Среда для идентификации стафилококка с маннитом

Глава 14. Стафилококки

Впервые стафилококки были обнаружены Л. Пастером в 1897 г. Подробно они были изучены А. Огстоном (1882) и Ф. Розенбахом (1884).

Морфология. Стафилококки (от греч. staphyle - виноградная гроздь) имеют вид круглых шаров диаметром 0,5-1,5 мкм. Размножаясь, образуют скопления в виде грозди винограда. Такая форма является результатом деления микробов в различных плоскостях. Однако в гное встречаются единичные и парные кокки. Стафилококки неподвижны, не имеют спор, при специальных условиях культивирования образуют микрокапсулу, грамположительны.

Культивирование. Стафилококки - факультативные анаэробы, однако лучше растут в присутствии кислорода. Растут и размножаются на обычных питательных средах, хорошо растут на средах с кровью, оптимальные условия - температура 37° С, рН 7,2-7,4.

Элективными средами являются желточно-солевой агар и солевой агар. На МПА колонии стафилококка выпуклые, круглые, непрозрачные, блестящие, размером 2-4 мм с ровными краями. При росте стафилококки образуют пигмент: золотистый, лимонно-желтый или белый. Лучше всего пигмент образуется на молочной среде при комнатной температуре и рассеянном свете. Стафилококковый пигмент не растворяется в воде, растворяется в ацетоне, эфире, спирте и т. д. При росте некоторых штаммов стафилококка на агаре с кровью вокруг колонии образуется зона гемолиза. Рост на бульоне характеризуется равномерным помутнением и осадком на дне.

Ферментативные свойства. Стафилококки вырабатывают сахаролитические и протеолитические ферменты. Сахаролитические ферменты расщепляют ряд сахаров: лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, глицерин и другие с образованием кислоты.

Протеолитические свойства стафилококка выражаются в способности растворять казеин, разжижать желатин (медленно), расщеплять другие белковые субстраты.

Стафилококки продуцируют ферменты патогенности: 1) коагулазу (сворачивает плазму крови); 2) гиалуронидазу (фактор распространения); 3) лецитиназу (растворяет лецитин оболочки клеток); 4) фибринолизин (лизирует фибрин); 5) ДНКазу (деполимеризует ДНК); 6) фосфатазу и др.

Наличие плазмокоагулазы позволяет дифференцировать золотистый стафилококк от стафилококков других видов. Многие стафилококки вырабатывают пенициллиназу, разрушающую пенициллин.

Токсинообразование. Стафилококки вырабатывают экзотоксины. К их числу относятся гемолизины четырех типов, из которых наибольшее значение имеет α-токсин. Он обладает следующими свойствами: гемолитическим - вызывает гемолиз эритроцитов, дермонекротическим - при внутрикожном введении вызывает некроз, летальным - при внутривенном введении приводит к гибели чувствительных к нему животных.

Кроме гемолизинов стафилококки образуют лейкоцидин, убивающий лейкоциты, энтеротоксины шести типов, вызывающие пищевые отравления, эксфолиатины двух типов, приводящие к отслаиванию эпидермиса у новорожденных детей.

Антигенная структура. Стафилококки имеют протеиновый антиген А, общий для всех золотистых стафилококков, и полисахаридные антигены: А, Б, С.

Стафилококки выделяют бактериоцины (стафилоцины), которые обладают антагонистическим действием по отношению к микроорганизмам данного рода.

Среди золотистых (реже эпидермальных) стафилокков различают около 40 фаговаров. Определение чувствительности выделенных из различных объектов стафилококковых культур к типовым фагам имеет важное эпидемиологическое значение (при установлении источника и путей передачи возбудителя).

Классификация. В настоящее время стафилококки, выделенные от человека, делят на 3 вида (табл. 23): S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus.

Таблица 23. Дифференциация видов стафилококков, выделенных от человека

Примечание. + наличие ферментации, устойчивости, - отсутствие ферментации, устойчивости.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Стафилококки довольно устойчивы, поэтому они обнаруживаются в воздухе, почве, воде, на предметах обихода. При температуре 100° С они погибают моментально, при температуре 70° С - через 10-15 мин. Они хорошо переносят низкие температуры. При замораживании сохраняют жизнеспособность в течение нескольких лет. Хорошо переносят высушивание. Прямой солнечный свет убивает их только через несколько часов. Обычные растворы дезинфицирующих веществ (например, сулема в разведении 1:1000) убивают их через 15-20 мин. При обезвреживании выделений, содержащих гной, белок, мокроту, не следует применять фенол. Это дезинфицирующее вещество вызывает коагуляцию белков, что предохраняет микроорганизмы от гибели. Стафилококки чувствительны к бриллиантовому зеленому.

Восприимчивость животных. К стафилококку чувствительны крупный и мелкий рогатый скот, лошади, свиньи, куры. Из экспериментальных животных - кролики, белые мыши и котята.

Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель.

Пути передачи. Контактно-бытовой, воздушно-капельный, воздушно-пылевой, пищевой.

