовленную среду разлива­ют в чашки Петри. Чашки со средой можно хранить не более 48 ч.

Порядок подготовки к проведению контроля. Приготовление раство­ров и реактивов . Раствор плазмы кроличьей цитратной готовится со­гласно инструкции по применению плазмы, прилагаемой к упаковке.

Растворы и реактивы для окраски препаратов готовят по ГОСТ 9225.

Приготовление реактивов для окраски по Грaму . Приготовление реак­тива 1: в 100 см 3 этилового спирта растворяют 0,5 г кристаллического фиолетового.

Приготовление реактива 2: к 96 см 3 спиртового раствора йодисто­го калия массовой концентрацией 5 г/дм 3 добавляют 2 см 3 спиртового раствора основного фуксина массовой концентрацией 50 г/дм 3 и 2 см 3 спиртового раствора йода массовой концентрацией 50 г/дм 3 .

Йодистый калий растворяют в спирте на водяной бане при темпера­туре (45 ± 5) °С при постоянном помешивании.

Отбор и подготовка проб по ГОСТ 9225.

Метод определения количества Staphylococcus aureus с предварительным обогащением

Подготовка и проведение контроля. Из навески продукта готовят ряд де­сятикратных разведений по ГОСТ 9225 так, чтобы можно было опре­делить наличие или отсутствие Staphylococcus aureus в определенной массе (объеме), указанной в нормативном документе на конкретный продукт.

Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см 3 в пробирки или колбы с солевым бульоном.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эк­вивалентным разведенной питательной средой 1:10.

Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.

Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне, к Staphylococcus aureus делают пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний или на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркера, желточно-солевой агар или молочно-солевой агар.

Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24-48 часов.

После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.

На желточно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus имеют форму плоских дисков диаметром 2–4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний об­разуется радужное кольцо и зона помутнения среды.

На молочно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus растут в виде непрозрачных круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром 2–4 мм, слегка выпуклых.

На среде Байрд-Паркера колонии Staphylococcus aureus растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром 1–1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1–3 мм.

С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных коло­ний и пересеивают на поверхность скошенного питательного агара, 1 см желточно-солевого агара, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии.

Посевы выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в те­чение 24 часов.

У выросших колоний определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика.

Из пяти изолированных, характерных для Staphylococcus aureus, колоний делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Для приготовления препарата на чистое и охлажденное после фламбирования предметное стекло наносят петлей каплю дистиллирован­ной воды, в которую вносят петлей небольшое количество агаровой культуры, не размешивая в воде. Затем вносят петлей каплю реакти­ва 1, для окраски по Граму.

Смесь распределяют на участке примерно 1 см 2 , просушивают при температуре (20 ± 2) °С, фиксируют, медленно пронося предметное стекло над пламенем горелки. На одном стекле можно готовить по шесть-восемь мазков, отделяя их один от другого линиями, проведен­ными с лицевой стороны стекла.

Препарат ополаскивают водой и тщательно просушивают фильтро­вальной бумагой.

После просушивания на препарат наносят с избытком реактив 2 для окрашивания по Граму так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность стекла. Продолжительность окрашивания 0,5–1 мин. После окрашива­ния препарат быстро ополаскивают проточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально. Препарат просушива­ют фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Микробы, красящиеся по Граму, будут темно-фиолетового цвета, не красящиеся по Граму – красного цвета.

Стафилококки окрашиваются по Граму положительно (темно-фиолетового цвета), имеют шарообразную форму и располагаются скоплениями, чаще всего напоминающими гроздья винограда.

Постановка реакции плазмокоагуляции. В пробирку с 0,5 см 3 разве­денной кроличьей плазмы вносят петлю суточной агаровой культуры. Внесенную культуру тщательно размешивают. Одну пробирку с плаз­мой оставляют незасеянной, в другую засеивают контрольный штамм Staphylococcus aureus (коагулазоположительный стафилококк).

Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температу­ре (37 ± 1) °С в течение 3–6 ч. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то оставляют эти пробирки до 24 ч. Если через 24 ч плазма не свернулась, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.

При определении коагулазной активности реакцию считают отри­цательной в тех случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки, или в тех случаях, когда в плазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на один плюс).

Реакцию считают положительной, если:

+++ – сгусток, имеющий небольшой отсек;

++ – сгусток в виде взвешенного мешочка.

Все три варианта являются положительным результатом.

При получении положительной реакции считают, что в посевах об­наружен Staphylococcus aureus.

Обработка результатов контроля. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

Оформление результатов контроля. Морфологические, культуральные свойства и положительная реакция плазмокоагуляции свидетель­ствуют о присутствии коагулазоположительных стафилококков в за­сеянной массе продукта.

