Основа агара для выделения стафилококков и бацилл
а) Желточно-солевой агар. Среда предназначена для выделения стафилококков и выявления пигмента.
Для приготовления используют мясопептонный агар (pH 7,3±0,1) с добавлением 10% натрия хлорида. После розлива во флаконы по 100,0-200,0 мл агар стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при температуре 121°С.
Перед употреблением среду расплавляют, охлаждают до 45-50°С и добавляют 20% (по объему) стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150,0-200,0 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида). Среду быстро перемешивают, разливают в чашки, которые продолжительное время могут оставаться в холодильнике в полиэтиленовых пакетах. Готовая среда полупрозрачна, имеет беловатый цвет с легким кремовым оттенком.
Учет результатов производят через 36-48 ч инкубации в термостате при 35-37°С. На этой среде хорошо выявляются пигментные свойства микроорганизма, обусловленные липохромным пигментом. Вокруг колоний можно видеть радужный венчик за счет образования лецитовителлазы. Добавление к среде 10% стерильного снятого молока усиливает пигментообразование.
б) Желточная среда по Г.Н.Чистовичу. Среда предназначена для определения лецитиназной активности стафилококков.
К мясопептонному питательному агару, приготовленному по общепринятой прописи, добавляют 20% желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150,0-200,0 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида).
При определении лецитиназной активности по методу Чистовича исследуемую культуру стафилококка засевают на среду отдельными штрихами или бляшками. Посевы помещают в термостат при 36-37°С. Вокруг колоний стафилококка, продуцирующих лецигиназу, образуются четко выраженные зоны помутнения с радужным венчиком по периферии.
в) Среда Casman E.R. в модификации Ф.С.Флуера для получения стафилококкового энтеротоксина.
Состав:
Ферментативный гидролизат казеина
Цитрат железа — 0,25 г
KH2PO4 - 1,0 г
К2HPO4*3H2O - 1,0 г
MgSO4*7H2O - 0,2 г
L-цистин — 0,025 г
L-триптофан — 0,075 г
Ацетат натрия — 7,0 г
Кальция пантетонат — 0,0005 г
Тиамин гидрохлорид — 0,00004 г
Никотиновая кислота — 0,0012 г
Дистиллированная вода — до 1000,0 мл
Навески ингредиентов (кроме четырех — см. ниже) вносят в колбу с ферментативным гидролизатом казеина; объем ферментативного гидролизата вносится из расчета конечного содержания аминного азота в среде — 2,0 г/л. Затем вносят L-триптофан, предварительно растворенный в 3 мл 1N раствора НО. Общий объем воды доводят до 1 л дистиллированной водой, тщательно перемешивают. Подогревают (при частом перемешивании) и кипятят 1 мин для полного растворения. Устанавливают pH среды 7,3. Стерилизуют автоклавированием при 121°С в течение 15 мин.
Кальций пантетонат, тиамин гидрохлорид и никотиновую кислоту стерилизуют отдельно через миллипоровские фильтры и добавляют асептически в среду перед посевом.
Подготовка раствора кальция пантегоната: берут навеску 500,0 мкг, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл стерильного пангентоната кальция асептически перед посевом добавляют к 1,0 л питательной среды перед посевом.
Подготовка раствора тиамина гидрохлорида: берут навеску 40,0 мкг, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл стерильного раствора тиамин гидрохлорида асептически добавляют к 1,0 л питательной среды перед посевом.
Подготовка раствора никотиновой кислоты: берут навеску 12,0 мкг никотиновой кислоты, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл стерильной никотиновой кислоты асептически добавляют к 1,0 л питательной среды перед посевом.
г) Бульон для энтеротоксигенных стафилококков HiMedia, Casein Hydrolysate Broth. Бульон используют для культивирования стафилококков с целью получения энтеротоксина, используемого в пробе на котятах и в серологических исследованиях.
Состав, г/л:
Гидролизат казеина кислотный — 20,0
Железа цитрат — 0,025
Калия дигидроортофосфат — 2,0
Магния сульфат — 0,20
L-цистин — 0,025
Натрия ацетат — 7,0
L-триптофан — 0,075
Кальция пантотенат — 0,0005
Тиамин — 0,00004
Никотиновая кислота — 0,0012
pH 7,3±0,2
Навеску среды 29,33 г вносят в 1000,0 мл дистиллированной воды. Тщательно размешивают. Подогревают (при частом помешивании) и кипятят 1 мин для полного растворения. Устанавливают pH. Разливают в соответствующие емкости. Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин.