Заболевания у человека. Пиодермия, фурункулы, карбункулы, панариции, абсцессы; воспалительные процессы различных органов и тканей; ангины, циститы, остеомиелиты, холециститы, маститы; сепсис и септикопиемия; пищевые токсикоинфекции и многие другие. Описано около 120 нозологических форм стафилококковой этиологии.

Патогенез. Стафилококки проникают через кожу и слизистые оболочки.

Преимущественное значение при стафилококковых заболеваниях имеет золотистый стафилококк (S. aureus). Менее выражена роль в патологии человека S. epidermidis и S. saprophyticus. Патогенез обусловливается свойствами возбудителя - ферментами, экзотоксинами, веществами бактериальной клетки и состоянием иммунной системы макроорганизма.

Чаще поражается кожа и подкожная клетчатка - возникают пиодермиты, фурункулы, панариции. Нередко стафилококки обусловливают вторичные заболевания, например пневмонию при гриппе. Они также вызывают раневые инфекции. Особенно велика роль стафилококков в акушерской практике, так как новорожденные очень чувствительны к ним. В течении стафилококковых заболеваний имеет значение развитие аллергии, поэтому заболевание характеризуется рецидивами.

Особое место среди стафилококковых заболеваний занимают пищевые интоксикации. Клинически они протекают как токсикозы, сопровождаются рвотой, поносом, головной болью и другими явлениями.

Иммунитет. У человека имеется естественная резистентность, связанная с механическими факторами, фагоцитозом и наличием антител. Воспалительный процесс, возникающий в месте внедрения возбудителя, обусловливает задержку стафилококков и затрудняет их распространение по организму. В образовавшемся очаге стафилококки подвергаются фагоцитозу.

Образующийся в процессе заболевания антитоксин является важным фактором в общем комплексе иммунитета. Однако приобретенный иммунитет нестойкий, поэтому наблюдаются рецидивы.

Профилактика. Сводится к улучшению санитарно-гигиенических условий, активному выявлению больных и бактерионосителей, правильному режиму работы больничных учреждений.

Специфическая профилактика. Стафилококковый анатоксин и антистафилококковый иммуноглобулин.

Лечение. Антибактериальные препараты, поливалентный стафилококковый бактериофаг, антистафилококковая плазма и иммуноглобулин. В некоторых случаях при хроническом течении стафилококковых инфекций применяют аутовакцину.

1. По какому признаку кокки объединены в одну группу?

2. Какие ферменты и факторы патогенности продуцируют стафилококки?

3. Какие заболевания вызывают стафилококки?

4. Какие виды стафилококков Вы знаете?

Цель исследования: выделение и идентификация стафилококков.

1. Гной (фурункулы, карбункулы, абсцессы).

2. Слизь из зева (ангина).

3. Мокрота (пневмония).

4. Моча (пиелиты и циститы).

5. Дуоденальное содержимое (холецистит).

6. Кровь (подозрение на сепсис).

7. Рвотные массы, промывные воды желудка, пищевые продукты (пищевые отравления).

8. Слизь из носа (обследование на бактерионосительство).

Способы сбора материала

Первый день исследования

Все посевы ставят в термостат на сутки.

Обнаружение стафилококков при микроскопии гноя из закрытого абсцесса и осадка мочи, взятой катетером, позволяет дать предварительный положительный ответ: обнаружен стафилококк.

Посевы на плотных и жидких питательных средах вынимают из термостата и изучают. Подозрительные в отношении стафилококка колонии, выросшие на желточно-солевом агаре, отсевают на скошенный агар для получения и дальнейшего изучения чистой культуры. При этом учитывают наличие лецитиназы, которое проявляется в образовании радужного венчика вокруг колонии. Чашки с оставшимися колониями оставляют на 2-3 дня при комнатной температуре для выявления пигмента. Просматривают посевы на чашках с агаром, содержащим кровь. Колонии с четкой зоной гемолиза (просветление) вокруг них выделяют на скошенный агар. Посев крови в сахарном бульоне инкубируют 10 сут, производя через 2-3 дня высевы на агар с кровью и желточно-солевую среду.

При отсутствии роста на плотных питательных средах делают высев из бульона с глюкозой на агар с кровью. Посевы ставят в термостат на сутки.

Вынимают посевы из термостата. Из выделенных на скошенный агар культур делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии грамположительных стафилококков проводят дальнейшее изучение выделенной культуры:

а) ставят реакцию плазмокоагуляции;

б) изучают гемолитические свойства;

в) определяют продукцию ДНКазы;

г) определяют ферментацию маннита в анаэробных условиях;

д) определяют устойчивость к новобиоцину.

Реакция плазмокоагуляции. Цитратную плазму, полученную из крови кролика, разводят изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:4 и наливают в две преципитационные пробирки по 0,3-0,5 мл. В одну пробирку вносят петлю исследуемой культуры, другая пробирка служит контролем. Обе пробирки ставят в термостат при температуре 37° С. Учет реакции производят через 2-3 ч. При отсутствии свертывания плазмы посевы оставляют при комнатной температуре на 24 ч, после чего учитывают реакцию. При наличии фермента коагулазы плазма свертывается (не выливается из перевернутой пробирки). В контрольной пробирке консистенция плазмы не изменяется.

