Серологические методы в диагностике холеры

Бесплатная горячая линия юридической помощи

• Главная
• "ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2218-07" (утв. Роспотребнадзором 31.05.2007)

8. Методы серологической диагностики

Серологические методы исследования, как правило, имеют дополнительное значение, и лишь в отдельных случаях при проведении оперативного и ретроспективного эпидемиологического анализа их результаты могут быть решающими.

Для серологической диагностики холеры используют иммунологические реакции, выявляющие в сыворотке крови больных, переболевших и вибриононосителей, а также вакцинированных специфические антитела: агглютинины, антитоксины и вибриоцидные антитела.

У больных холерой на 5 - 7-й день от начала заболевания появляются агглютинины, вибриоцидные антитела и антитоксины.

Целесообразно исследовать парные сыворотки с интервалом в 7 - 10 дней. Первая проба должна быть взята на 5 - 7-й день для оперативной диагностики и вторая - через 7 - 10 дней и более - для ретроспективной.

Кровь для серологических исследований берут из вены, а при отсутствии такой возможности - из пальца. Из вены берут 1 - 5 мл крови, после свертывания сгусток отслаивают от стенки пробирки стерильной стеклянной палочкой или платиновой петлей. Пробирки сохраняют в холодильнике и транспортируют в лабораторию охлажденными (в термосе, сумке-холодильнике и др.). В лаборатории сыворотку инактивируют при температуре (56,0 +/- 0,5) °С 30 мин.

Если кровь забирают в день постановки реакции, пробирки со свернувшейся кровью необходимо центрифугировать 10 - 15 мин. при 3000 об./мин. При отсутствии возможности исследовать сыворотку немедленно ее сохраняют в ампулах при температуре (4,0 +/- 0,5) °С. Кровь из пальца берут в объеме 0,4 мл и вносят в стерильный пенициллиновый флакон или пробирку с 1,6 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия (1:5).

А. Обнаружение противохолерных антител методом развернутой реакции агглютинации

Исследуемую сыворотку разводят 1%-й пептонной водой рН 7,5 +/- 0,1 в объеме 1 мл от 1:10 до 1:640. В качестве антигена используют 3-часовую бульонную культуру, выделенную в данном очаге, или исследуют в 3-х рядах с культурами холерных вибрионов (сероваров Огава, Инаба и О139 серогруппы). В пробирку с раститрованной сывороткой вносят по 1 капле культуры-антигена и ставят на 1 ч в термостат, затем до утра в холодильник при температуре (4,0 +/- 0,5) °С, после чего отмечают результаты. Реакция сопровождается контролями антигена и сыворотки.

При определении титра реакции учитывают разведения с агглютинацией на 3 - 4 креста.

Результат исследования сыворотки больного при реакции агглютинации в разведении 1:40 и выше считается ориентировочно положительным.

Диагностическое значение имеет не менее чем 4-кратное нарастание титров антител.

Б. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) с диагностикумом эритроцитарным холерным антигенным

Для выявления полных антител в сыворотке крови предназначена РНГА. Это достаточно специфичная и чувствительная двухкомпонентная реакция. По чувствительности значительно превосходит реакцию агглютинации. Необходимые ингредиенты, методика постановки в макро- и микрообъемах изложены в наставлении к диагностикуму эритроцитарному холерному антигенному.

Результат исследования сыворотки больного в разведении 1:40 и выше считается ориентировочно положительным.

Диагностическое значение имеет не менее чем 4-кратное нарастание титров антител.

В. Реакция нейтрализации антигена (РНАг)

Для выявления антител в сыворотке крови с использованием диагностикума эритроцитарного холерного иммуноглобулинового служит РНАг. Реакция нейтрализации антигена - высокоспецифическая трехкомпонентная реакция. Ее принцип заключается в специфической нейтрализации добавляемого антигена как полными, так и неполными антителами, которые появляются ранее других. Необходимые ингредиенты, методика постановки в макро- и микрообъемах изложены в инструкциях по применению к диагностикуму эритроцитарному холерному иммуноглобулиновому.