Испытуемые на энтеротоксигенность стафилококки засевают на этот бульон, выращивают в течение 18-24 ч при 35°С в атмосфере, содержащей 30% углекислоты. Полученную культуру из каждой пробирки в количестве 3,0 мл засевают в два флакона со 100,0 мл той же среды и инкубируют в тех же условиях 3 дня. Бульонные культуры затем центрифугируют и надосадочную жидкость пропускают через мембранный фильтр для стерилизации.
Полученные фильтраты тестируют на присутствие α- и β-гемолизинов. В случае положительного результата токсин денатурируют прогреванием или нейтрализуют иммунной сывороткой. После денатурации фильтраты можно вводить котятам и наблюдать за появлением рвоты.
Этот бульон можно использовать для приготовления плотной среды, если добавить в его состав агар. Культуры, выращенные на таком агаре, можно применять и для заражения других животных, и для исследования в системе антиген-антитело методом диффузии.
Готовая среда янтарной окраски, прозрачна или опалесцирует.
д) Бульон для получения и очистки токсина синдрома токсического шока (ТСТШ).
Состав:
Бактопентон Difco — 6,0 г
Никотиновая кислота — 1,0 мг
Солянокислый тиамин — 5,0 мг
Бактопептон Difco растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды, устанавливают pH6,5 и проводят стерилизацию в течение 15 мин при 121°С. Никотиновую кислоту и солянокислый тиамин добавляют асептически в среду перед посевом. Предварительно берут 10,0 мг никотиновой кислоты, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл добавляют к 100,0 мл среды перед посевом.
Раствор солянокислого тиамина готовят следующим образом: берут 50,0 мг солянокислого тиамина, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, затем стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и асептически добавляют 1,0 мл к 100,0 мл основной среды.
е) Солевой бульон для обогащения материала, исследуемого на энтеротоксигенные стафилококки. К 100,0 мл мясопептонного бульона (МПБ) с pH 7,3 добавляют 6,5 г хлористого натрия и разливают в пробирки по 10,0 мл, стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 20 мин.
ж) Среда Фогель-Джонсона, плотная среда для выделения энтеротоксигенных стафилококков.
Состав:
Триптиказа — 1,0 г
Дрожжевой экстракт — 0,5 г
Глицин — 1,0 г
Маннит — 1,0 г
Хлористый литий — 0,5 г
Двузамещенный фосфат катия K2HPO4*3H2O — 0,5 г
Теллурит калия (1% раствор) — 2,0 мл
Феноловый красный — 0,0025 г
Агар — 1,6 г
Дистиллированная вода — 100,0 мл
Навески триптиказы, дрожжевого экстракта, глицина, маннита, хлористого лития, двузамещенного фосфата калия, фенолового красного и агара растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды.
Устанавливают pH 7,2 и стерилизуют в автоклаве при 121°С 20 мин. Теллурит калия добавляют асептически в остуженную среду до 45°С перед посевом. Среду разливают в чашки Петри.
з) Теллурит-полимиксин-желточный агар (г/100 мл) для выделения энтеротоксигенных стафилококков.
Состав:
Триптон — 1,1 г
Дрожжевой экстракт — 0,55 г
Маннит — 0,55 г
Хлорид натрия NaCl — 2,2 г
Теллурит калия (1%-ный раствор) — 1,0 мл
Желток яйца (в 50 мл физиологического раствора) — 10,0 мл
Полимиксинсульфат (1%-ный раствор) — 0,04 мл
Агар — 2,0 г
Навески триптона, дрожжевого экстракта, маннита, хлористого натрия и агар добавляют в колбу с 100,0 мл дистиллированной воды, доводят до кипения.
Устанавливают pH среды 7,2 и стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 15 мин. В остуженную до 45°С среду асептически вносят раствор теллурита калия, взвесь желтка куриного яйца и полимиксин, после чего среду разливают в чашки Петри по 25,0 мл. Выросшие колонии стафилококка имеют черный цвет.
з) Среда Baird-Parker (г/100,0 мл) для выделения энтеротоксигенных стафилококков.