Метод определения количества Staphylococcus aureus без предварительного обогащения

После термостатирования подсчитывают количество характерных колоний на каждой чашке Петри (желточно-солевой агар, молочно-солевой агар и агар Байрд-Паркера, см. предыдущий метод). С каж­дой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных и/или подо­зрительных колоний Staphylococcus aureus, а в случае роста менее пяти – все колонии, характерные для Staphylococcus aureus, и пере­севают на поверхность скошенного питательного агара, разлитого в пробирки (см. желточно-солевой агар), но без добавления хлористо­го натрия и желточной эмульсии. Пробирки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.

У выросших культур определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика как в предыдущем методе.

Обработка результатов контроля. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

Оформление результатов контроля. Количество колоний Staphylococ­cus aureus в 1 г или 1 см 3 после определения его в определенной наве­ске продукта вычисляют по формуле:

где Σn₁, Σn₂ – количество колоний, выросших на всех чашках Петри в пределах одного разведения или засеянного объема; n – число деся­тикратных разведений.

Пример. Подсчитываем количество колоний Staphylococcus aureus, выросших на трех засеянных чашках при посевах продукта или его разведений:

1 г или 1 см 3 продукта:	84	96	72
10 -1 разведение:	9	10	7

10 -1 разведение:	84	96	72
10 -2 разведение:	99	10	7

[1] Допускается использовать солевой агар, который готовится согласно ука­занию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.

[2] При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм 3 дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указа­нию на этикетке.

[3] Допускается использовать солевой агар, который готовится согласно ука­занию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.

[4] При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм 3 дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указа­нию на этикетке.

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха можно разделить на 4 этапа:

1. отбор проб;
2. обработка, транспортировка, хранение проб, получение концентрата микроорганизмов (если необходимо);
3. бактериологический посев, культивирование микроорганизмов;
4. идентификация выделенной культуры.

Отбор проб, как и при исследовании любого объекта, является наиболее ответственным. Правильное взятие проб гарантирует точность исследования. В закрытых помещениях точки отбора проб устанавливаются из расчета на каждые 20 м2 площади - одна проба воздуха, по типу конверта: 4 точки по углам комнаты (на расстоянии 0,5 м от стен) и 5-я точка - в центре. Пробы воздуха забираются на высоте 1,6—1,8 м от пола - на уровне дыхания в жилых помещениях. Пробы необходимо отбирать днем (в период активной деятельности человека), после влажной уборки и проветривания помещения. Атмосферный воздух исследуют в жилой зоне на уровне 0,5—2 м от земли вблизи источников загрязнения, а также в зеленых зонах (парки, сады и т.д.) для оценки их влияния на микрофлору воздуха. Для отбора воздуха на уровне 0,5-2м от земли используют специальные штативы.

Следует обратить внимание на то, что при отборе проб воздуха во многих случаях происходит посев его на питательную среду.

Седиментационный - наиболее старый метод, широко распространен благодаря простоте и доступности, однако является неточным. Метод предложен Р. Кохом и заключается в способности микроорганизмов под действием силы тяжести и под влиянием движения воздуха (вместе с частицами пыли и капельками аэрозоля) оседать на поверхность питательной среды в открытые чашки Петри. Чашки устанавливаются в точках отбора на горизонтальной поверхности. При определении общей микробной обсемененности чашки с мясопептонным агаром оставляют открытыми на 5—10 мин или дольше в зависимости от степени предполагаемого бактериального загрязнения. Для выявления санитарно-показательных микробов применяют среду Гарро или Туржецкого (для обнаружения стрептококков), молочно-солевой или желточно-солевой агар (для определения стафилококков), суслоагар или среду Сабуро (для выявления дрожжей и грибов). При определении санитарно- показательных микроорганизмов чашки оставляют открытыми в течение 40—60 мин.

По окончании экспозиции все чашки закрывают, помещают в анаэростат или термостат для культивирования в оптимальной для развития выделяемого микроорганизма среде, затем (если этого требуют исследования) на 48 ч оставляют при комнатной температуре для образования пигмента пигментообразующими микроорганизмами.

Седиментационный метод имеет ряд недостатков: на поверхность среды оседают только грубодисперсные фракции аэрозоля; нередко колонии образуются не из единичной клетки, а из скопления микробов; на применяемых питательных средах вырастает только часть воздушной микрофлоры. К тому же этот метод совершенно непригоден при исследовании бактериальной загрязненности атмосферного воздуха.