При использовании системы реакций РНГА и РНАг отпадает необходимость в постановке контроля специфичности с каждой исследуемой сывороткой, т.к. эти две реакции взаимно контролируют полученные результаты.

Результат исследования сыворотки больного в РНАг в разведении 1:50 (1:80) и выше считается ориентировочно положительным.

Диагностическое значение имеет не менее чем 4-кратное нарастание титров антител при исследовании парных сывороток в РНГА и РНАг.

Вибриоцидные антитела в крови больных обнаруживаются и достигают максимальных значений 10(-4) - 10(-8) к 10 - 12 дню. Принцип метода во всех его вариантах заключается в том, что в присутствии вибриоцидных антител не происходит размножение холерных вибрионов.

При проведении серологических исследований в очаге, обусловленном возбудителем холеры определенного серовара, в реакции используют один штамм соответствующего серовара, при отсутствии этих данных - два штамма обоих сероваров.

Материалы и оборудование:

- исследуемые сыворотки, инактивированные прогреванием 30 мин. при температуре (56,0 +/- 0,5) °С;

- сухой комплемент или свежеполученная сыворотка морской свинки в разведении 1:20;

- 0,9%-й раствор хлорида натрия рН 7,2 +/- 0,1;

- штаммы холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба, типичные в S-форме, не чувствительные к комплементу;

- чашки Петри со щелочным агаром;

- термостат на (37,0 +/- 1,0) °С.

Методика постановки реакции

Комплемент, разведенный 0,9%-м раствором хлорида натрия 1:20, разливают в два ряда пробирок по 0,9 мл. В первую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки и после тщательного перемешивания последовательно переносят по 0,1 мл до разведения 10(-10), получая десятикратные разведения сыворотки в объеме 0,9 мл. Титрацию сыворотки проводят на льду, который помещают в любую емкость.

Из односуточной агаровой культуры холерного вибриона готовят взвесь в 0,9%-м растворе хлорида натрия, содержащего в 1 мл 1 - 2 х 10(4) м.к. Стерильной градуированной пипеткой полученную взвесь по 0,1 мл вносят в опытные пробирки с раститрованной сывороткой.

Необходимы следующие контроли: а) контроль комплемента (0,9 мл комплемента и 0,1 мл культуры); б) контроль сыворотки (0,8 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия, 0,1 мл сыворотки и 0,1 мл культуры); в) контроль культуры (0,9 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия и 0,1 мл культуры).

Штатив с пробирками на 1 ч помещают в водяную баню или термостат при температуре (37,0 +/- 0,5) °С, сделав предварительно высев из пробирки контроля культуры на 2 пластинки щелочного агара для определения фактической концентрации живых вибрионов в опытной суспензии (контроль разведения).

Через 1 ч штатив вновь ставят на лед и из каждой пробирки отдельной стерильной пипеткой 0,1 мл культуры высевают на чашку с щелочным агаром рН 7,0 +/- 0,1. Посев равномерно распределяют по поверхности чашки покачиванием или шпателем. Чашки помещают на 18 - 24 ч в термостат при температуре (37,0 +/- 0,5) °С, после чего подсчитывают количество выросших колоний.

В посевах из контрольных пробирок с культурой должно вырастать количество колоний, близкое к контролю разведения.

Вибриоцидным титром считают максимальное разведение сыворотки, которое вызывает гибель не менее чем 50% клеток холерного вибриона, что выявляется при посеве на агаровые пластинки в чашки Петри по сравнению с количеством выросших колоний из пробирки контроля комплемента.

Пример вычисления: при посеве из опытных пробирок с разведением сыворотки 10(-1); 10(-2); 10(-3); 10(-4); 10(-5); 10(-6); 10(-7) и т.д. на чашках соответственно выросло 0; 0; 5; 10; 15; 30; 38 и т.д. колоний. При высеве из пробирки контроля комплемента также после часовой инкубации при температуре (37,0 +/- 0,5) °С выросло 36 колоний, 50% от этого числа будет составлять 18. Из 5-й пробирки выросло 15 колоний, т.е. меньше 50% от количества колоний в контроле (18), в следующей - 30, т.е. более 50% этого же показателя. Разведение сыворотки в 5-й пробирке составляет 10(-5), следовательно, вибриоцидный титр в данном примере будет составлять 10(-5).