Состав:
Триптон — 1,0 г
Мясной экстракт — 0,5 г
Дрожжевой экстракт — 0,1 г
Глицин — 1,2 г
Пируват натрия — 1,0 г
Хлористый литий — 0,5 г
Теллурит калия (2,0%-ный раствор) — 0,5 мл
Желток яйца — 5,0 мл
Агар — 2,0
Вода дистиллированная — 100,0 мл
Все навески (кроме раствора теллурита и желтка) размешивают в 100,0 мл дистиллированной воды. Смесь нагревают при перемешивании и кипятят в течение 1 мин до полного расплавления ингредиентов. Устанавливают pH 7,1 и стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. Основа среды может храниться в холодильнике в течение 1 мес. Перед употреблением в расплавленную и охлажденную до 45°С основу, соблюдая правила асептики, прибавляют из расчета на 100,0 мл среды 0,5 мл 2%-ного раствора теллурита калия и 0,5 мл эмульсии яичного желтка.
Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри в объеме не менее 20,0 мл на чашку. Чашки со средой могут быть использованы в течение 24-28 ч. Перед посевом чашки со средой подсушивают в термостате общепринятым способом.
Выросшие колонии S. aureus имеют черный цвет (за счет восстановления теллура) с зонами просветления и опалесценции (за счет лецитиназы).
и) Основа дифференцирующего агара (с плазмой) для стафилококков HiMedia, Coagulase Mannitol Agar Base. Среду с добавкой плазмы используют для выделения и дифференциации Staphylococcus spp. из патологического материала и для идентификации чистых культур S.aureus по способности коагулировать плазму и ферментировать маннит.
Состав, г/л:
Настой мозга и сердца — 5,0
Гидролизат казеина ферментативный — 10,5
Перевар соевой муки папаиновый — 3,5
Натрия хлорид — 3,5
Маннит — 10,0
Бромкрезоловый пурпурный — 0,02
Агар — 14,5
pH 7,4±0,2
Размешивают 47,0 г среды в 1000,0 мл дистиллированной воды. Кипятят до полного растворения частиц. Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. Охлаждают до 45-50°С и асептически добавляют до 7-15% (об.) стерильную предварительно проверенную плазму. Тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри.
В случае ферментации маннита среда вокруг колонии закисляется, и индикатор бромкрезоловый пурпурный окрашивается в желтый цвет. Если микроорганизмы коагулируют плазму, вокруг их колоний образуется непрозрачная зона. Коагулазоотрицательными видами стафилококка маннит может ферментироваться с образованием желтой зоны, но она не будет мутной.
Готовая среда имеет лиловую окраску, слегка опалесцирует.
к) Среда для выявления термостабильной дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) у энтеротоксигенных стафилококков. ДНКаза определяется по методу, основанному на метахроматических свойствах толуидина голубого.
К 1000,0 мл 0,05 М трис-буфера (оксиметиламинометан), pH 9,0, добавляют 0,3 г ДНК, затем 10,0 г агара Difco, 1 мл 0,01 М раствора CaCl2, 10,0 г хлористого натрия, 3,0 мл 0,1 М раствора толуидина голубого. Среду разливают в пробирки по 12-15 мл, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике до 3-5 мес.
Перед постановкой реакции среду растапливают и разливают в чашки Петри, подсушивают при 37°С в течение 1 ч, стерильно вырезают лунки диаметром 3 мм, отсасывают пипеткой агар и вносят в лунки пастеровской пипеткой взвеси испытуемых культур.
Для этого пробирки с суточным ростом испытуемых культур стафилококков на полужидком питательном агаре прогревают в кипящей водяной бане 15 мин и вносят в лунки в агаровой пластинке, содержащей ДНК и толлуидин голубой инкубируют при 37°С. В результате гидролиза ДНК, находящейся в среде, термостабильной ДНКазой стафилококков, образуются зоны просветления с розовым окрашиванием. Появление через 1-2 ч зон, окрашенных в розовый цвет, расценивается как положительная реакция на наличие термостабильной ДНКазы.
л) Молочно-солевой агар С.Л. Петрович (для определения каротиноидного пигмента стафилококков). К расплавленному мясопептонному агару с pH 7,2±0,2, содержащему 5-7,5% натрия хлорида, добавляют ex tempore 10% стерильного теплого молока, хорошо обезжиренного, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри.
Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 25.2.2020
Для выделения культур стафилококков обычно используют 5%-ный кровяной агар (кровь овцы, кролика, крупного рогатого скота). При исследовании образцов, содержащих постороннюю микрофлору, целесообразно использовать селективные среды.
Таблица 9. Дифференциальные признаки стафилококков, имеющих основное медицинское значение
| Признак | S. aureus | S. epidermidis | S. saprophyticus | |
| Anaerobius | Aureus | |||
| Наличие каротиноидного сегмента | – | ± | – | + |
| Способность к росту в анаэробных условиях (тиогликолевая среда) | + | + | + | ± |
| Рост на средах с 10% NaCI | + | + | ± (слабо) | + |
| Рост при: | ||||
| 15°С | ? | + | – (слабо) | + |
| 45°С | – | + | + | ± |
| Образование кислоты при ферментации углеводов в аэробных условиях: | ||||
| ксилоза | – | – | – | – |
| арабиноза | – | – | – | – |
| раффиноза | – | – | – | – |
| сахароза | + | + | + | + |
| маннит | – | + | – | ± |
| манноза | – | + | ± | – |
| трегалоза | – | + | – | + |
| лактоза | – | + | ± | ± |
| галактоза | – | + | ± | – |
| фруктоза | + | + | + | + |
| ксилит | – | – | – | ± |
| Восстановление нитратов | – | + | + (слабо) | – |
| Щелочная фосфатаза | + | + | + | – |
| Гиалуронидаза | + | + | + | ? |
| Уреаза | ? | ± | + | + |
| Коагулаза (на сыворотке кролика) | + | + | – | – |
| Фибринолизин | ? | ± | ± | ? |
| Гемолитическая активность | + | + | – (слабо) | – |
| ДНКаза | + | + | – (слабо) | – |
| Чувствительность к новобиоцину (МИК >1,6 мкг/мл) | + | + | + | – |
С целью дифференциации патогенных стафилококков от сапрофитных, а также от микрококков, используют среды, позволяющие одновременно определить один из признаков, характеризующих патогенные стафилококки. Приводим рецепты некоторых питательных сред.
Молочно-солевой агар
В 100 мл МПБ растворяют 6,5 г хлорида натрия, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,4, стерилизуют при 121°С 20 минут. Перед использованием агар расплавляют, охлаждают до 45°С, добавляют 10% стерильного обезжиренного молока и разливают по чашкам Петри. На этой среде определяют пигментообразование и способность к росту при наличии 6,5% хлорида натрия.
Лактозо-солевой бульон с фенолротом
В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара. Устанавливают рН 6,8, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121°С 15 минут. При росте коагулазоположигельных стафилококков среда желтеет (тест на коагулазу положительный).
Теллурит-полимиксин-желточный агар Крисли
В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г маннита, 20 г хлорида натрия, 2 г хлористого лития, 18 г агара. Устанавливают рН 7,3, стерилизуют 15 минут при 121°С. Перед использованием в среду добавляют 100 мл 30%-ной желточной эмульсии (на физиологическом растворе), 0,4 мл стерилизованного фильтрацией 1%-ного водного раствора полимиксина М, 10 мл стерилизованного автоклавированием (121°С 15 мин) 1%-ного водного раствора теллурита натрия.
Среда Джиолиотта и Кантони
В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г маннита, 5 г хлористого натрия, 1,2 г глицина, 3 г пирувата натрия. Устанавливают рН 6,9, стерилизуют при 115°С 20 мин. Перед употреблением к среде добавляют 0,1 мл 1%-ного водного раствора теллурита натрия, стерилизованного фильтрацией, При росте коагулазоположительных стафилококков наблюдается почернение среды или черный осадок.
Среда Бэрда-Паркера
К 90 мл основной среды с температурой 45°С добавляют 6,3 мл глицинового раствора, 1 мл раствора теллурита натрия, 5 мл эмульсии желтка, перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда пригодна к использованию в течение 28 дней (хранение при 4°С). Перед посевом на поверхность среды наносят 0,5 мл 20%-ного водного раствора пирувата натрия, стерилизованного фильтрацией; распределяют по поверхности, подсушивают. Колонии коагулазоположительных стафилококков черные, блестящие, с узкой серо-белой полосой и окружены прозрачной зоной.
Желточная эмульсия. Свежее куриное яйцо выдерживают в 0,001%-ном растворе HgCl2. Соблюдая требования асептики, отделяют желток и эмульгируют его в 200 мл физиологического раствора.