Более совершенными методами являются аспирационные, основанные на принудительном осаждении микроорганизмов из воздуха на поверхность плотной питательной среды или в улавливающую жидкость (мясо-пептонный бульон, буферный раствор, изотонический раствор хлорида натрия и др.). В практике санитарной службы при аспирационном взятии проб используются аппарат Кротова, пробоотборное устройство ПУ-1Б, бактериоуловитель Речменского, прибор для отбора проб воздуха (ПОВ-1), пробоотборник аэрозольный бактериологический (ПАБ-1), бактериально-вирусный электропреципитатор (БВЭП-1), прибор Киктенко, приборы Андерсена, Дьяконова, МБ и др. Для исследования атмосферы могут быть использованы и мембранные фильтры № 4, через которые воздух просасывается с помощью аппарата Зейтца. Большое разнообразие приборов свидетельствует об отсутствии универсального аппарата и о большей или меньшей степени их несовершенства.

Пробоотборное устройство ПУ-1Б. В настоящее время этот прибор широко применяется при исследовании воздуха закрытых помещений и имеется в лабораториях СЭС.

Принцип работы ПУ-1Б основан на том, что воздух, просасываемый через отверстия в крышке аппарата, ударяется о поверхность питательной среды, при этом частицы пыли и аэрозоля прилипают к среде, а вместе с ними и микроорганизмы, находящиеся в воздухе. Чашку Петри с тонким слоем среды укрепляют на вращающемся столике аппарата, что обеспечивает равномерное распределение бактерий на ее поверхности. Работает аппарат от электросети. После отбора пробы с определенной экспозицией чашку вынимают, закрывают крышкой и помещают на 48 ч в термостат. Обычно отбор проб проводят со скоростью 200 л/мин в течение 0,5-5 мин. Таким образом, определяется флора в 100-1000 л воздуха.

Приемник перед забором пробы воздуха заполняется 3—5 мл улавливающей жидкости (водой, мясопептонным бульоном, изотоническим раствором хлорида натрия).

Пробоотборник аэрозольный бактериологический (ПАБ-1) (в настоящее время снят с производства). Механизм действия ПАБ-1 основан на принципе электростатического осаждения частиц аэрозоля (а следовательно, и микроорганизмов) из воздуха при прохождении его через прибор, в котором эти частицы получают электрический заряд и осаждаются на электродах с противоположным знаком. На электродах для улавливания аэрозолей помещают в горизонтальном положении металлические поддоны с твердыми средами в чашках Петри или жидкой питательной средой (15—20 мл). Прибор переносной с большой производительностью 150-250 л/мин, т.е. за 1 ч можно отобрать 5—6 м3 воздуха. Его рекомендуют применять для исследования больших объемов воздуха при обнаружении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, например, при выявлении в воздухе палат больниц возбудителей внутрибольничных инфекций (Pseudomonas aeruginosa. Staph, aureus и др.), определении сальмонелл и эшерихий в атмосферном воздухе в местах дождевания при орошении земледельческих полей сточными водами.

При использовании любого из перечисленных приборов получаемые результаты являются приблизительными, однако они дают более правильную оценку обсемененности воздуха в сравнении с седиментационным методом. Поскольку и отбор и санитарно-микробиологические исследования воздуха не регламентированы ГОСТ, то можно использовать любой прибор для оценки бактериальной загрязненности воздуха. Во многих случаях отбор проб совмещен с этапом посева.

Для снижения численности микроорганизмов в воздухе закрытых помещений применяют следующие средства:

1. химические - обработка озоном, двуокисью азота, распыление молочной кислоты,
   
2. механические - пропускание воздуха через специальные фильтры,
3. физические - ультрафиолетовое облучение.

Определение общей численности сапрофитных бактерий

Общая бактериальная обсемененность воздуха или микробное число - это суммарное количество микроорганизмов, содержащихся в 1 м3 воздуха. Для определения общего количества бактерий в воздухе закрытых помещений забирают две пробы (объемом по 100 л каждая) на чашки Петри с МПА при помощи Пу-1Б, либо седиментационным методом, расставляя чашки с питательной средой по принципу конверта. Чашки с посевом помещают в термостат на сутки, а затем на 48 ч оставляют при комнатной температуре. Экспозиция чашек с посевами на свету дает возможность подсчитать раздельно количество пигментных колоний (желтых, белых, розовых, черных, оранжевых и др.), количество спорообразующих бацилл, грибов и актиномицетов.

Подсчитывают количество колоний на обеих чашках, вычисляют среднее арифметическое и делают перерасчет на количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха. Бациллы образуют колонии, как правило, крупные, круглые, с неровными краями, сухие, морщинистые. Колонии грибов с пушистым налетом (Мисог и Aspergillus) и плотные - зеленоватые или сероватые (Penicillium). Актиномицеты образуют беловатые колонии, вросшие в агар. Количество каждой группы колоний (пигментных, беспигментных, плесеней, бацилл, актиномицетов) выражают в процентах по отношению к общему числу.