Определение вибриоцидных антител (ВА) в сыворотке крови на основе ферментации углеводов

Об отсутствии или наличии ВА судят по ферментации сахарозы, регистрируемой с помощью индикатора.

Материалы и оборудование:

- инактивированная сыворотка крови;

- штаммы холерного вибриона серовара Огава и Инаба;

- комплемент, разведенный 1:20 1%-й пептонной водой, содержащей 1% сахарозы и 1% индикатора Андреде;

- термостат на (37,0 +/- 1) °С.

Методика постановки реакции

Комплемент, разведенный 1:20 1%-й пептонной водой с сахарозой и индикатором Андреде разливают в пробирки по 0,45 мл. В первую пробирку добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки и после тщательного перемешивания переносят 0,05 мл смеси во вторую пробирку, из второй в третью и т.д. (до разведения 10(-5) - 10(-9)). Готовят суспензию 18 - 20-часовой агаровой культуры холерного вибриона и разводят 1%-й пептонной водой до концентрации 10(3) м.к./мл. Во все пробирки вносят по 0,45 мл суспензии и помещают в термостат.

Постановку реакции сопровождают следующими контролями:

- 0,45 мл 1%-й пептонной воды, содержащей 1% сахарозы и 1% индикатора Андреде + 0,05 мл исследуемой сыворотки + 0,45 мл взвеси культуры - контроль сыворотки;

- 0,45 мл комплемента с сахарозой и индикатором + 0,45 мл культуры - контроль комплемента;

- 0,45 мл 1%-й пептонной воды с сахарозой и индикатором + 0,45 мл культуры - контроль культуры;

- 0,45 мл 1%-й пептонной воды с сахарозой и индикатором + 0,05 мл исследуемой сыворотки - контроль стерильности сыворотки.

Через 5 - 6 ч проводят учет реакции. При этом в контроле (кроме контроля стерильности сыворотки) цвет содержимого пробирок должен перейти в красный или розовый. Изменение цвета индикатора в пробирках рабочего ряда, связанное с ферментацией сахарозы размножившимися вибрионами, свидетельствует об отсутствии вибриоцидных антител в исследуемой сыворотке. За вибриоцидный титр принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором цвет содержимого пробирок остается неизмененным или интенсивность его значительно отличается от окраски контрольных проб. Результат выражают в виде десятичного логарифма разведения сыворотки, взятого с обратным знаком.

Примечание. Для постановки РВА при холере, обусловленной холерным вибрионом О139 серогруппы, не может быть использован выделенный в очаге штамм в связи с возможной чувствительностью его к комплементу. В этих случаях рекомендуется предложенный специалистами Ростовского НИПЧИ, ctx- клон холерного вибриона О139, направленный на депонирование в Государственную коллекцию патогенных бактерий "Микроб" (РосНИПЧИ "Микроб").

Для выявления токсиннейтрализующих антител в сыворотке крови больных холерой и вибриононосителей предназначена РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (ЭХЭД), у которых инфицирование обусловлено холерными вибрионами О1 и О139 серогрупп. Токсиннейтрализующие антитела появляются на 5 - 7-й день болезни, достигая максимума на 14 - 21-й день, затем их титр постепенно снижается, но сохраняется дольше других антител. Иммуноглобулины к холерному токсину в сравнении с вибриоцидными и другими специфическими холерными антителами дольше циркулируют в сыворотке крови после перенесенной инфекции (до 8 - 10 и более месяцев). Условно положительным титром РНГА с ЭХЭД следует считать 1:160 и выше. Целесообразно исследовать парные сыворотки.

Результат РНГА с ЭХЭД позволяет сделать заключение о токсигенности (эпидемичности) циркулирующего в очаге штамма холерного вибриона, в том числе и без выделения культуры.

Мазки обрабатывают люминесцентной сывороткой и рассматривают в люминесцентном микроскопе. При наличии в исследуемом материале холерного вибриона в первом мазке произойдет свечение вибрионов, во втором - свечение отсутствует.