Глициновый раствор. Глицин — 20 г, дистиллированная вода — 100 мл. Стерилизуют при 120°С 15 минут.
Раствор теллурита натрия. Теллурит натрия — 1 г, дистиллированная вода — 100 мл. Стерилизуют фильтрацией.
Желточно-солевой агар Чистовича
В расплавленный МПА с 10% хлорида натрия (рН 7,2), охлажденный до температуры 60°С, добавляют желточную эмульсию. После тщательного перемешивания питательную среду разливают в чашки Петри.
Среда Чаплина-Бернса
К 100 мл МПА добавляют 3,3 мл 0,1%-ного водного раствора кристаллического фиолетового и 5 г лактозы. Устанавливают рН 6,8. Стерилизуют автоклавированием (110°С 30 минут). Колонии патогенных стафилококков растут быстрее, чем непатогенных, и приобретают фиолетовый или оранжевый цвет.
Среда Чемпена (для выделения патогенных стафилококков)
Вариант 1: пептон — 1%, D-маннит — 1%, натрия хлорид — 7,5%, дрожжевой экстракт — 0,25%, двузамещенный фосфорнокислый калий — 0,5%, агар-агар — 1,5%. Среду стерилизуют 90 минут при 110°С, устанавливают рН 7,0 и добавляют 10% стерильного обезжиренного молока (молоко способствует лучшему образованию пигмента).
Вариант 2: пептон — 1%, дрожжевой экстракт — 0, 25%, желатин — 3%, лактоза — 0,2%, D-маннит — 1%, натрия хлорид — 7,5%, двузамещенный фосфорнокислый калий — 0,5%, агар-агар — 1,5%. Стерилизуют 90 минут при 110°С, устанавливают рН 7,0.
| Поделиться |
Закон закупки 44-ФЗЗакон, регулирующий правовые отношения в области государственных закупок.
ЗаказчикИНН: 7422027892 / КПП: 742201001
Информационная лентаПри прокрутке вниз Вы можете получить очень полезную информацию, подобранную специально для Вас нашей программой. А также самые интересные и актуальные статьи о тендерах и закупках, которые мы подобрали для Вас на просторах интернета.
|
Портал отображает информацию о закупках, публикуемых в сети интернет
и находящихся в открытом доступе, и предназначен для юрлиц и индивидуальных предпринимателей,
являющихся участниками размещения государственного и коммерческого заказа. Сайт использует Cookie, которые нужны для авторизации пользователя.
На сайте стоят счетчики Яндекс.Метрика, Google Analytics и LiveInternet,
которые нужны для статистики посещения ресурса.
Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) является главной патогенной бактерией в клинической области и в пищевой промышленности. Внутрибольничные инфекции, вызванные S. aureus, создают увеличивающееся число проблем. Поэтому становится более важной задлачей обнаружение S. aureus, и в частности метициллин-резистентного S. aureus (MRSA). Обычные среды для обнаружения S. aureus являются маннито-солевым агаром (названный Агаром Чапмана в Европе). У этой среды, основанный на повышенной солености и брожении маннита, есть чрезмерное количество ложно-положительных и ложно-отрицательных результатов. CHROMagar Staphylococcus aureus является отборной хромогенной средой c высокой спецификой и высокой чувствительностью. Другой обычной средой для обнаружения S. aureus является Кровяной агар, который требует утомительной и дорогостоящей экспертизы с иммунологическими тестами 5-10 колоний на подозреваемом образце. С другой стороны, CHROMagar Staphylococcus aureus более удобен и более эффективен, чем обычные методы благодаря устранению ложно-положительных результатов. Используя CHROMagar Staphylococcus aureus, будет достаточно проверить единственную колонию с типичным цветом для дальнейшей идентификации и обнаружения S. aureus с высокой вероятностью.
Артикул (Кат. №) TA670: банка, кол-во порошка для приготовления 1000 мл,
Артикул (Кат. №) TA672: банка, кол-во порошка для приготовления 5000 мл.
Возможны другие варианты фасовок, пожалуйста, уточняйте.
Хранение
Порошок хранить при температуре 15/30°C. Использовать до даты срока годности, указанной на этикетке.