При определении микробного числа методом седиментации по Коху подсчитываются колонии, выросшие на МПА в чашках Петри, и расчет ведется по B.Л. Омелянскому. Если придерживаться этой методики, на чашку площадью 100 см2 за 5 мин оседает такое количество микробов, которое содержится в 10 л воздуха.

Стафилококки являются одним из наиболее распространенных микроорганизмов в воздухе закрытых помещений, что обусловливается значительной устойчивостью их к различным факторам окружающей среды. Обнаружение патогенных стафилококков в воздухе закрытых помещений имеет санитарно-показательное значение и свидетельствует об эпидемическом неблагополучии. Отбор проб воздуха проводится в количестве 250 л на 2—3 чашки с молочно-желточно-солевым агаром (или молочно- солевым, желточно-солевым) и на чашку с кровяным агаром. Чашки инкубируют при температуре 37°С в течение 48 ч. Изучают культуральные признаки всех видов колоний, из подозрительных готовят мазки и окрашивают по Граму.

Помимо качественной характеристики отдельных колоний, подсчитывают количество выросших колоний стафилококков в 1 м3 воздуха.

Стрептококки также являются санитарно-показательными микроорганизмами воздуха, в который они попадают от больных скарлатиной, тонзиллитами, ангиной и носителей стрептококков. Отбор проб воздуха при исследовании на наличие а- и р-гемолитических стрептококков производят на чашки с кровяным агаром, средами Гарро и Туржецкого. Забирают 200—250 л воздуха, чашки с посевами выдерживают в термостате 18—24 ч и затем еще 48 ч при комнатной температуре (после предварительного просмотра и учета). Идентификацию проводят по общепринятой методике.

Определение патогенных микроорганизмов в воздухе

Ввиду малой концентрации патогенных микроорганизмов в воздухе закрытых помещений, их выделение является достаточно трудной задачей.

При расшифровке внутрибольничных инфекций определяют в воздухе присутствие стафилококков, стрептококков, синегнойной палочки, сальмонелл, протеев и др. Отбор проб воздуха производят в объеме не менее 1000 л. Посев производят на соответствующие элективные среды. Если используется жидкая среда как улавливающая жидкость, то пробирку с жидкостью помещают в термостат на сутки для подращивания (получение накопительной культуры), а затем высевают на элективную среду.

При исследовании воздуха на наличие микобактерий туберкулеза отбор проб производят в объеме 250—500 л воздуха. В качестве улавливающей жидкости берут среду Школьниковой, которую затем обрабатывают 3% раствором серной кислоты (для подавления сопутствующей микрофлоры) и центрифугируют. Осадок засевают в пробирки на одну из яичных сред, чаще среду Левенштейна - Иенсена. Инкубируют при 37°С до 3 мес. Отсутствие роста в течение 3 мес дает возможность выдать отрицательный ответ. Пробирки первый раз просматривают через 3 нед, затем каждые 10 дней. Выделенную культуру идентифицируют, определяют ее вирулентность (заражением морских свинок - биопроба) и при необходимости определяют устойчивость к лекарственным препаратам.

При определении в воздухе коринебактерий дифтерии для посева воздуха используют чашки со средой Клауберга.

В последние годы определяют в атмосферном воздухе в районах дождевания земледельческих полей, при орошении их сточными водами, сальмонеллы в случае появления заболевания среди персонала станций орошения или населения. Отбор проб производят с помощью аспиратора ПУ-1Б на чашки с висмут-сульфитным агаром. Исследуют не менее 200 л воздуха. Выделенная культура идентифицируется по обычной схеме определения сальмонелл.

В связи с развитием микробиологической промышленности возникла необходимость исследования воздуха с целью обнаружения грибов-продуцентов при производстве антибиотиков, ферментных препаратов, при изготовлении кормовых дрожжей и др. Для исследования воздуха на плесневые грибы рода Candida отбор проб производят в объеме от 100 до 1000 л на чашки со средой Чапека, суслоагаром (для обнаружения плесневых грибов) и с метабисульфит-натрий- агаром (МБС-агар) с добавлением антибиотиков (для обнаружения дрожжеподобных грибов рода Candida). Чашки инкубируют в термостате при температуре 26—27°С в течение 3—4 сут (для плесневых грибов) и при 35—37°С в течение 2—3 сут (для грибов - продуцентов и дрожжеподобных рода Candida). Идентификация проводится с учетом особенностей плодоносящих гиф и характера мицелия. Считают, что концентрация дрожжеподобных грибов в количестве 500—600 клеток в 1 м3 воздуха рабочего помещения является предельной, превышение ее ведет к развитию аллергических реакций у рабочих.