2. Реакция пассивной гемагглютинации.

Для обнаружения холерных вибрионов в содержимом кишечника используют антителъный диагностикум, т.е. эритроциты, на которых предварительно адсорбируют соответствующе антитела. Реакцию ставят по обычной методике. При наличии в исследуемом материале холерных вибрионов происходит агглютинация эритроцитов.

Для серологической диагностики холеры можно использовать реакцию агглютинации, реакцию обнаружения копроантител и реакцию определения титра вибриоцидных антител (бактериолизинов).

Реакцию агглютинации ставят по обычной методике с сывороткой больного, инактивированной нагреванием. В качестве антигена используют 5-часовую агаровую культуру холерного вибриона штамма Огава и отдельно штамма Инаба. Антитела в крови больного появляется с 5-го дня от начала заболевания. Реакция считается положительной при титре сыворотки 1:40 и выше.

0-агглютинины у больных и вибрионосителей можно определить также в инактивированной сыворотке, разведенной 1%-ной пептонной водой от 1:10 до 1:1280 в объеме 1 мл. В пробирки вносят по 0,1 мл 3-часовой бульонной культуры холерных вибрионов. После 2 часов инкубирования при 37° и выдерживания на холоде в течение ночи учитывают результат.

Для определения титра вибриоцидных антител (бактериолизинов) инактивированную сыворотку больного разводят на холоде в растворе комплемента 1:20 в объеме 0,45 мл от 1:10 до 100000. В качестве комплемента использует сыворотку морской свинки, проверенную на отсутствие естественных бактериолизинов. К каждому разведению сыворотки добавляют 0,05 мл суточной агаровой культуры холерных вибрионов с концентрацией 20000 микробных тел в 1 мл. Контролями служат пробирка, в которой отсутствует сыворотка, и пробирка, в которой отсутствует комплемент. Все пробирки инкубируют при 37º в течение 1 часа, затем помещают на холод и микропипеткой высевают по 0,05 мл из каждой пробирки на чашки с питательным агаром. Чашки помещают в термостат и инкубируют при 37°. Через 24 часа подсчитывают количество колоний, выросших на чашках с посевами из опытных и контрольных пробивок. За титр вибриоцидных антител (бактериолизинов) принимают то максимальное разведение сыворотки, при высеве из которого вырастает в 2 раза меньше колоний, чем при высеве из контрольных пробирок.

По аналогичной методике можно определить содержание вибриоцидных антител и в фильтрате содержимого кишечника (испражнений) больного холерой.

Можно определить титр вибриоцидных антител и без предварительной инактивации комплемента и без добавления стандартного комплемента. Исследуемую сыворотку в этом случае наносят каплями (в соответствующем разведении) на чашку с питательной средой, на которую предварительно наносят каплю свежей культуры и рассевают её по всей поверхности среды с помощью шпателя. На месте нанесения капель сыворотки, в которых еще содержатся вибриоцидные антитела и комплемент в достаточном количестве, чтобы вызвать лизис вибриона, роста его не будет ("стерильные пятна").

Для обнаружения антител к холерогену (антитоксинов) в настоящее время применяются иммунофлуоресцентный и иммуноферментный методы.

Кроме того, для обнаружения гена, контролирующего синтез холерогена, разработан метод ДНК-зонда.

Контрольные вопросы.

Каковы морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические особенности холерного вибриона?

Каково антигенное строение холерного вибриона?

По каким признакам отличают семейство Vibrionaceae от семейств Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae?

По каким признакам отличают род Vibrio от родов Aeromonas, PLesiomonas?

По каким признакам отличают холерный вибрион от холероподобных?

Какие существуют биотипы холерного вибриона?

Как происходит заражение при холере?

Где в организме больного локализуется холерный вибрион?

Какие микробиологические методы применяют для диагностики холеры?

Какой материал берут от больного для исследования?

Какой трупный материал подвергают исследованию?

Какие правила следует соблюдать при взятии, пересылке и исследовании материала при подозрении на холеру?

Какие питательные среды применяют для выделения холерного вибриона?