Состав (г/л)
Агар 15,0; Пептон и дрожжевой экстракт 40,0; Соли 25,0; Хромогенная смесь 2,5; pH: 6,9 +/- 0,2
(Классический состав, скорректированный для соответствия с рабочими характеристиками).
Инокуляция
Если чашка агара была остужена, необходимо довести ее до комнатной температуры перед инокуляцией.
Нанести образец на чашку и инкубировать при температуре 37°C 24 часа.
Интерпретация
МИКРООРГАНИЗМЫ — Внешние признаки колоний
S. aureus – от розового до розовато-лилового
Другие бактерии – нет роста, бесцветные, голубые
ТОЛЬКО ДЛЯ ИН-ВИТРО ДИАГНОСТИКИ.
Для использования обученным персоналом.
Приготовление
Для приготовления определенного количества среды, добавить сухой порошок в очищенную воду в соответствующем количестве ИЛИ, развести среду в пропорции 82,5 грамм на литр очищенной воды. Размешать порошок вращательными движениями для разбухания агара. Нагреть и довести до кипения (100°C), при регулярном перемешивании круговыми движениями. Если используется автоклав, делать без давления. НЕ НАГРЕВАТЬ ВЫШЕ 100°С. Смесь также можно довести до кипения в микроволновой печи: после закипания вынуть из печи, аккуратно перемешать, затем поместить обратно в печь, дать быстро вскипеть несколько раз, до получения полностью однородной смеси (зерна агара должны исчезнуть). Кипения должно проходить без вспенивания, крупными пузырями. Примечание: в некоторых случаях использование автоклава может быть лишним, и кипения при 100°С может быть достаточно для стерилизации. Охладить на водяной бане до 45-50°C, аккуратно помешивая. Аккуратно перемешать до образования однородной массы. Разлить в стерильные чашки Петри или пробирки дать застыть (до консистенции геля) и высохнуть. Хранить в темном месте. Готовые чашки со средой можно хранить при комнатной температуре одни сутки. При температуре 2/8°C – до одного месяца, в темноте, не допуская высыхания.
Рабочие характеристики и ограничения
Чувствительность и специфичность S.aureus составляет 95,5 %, a специфичность 99,4% (Gaillot et al., 2000).
Для подтверждения требуется дополнительное тестирование.
Примечание: для прямого выявления MRSA можно использовать селективную среду CHROMagar™ MRSA.
Утилизация отходов
После интерпретации чашки автоклавировать при 121°C в течение минимум 20 минут.
3.22. Методы определения Staphylococcus aureus
Средства контроля и вспомогательные устройства. Аппаратура, материалы, реактивы по ГОСТ 9225 со следующими дополнениями:
Питательные среды. Гидролизованное и стерильное обезжиренное молоко по ГОСТ 10444.11.
Желточную эмульсию готовят следующим образом. Свежее куриное яйцо моют водопроводной водой, затем протирают ваткой, смоченной в спирте, и обсушивают. Отделяют желток и вносят его в 100 см 3 стерильного раствора хлористого натрия по ГОСТ 9225. Тщательно перемешивают. Приготовленная эмульсия может храниться при температуре 0–5 °С не более 72 ч.
Солевой бульон (допускается применение солевого бульона, который готовится согласно указанию на этикетке). Состав: натрий хлористый (NaCl) – 7,5 г; питательный сухой бульон – 1,5 г (или гидролизованное молоко – 100 см 3 ).
Приготовление: в 100 см 3 дистиллированной воды вносят 1,5 г сухого питательного бульона, кипятят 1–2 мин, фильтруют через ватный тампон, добавляют 7,5 г NaCl, устанавливают рН (6,9 ± 0,1).
Разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение(10 ± 1) мин.
Или к 100 см 3 гидролизованного молока добавляют 7,5 г NaCl, устанавливают рН (6,9 ± 0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.
Желточно-солевой агар [1] . Состав: питательный агар [2] для культивирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) – 35 г или питательный агар II 8 (на основе гидролизата кормовых дрожжей) 24 г; натрий хлористый (NaCl) – 75 г; эмульсия желточная – 50,0 см 3 ; вода дистиллированная – 1 дм 3 .
Приготовление: в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II, добавляют 75 г хлористого натрия (NaCl), кипятят до полного расплавления агара, фильтруют через ватный тампон, разливают во флаконы или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин. После стерилизации охлаждают до температуры (45 ± 1) °С и добавляют 50 см 3 предварительно подготовленной желточной эмульсии. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.
Молочно-солевой агар [3] . Состав: питательный агар [4] для культивирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) – 35 г; или питательный агар II 10 (на основе гидролизата кормовых дрожжей) – 24,0 г; натрий хлористый (NaCl) – 75,0 г; молоко обезжиренное – 100 см 3 ; вода дистиллированная – 1 дм 3 .
Приготовление: среду готовят, как указано выше, но после охлаждения до температуры (45 ± 1) °С добавляют вместо желточной эмульсии 100 см 3 стерильного обезжиренного молока. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.
Агар Байрд-Паркера. Среда готовится согласно указанию на этикетке. Состав. Основа среды: триптон – 10,0 г; дрожжевой экстракт – 1,0 г; мясной экстракт – 5,0 г; литий хлористый гексагидрат – 5,0 г; агар – 12,0–20,0 г; вода дистиллированная – 1 дм 3 .
Раствор пирувата натрия: пируват натрия – 20,0 г; вода дистиллированная –100 см 3 .
Раствор глицина: глицин – 20,0 г; вода дистиллированная – 100,0 см 3 .
Приготовление основы среды: в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара.
При отсутствии мясного экстракта, триптона и дрожжевого экстракта вместо дистиллированной воды применяют 1 дм 3 мясопептонного бульона или питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой или питательный агар сухой II.
Все компоненты, внесенные в 1 дм 3 дистиллированной воды (мясопептонный бульон), нагревают и перемешивают до полного растворения, охлаждают до температуры 50–60 °С. Устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают в колбы или бутылки по 90 см 3 и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин.
При использовании сухой среды в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II, добавляют 5 г хлористого лития. Нагревают до полного растворения, охлаждают до температуры 50–60 °С, устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают и стерилизуют как указано выше.
Готовую основу среды хранят не более 30 сут при температуре (6 ± 2) °С.
Перед использованием к 90 см 3 расплавленной основы среды добавляют асептически стерилизованные фильтрованием через мембранный фильтр растворы: 6,3 см 3 раствора глицина, 5 см 3 раствора пирувата натрия; 1 см 3 раствора теллурита калия; 5 см 3 желточной эмульсии.
Допускается растворы глицина, пирувата натрия, теллурита калия и желточную эмульсию готовить в асептических условиях на стерильной дистиллированной воде.
После тщательного перемешивания приготовленную среду разливают в чашки Петри. Чашки со средой можно хранить не более 48 ч.
Порядок подготовки к проведению контроля. Приготовление растворов и реактивов . Раствор плазмы кроличьей цитратной готовится согласно инструкции по применению плазмы, прилагаемой к упаковке.
Растворы и реактивы для окраски препаратов готовят по ГОСТ 9225.
Приготовление реактивов для окраски по Грaму . Приготовление реактива 1: в 100 см 3 этилового спирта растворяют 0,5 г кристаллического фиолетового.
Приготовление реактива 2: к 96 см 3 спиртового раствора йодистого калия массовой концентрацией 5 г/дм 3 добавляют 2 см 3 спиртового раствора основного фуксина массовой концентрацией 50 г/дм 3 и 2 см 3 спиртового раствора йода массовой концентрацией 50 г/дм 3 .
Йодистый калий растворяют в спирте на водяной бане при температуре (45 ± 5) °С при постоянном помешивании.
Отбор и подготовка проб по ГОСТ 9225.
Метод определения количества Staphylococcus aureus с предварительным обогащением
Подготовка и проведение контроля. Из навески продукта готовят ряд десятикратных разведений по ГОСТ 9225 так, чтобы можно было определить наличие или отсутствие Staphylococcus aureus в определенной массе (объеме), указанной в нормативном документе на конкретный продукт.
Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см 3 в пробирки или колбы с солевым бульоном.
Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведенной питательной средой 1:10.
Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.
Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне, к Staphylococcus aureus делают пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний или на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркера, желточно-солевой агар или молочно-солевой агар.
Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24-48 часов.
После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.
На желточно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus имеют форму плоских дисков диаметром 2–4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды.
На молочно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus растут в виде непрозрачных круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром 2–4 мм, слегка выпуклых.
На среде Байрд-Паркера колонии Staphylococcus aureus растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром 1–1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1–3 мм.