Как выделяют чистую культуру холерного вибриона?

На основании каких признаков идентифицируют холерный вибрион?

Какова сущность иммунофлуоресцентного метода ускоренного обнаружения холерного вибриона?

По каким признакам отличают классический вибрион от вибриона Эль Тор?

Какие токсины образует холерный вибрион? Какое действие оказывает энтеротоксин (холероген) на организм человека?

В чем заключается принцип патогенетического лечения больных холерой?

Как ставят пробу со специфическими холерными монофагами?

В чем заключается биологический метод определения энтеротоксигенности (холерогенности) вибрионов?

Какие серотипы различают у холерных вибрионов?

Какие основные биологические свойства парагемолитических вибрионов? Как происходит заражение ими и какие они вызывают заболевания?

Какое основное отличие галофильных вибрионов от холерных и холероподобных?

Какие метода обнаружения холерогена Вы знаете?

Какова природа и структура холерного энтеротоксина (холерогена)?

Каковы косвенные доказательства отсутствия токсигенных свойств у холерного вибриона?

Какими функциями обладают фрагменты А и В холерогена?

С чем связана способность некоторых холероподобных вибрионов вызывать холероподобные диареи?

Каким образом идентифицируют холероподобные, т.е. не относящиеся к 01-группе, вибрионы?

Используют два метода: главный - бактериологический, дополнительный - серологический.

Бактериологическое исследованиепроводят в специальных лабораториях с соблюдением строгого противоэпидемического режима.

Методы диагностики подразделяются на классические и ускоренные.

Классическое исследование проводится поэтапно, через каждые 6 часов.

1 этап. а) посев материала для обогащения на 1% пептонную воду; б) микроскопия материала (окраска по Граму и фуксином); в) посев материала на щелочной агар и среду TCBS (тиосульфатцитрат-бром-тимоловый синий, сахароза). Посевы помещают в термостат.

2 этап (через 6 часов). а) вырастает пленка на пептонной воде, делают пересев на вторую пептонную воду для дальнейшего обогащения; б) пересев из первой пептонной воды на щелочной агар и среду TCBS.

3 этап (через 12 часов исследования). а) исследование роста на второй пептонной воде (аналогично первой); б) изучение чашек первичного посева: - описание колоний (жел-тые на TCBS, прозрачные голубоватые на щелочном агаре; - микроскопия; - определение подвижности; - постановка РА на стекле с 0-1, Инаба и Огава сыворотками; просмотр колоний в стереоскопическом микроскопе (голубоватый цвет); - пересев на двухсахарную лактозо-сахарозную среду. На этом этапе может быть дан предварительный ответ.

4 этап (через 18 часов исследования). Изучение выросшей культуры: а) учет изменения лактозо-сахарозной среды (разложение сахарозы в столбике без газа); б) мазок по Граму; в) идентификация по ряду признаков.

1. Для постановки окончательного диагноза и отличия выделенных вибрионов от нехолерных:

· РА с сывороткой 0-1 (в пробирках);

· посев на триаду сахаров Хейберга: сахарозу (+), маннозу (+) и арабинозу (-);

· определение чувствительности к холерным фагам С4 и Эльтор-2.

2. Для определения серовара: РА с сыворотками Огава и Инаба (в пробирках).

3. Для определения биовара холерного вибриона:

· чувствительность к бактериофагам (классический вибрион - КС4, Эльтор - к фагу Эльтор-2;

· рост на среде с полимиксином;

· агглютинация куриных эритроцитов;

· лизис бараньих эритроцитов.

Все три последних положительны для вибриона Эль-Тор.

Длительность исследования - 36-48 часов в зависимости от скорости обогащения.

Ускоренный метод диагностики подразделяется на: ускоренный метод индикации микроба, антигена и ускоренную идентификацию.

А. Ускоренная индикация - поиск микроба непосредственно в материале или после подращивания в пептонной воде следующими методами:

а) микроскопия (по Граму и фуксином);

в) р. иммобилизации под действием сыворотки 0-1;

г) р. агглютинации растущих культур (материал засевается в 2 пробирки с пептонной водой, в одну из них добавляют диагностическую сыворотку, отмечается рост и одновременно склеивание микробов в пробирке с сывороткой);

д) проба с бактериофагами.

Б. Поиск антигена в материале серологическими методами:

а) р. энзим-меченных антител;

б) РПГА с антительным диагностикумом;

В. Ускоренная идентификация осуществляется на 3-ем этапе бактериологического исследования путем изучения свойств выросших колоний (мазок по Граму, р. агглютинации с сывороткой 0-1, посев в малые объемы трех углеводов по Хейбергу, проба с бактериофагом.

Серологический метод диагностики. Чаще носит ретроспективный характер, помогает в неясных случаях и для выявления переболевших и вибриононосителей. Используют РА и определение вибриоцидных антител. Рекомендуют использовать парные сыворотки. Положительный ответ дают при наличии высокого титра (в РА - 1:180-1:3200) или при нарастании его в парных сыворотках.

КАМПИЛОБАКТЕРИИ. КАМПИЛОБАКТЕРИОЗЫ.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ.

Род включает более 10 видов. Некоторые виды патогенны для человека, вызывают кишечный кампилобактериоз. Патогенные виды отличаются от непатогенных продукцией каталазы. Каталаза-отрицательные кампилобактерии входят в состав нормальной микрофлоры полости рта и кишечника человека и различных животных.

Наибольшее значение в развитии заболеваний у людей имеет C. jejuni (95%), реже - C. coli, еще реже - C. fetus и C. laridis. Заболеваемость кампилобактериозом носит спорадический характер, возникает при употреблении в пищу инфицированного мяса птицы, телят, свиней, могут быть вспышки молочного или водного характера. Болеют дети и взрослые, в наибольшей степени заболеванию подвержены дети в возрасте до 4 лет ( в 90% случаев).

Кампилобактерии поражают тонкий кишечник. Они прикрепляются к поверхности энтероцитов, оказывают цитотоксическое действие (выделяют энтеротоксин); обладают высокой инвазивностью, что приводит к бактериемии (у ослабленных лиц может быть сепсис). Клинически заболевание проявляется острым гастроэнтеритом, который по тяжести варьирует от кратковременной диареи до тяжелого кровавого поноса с высокой температурой и явлениями интоксикации. Летальность невелика. Иммунитет изучен плохо.

Диагностика кампилобактериоза может проводиться по короткой или полной схеме. Материал - испражнения, рвотные массы, ПВЖ (промывные воды желудка).

Короткая схема включает широкое бактериоскопическое исследование :

* фазовоконтрастную микроскопию для выявления подвижности (клетка сжимается в кольцо и разжимается как пружина),

* простую окраску препаратов (окрашиваются анилиновыми красителями за 20 секунд, энтеробактерии - за 2-3 минуты),

* окраску по Граму (выявление характерной морфологии).

На практике при наличии характерной клиники (диареи) достаточно короткой схемы исследования.

Полная схема (бактериологический метод) проводится только с материалами, в которых при микроскопии обнаружены кампилобактерии. При этом, во многих случаях достаточно идентификации до группы C. Jejuni - coli. При проведении исследования необходимы условия:

1. Наличие высококачественных питательных сред, содержащих редуцирующие вещества (активированный уголь), витамины, 5% лизированной крови (источник гемина), 5% свежей крови (эритроциты - дополнительный сорбент метаболитов), антибиотики (амфоте-рицин и др.) для подавления сопутствующей микрофлоры.

2. Культивирование в присутствии СО 42 0 или специальных газовых смесей (5% кислорода, 10% СО 42 0, любой инертный газ). Можно использовать эксикаторы со свечей или надувать двойные полиэтиленовые пакеты выдыхаемым воздухом.

3. Культивирование при различных температурах (25 5o 0, 30 5o 0, 37 5o 0, 42 5o 0 С) и дифференциация по чувствительности к налидиксовой кислоте и цефалотину. При наличии роста нежных полупрозрачных колоний грам- подвижных палочек при 42 0 С, чувствительных к налидиксовой кислоте и устойчивых к цефалотину, выдается ответ: C.jejuni-coli.