С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных колоний и пересеивают на поверхность скошенного питательного агара, 1 см желточно-солевого агара, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии.
Посевы выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 часов.
У выросших колоний определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика.
Из пяти изолированных, характерных для Staphylococcus aureus, колоний делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.
Для приготовления препарата на чистое и охлажденное после фламбирования предметное стекло наносят петлей каплю дистиллированной воды, в которую вносят петлей небольшое количество агаровой культуры, не размешивая в воде. Затем вносят петлей каплю реактива 1, для окраски по Граму.
Смесь распределяют на участке примерно 1 см 2 , просушивают при температуре (20 ± 2) °С, фиксируют, медленно пронося предметное стекло над пламенем горелки. На одном стекле можно готовить по шесть-восемь мазков, отделяя их один от другого линиями, проведенными с лицевой стороны стекла.
Препарат ополаскивают водой и тщательно просушивают фильтровальной бумагой.
После просушивания на препарат наносят с избытком реактив 2 для окрашивания по Граму так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность стекла. Продолжительность окрашивания 0,5–1 мин. После окрашивания препарат быстро ополаскивают проточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально. Препарат просушивают фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Микробы, красящиеся по Граму, будут темно-фиолетового цвета, не красящиеся по Граму – красного цвета.
Стафилококки окрашиваются по Граму положительно (темно-фиолетового цвета), имеют шарообразную форму и располагаются скоплениями, чаще всего напоминающими гроздья винограда.
Постановка реакции плазмокоагуляции. В пробирку с 0,5 см 3 разведенной кроличьей плазмы вносят петлю суточной агаровой культуры. Внесенную культуру тщательно размешивают. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, в другую засеивают контрольный штамм Staphylococcus aureus (коагулазоположительный стафилококк).
Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температуре (37 ± 1) °С в течение 3–6 ч. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то оставляют эти пробирки до 24 ч. Если через 24 ч плазма не свернулась, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.
При определении коагулазной активности реакцию считают отрицательной в тех случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки, или в тех случаях, когда в плазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на один плюс).
Реакцию считают положительной, если:
+++ – сгусток, имеющий небольшой отсек;
++ – сгусток в виде взвешенного мешочка.
Все три варианта являются положительным результатом.
При получении положительной реакции считают, что в посевах обнаружен Staphylococcus aureus.
Обработка результатов контроля. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
Оформление результатов контроля. Морфологические, культуральные свойства и положительная реакция плазмокоагуляции свидетельствуют о присутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе продукта.
Метод определения количества Staphylococcus aureus без предварительного обогащения
После термостатирования подсчитывают количество характерных колоний на каждой чашке Петри (желточно-солевой агар, молочно-солевой агар и агар Байрд-Паркера, см. предыдущий метод). С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных и/или подозрительных колоний Staphylococcus aureus, а в случае роста менее пяти – все колонии, характерные для Staphylococcus aureus, и пересевают на поверхность скошенного питательного агара, разлитого в пробирки (см. желточно-солевой агар), но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии. Пробирки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.
У выросших культур определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика как в предыдущем методе.
Обработка результатов контроля. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
Оформление результатов контроля. Количество колоний Staphylococcus aureus в 1 г или 1 см 3 после определения его в определенной навеске продукта вычисляют по формуле:
где Σn1, Σn2 – количество колоний, выросших на всех чашках Петри в пределах одного разведения или засеянного объема; n – число десятикратных разведений.
Пример. Подсчитываем количество колоний Staphylococcus aureus, выросших на трех засеянных чашках при посевах продукта или его разведений:
| 1 г или 1 см 3 продукта: | 84 | 96 | 72 |
| 10 -1 разведение: | 9 | 10 | 7 |
| 10 -1 разведение: | 84 | 96 | 72 |
| 10 -2 разведение: | 99 | 10 | 7 |
[1] Допускается использовать солевой агар, который готовится согласно указанию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.
[2] При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм 3 дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указанию на этикетке.
[3] Допускается использовать солевой агар, который готовится согласно указанию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.
[4] При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм 3 дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указанию на этикетке.
Читайте также:
- Что такое дизентерия у телят
- Арбуз при лямблиозе у взрослых
- Лекарство от трихомонады и гонореи
- Вакцина для профилактики брюшного тифа вианвак
- Лямблиоз пути заражения пути передачи