Лабораторная диагностика хеликобактериоза несколько отличается от кампилобактериоза :

1. Материал для исследования - биоптаты.

2. Гомогенизация материала.

3. Почти не применяется бактериологический метод.

Для диагностики используется комплексная микроскопия и определение уреазы в исследуемом материале. Хеликобактеры плохо красятся по Граму и не красятся простыми методам, поэтому используют специальные методы окраски, а также проводят исследования в фазово-контрастном и люминесцентном микроскопе.

РА в серодиагностике холеры : исслед сыворотку крови ( ищут антитела), используют диагностикум -3 часовая бульонная культура. Положительным считают титр 1/40, диагностическим не менее чем ; кратное увеличение.

Разведение сыворотки	1/40	1/80	1/160	1/320	1/640	КД	КС
Результат	+ хлопья	+ хлопья	+ хлопья	+ хлопья	- муть	Муть или осадок	Прозрачная

Вывод: Обследуемый болен холерой

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА Домен: Procaryota , Отдел: Gracilicutes, Сем-во: Brucelaceaceae

Возбудители B.melitensis – от овец, B.abortus – от коров, B.suis – от свиней

Морфология грамотрицательные коккобактерии

Вакцинный штамм бруцелл Окраска по Граму Увеличение х 630

Бактериологический метод

Питательные среды для культивирования бруцелл: печеночный МПБ, печеночный МПА и другие специальные среды (2 посева). Инкубация одного из посевов в атмосфере с 10% СО₂ для выделения Br. abortus в течение 1-4 недель

Учет ферментативных свойств и других признаков дифференциации бруцелл на виды и биовары (заполнить таблицу):

Вид бруцелл	Потребность в СО2	Рост в присутствии	Образование Н2S	Уреаза
фуксина 1:25000	тионина 1:50000
B.melitensis	аэробные	+	+	-	+
B.abortus	5-10% СО2	+	-	+	+
B.suis	аэробные	-	+	+	+

Серологическая диагностика бруцеллеза (с 10-12 дня болезни).1. Постановка пластинчатой реакции агглютинации Хаддлсона с концентрированным диагностикумом, окрашенным синькой:из убитых бруцелл, окрашены для лучшей видимости мелкого агглютината

Ингредиенты	Квадраты
1-й разв. 1/50	2-й разв. 1/100	3-й разв. 1/200	4-й разв. 1/400
Сыворотка больного из пальца 2мл	0,08	0,04	0,02	0,01
Диагностикум	0,03	0,03	0,03	0,03
Результат	+ агглютинат	+ агглютинат	+ агглютинат	+ агглютинат

2. Реакции Райта в серодиагностике бруцеллеза

Разведения сыворотки	1/50	1/100	1/200	1/400	1/800	1/1600	КД	КС
Результат	+ хлопья	+хлопья	+хлопья	+ хлопья	- муть	- муть	Муть или осадок	Прозрачная

Диагностический титр для взрослых равен 1/200; для детей - 1/100.

Вывод: титр равен 1/400, обследуемый болен бруцеллезом

3. Опсоно-фагоцитарная реакция (принцип метода)при болезни антитела –опсонины способствуют фагоцитозу Аллергодиагностика - проба Бюрне:Аллерген, сроки введения, результат:

Внутрикожно в ладонную поверхность предплечья вводят 0,1 мл бруцеллина. Результат реакции учитывают через 24 – 48 часов. Положительная ракция характеризуется отеком и гиперемией размером 4 (6 см.

и фагоцитарная активность увеличивается у больного увеличивается в средем на 30%;

4. Реакция Кумбса (принцип метода) выявление неполных антител:сыворотка = взвесь бруцелл +антиглобулиновая сыворотка →агглютинация по сравнению с кровью здорового не содержащего неполные антитела.

Аллергодиагностика

Аллерген, сроки введения, результат: накожный метод: тулярин (1 мл – 10 млрд. убитых микробных клеток). Пробу ставят на наружной поверхности плеча. Положительная реакция – гиперемия и отечность вокруг насечки диаметром 1–2 см через 48–72 часа.