Ускоренный метод определения коагулазы. В стерильной капле воды на предметном стекле суспендируют выделенную культуру, к ней прибавляют одну каплю неразведенной плазмы. При положительной реакции из микробных клеток в течение 20-60 с образуются крупные хлопья. Этот метод используют при массовых обследованиях.

Определение гемолитических свойств. Производят посев на агар с 5% крови (штаммы, продуцирующие α-гемолизин, дают зоны просветления среды и на кроличьей и на бараньей крови, продуцирующие β-гемолизин лизируют только эритроциты барана).

Определение ДНКазы. Исследуемую культуру засевают на среду, содержащую ДНК. Посевы инкубируют. Через 18-20 ч на чашку с выросшими колониями стафилококка добавляют 5-7 мл раствора хлороводородной кислоты. ДНК реагирует с кислотой и среда становится мутной. Если выделенная культура продуцирует фермент ДНКазу, он деполимеризует ДНК и помутнение не образуется.

Расщепление маннита в анаэробных условиях. Исследуемую культуру засевают уколом на полужидкий агар с маннитом. Поверхность среды заливают вазелиновым маслом. Инкубируют 18-24 ч при 37° С. Положительная реакция характеризуется изменением цвета среды (в среде имеется индикатор).

Производят учет результатов (табл. 24).

Таблица 24. Свойства золотистого стафилококка

Примечание. + положительная реакция.

Наличие перечисленных признаков позволяет отдифференцировать золотистые стафилококки от стафилококков других видов и дать окончательный ответ: выделен S. aureus (рис. 37).

Рис. 37. Схема выделения и идентификации стафилококка

Для установления эпидемиологической цепочки выделенную культуру фаготипируют. Фаготипирование может подтвердить идентичность стафилококков, выделенных от разных больных и из объектов внешней среды.

Для фаготипирования используют критические тест-разведения фагов. Критическим тест-разведением называют то максимальное разведение фагов, при котором происходит полусливной лизис соответствующего штамма стафилококка.

Методика фаготипирования. В чашку Петри наливают 20 мл 1,5% МПА, дают ему застыть и подсушивают в термостате в течение 30-40 мин. На поверхность агара наносят 1 мл 4-6-часовой культуры выделенного стафилококка, распределяют по поверхности всей чашки, избыток жидкости отсасывают или дают ей испариться в термостате в открытой чашке. Предварительно дно чашки делят на секторы или квадраты. Число квадратов или секторов должно соответствовать количеству используемых фагов. Затем на каждый квадрат или сектор наносят один фаг.

Чашки ставят в термостат при температуре 37° С. Результаты определяют через 6-7 ч. Если чашки оставляют при комнатной температуре, то учет фаголизиса производят через 18-24 ч.

Биологические пробы. Проба на определение летальных свойств культуры. Для выявления летального действия токсина кролику вводят внутривенно (или внутрибрюшинно) фильтрат бульонной культуры стафилококка из расчета 0,1-0,2 мл фильтрата на 1 кг массы кролика. Гибель кролика через 3-4 дня свидетельствует о наличии летального действия токсина.

Дермонекротическая проба. Пробу ставят на кролике (наиболее чувствительному к этому токсину животному). Предварительно на боку или на спине животного выщипывают шерсть и вводят внутрикожно 0,2 мл двухмиллиардной взвеси стафилококковой культуры в изотоническом растворе натрия хлорида. При наличии в выделенной культуре некротических свойств в месте введения образуется инфильтрат, сопровождающийся некрозом.

Реакцию учитывают через 24-18 ч.

Полученную культуру стафилококка проверяют на чувствительность к антибиотикам методом бумажных дисков (см. главу 9).

1. Какой материал исследуют при заболеваниях, вызываемых стафилококками?

2. Каковы основные методы лабораторного исследования для выявления стафилококков?

3. Какова методика постановки реакции плазмокоагуляции?

4. На какой среде выявляют гемолитические свойства стафилококков?

5. С какой целью проводят фаготипирование?

Проверьте, к какому антибиотику чувствительна выделенная культура стафилококка.

Желточно-солевой агар Чистовича. Готовят желточную смесь (1 желток куриного яйца на 150 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида). К мясопептонному солевому агару (8-10% натрия хлорида), растопленному и остуженному до 45° С, добавляют 20% желточной взвеси (соблюдают стерильность) и разливают в чашки.

Агар с кровью. См. главу 7.

Солевой бульон, солевой агар. Готовят как обычные среды - МПБ и МПА, только натрия хлорид вносят в большем количестве (8-10%). Бульон разливают в колбы, пробирки, агар - в чашки.

Для выделения культур стафилококков обычно используют 5%-ный кровяной агар (кровь овцы, кролика, крупного рогатого скота). При исследовании образцов, содержащих постороннюю микрофлору, целесообразно использовать селективные среды.

Таблица 9. Дифференциальные признаки стафилококков, имеющих основное медицинское значение

Признак	S. aureus	S. epidermidis	S. saprophyticus
Anaerobius	Aureus
Наличие каротиноидного сегмента	–	±	–	+
Способность к росту в анаэробных условиях (тиогликолевая среда)	+	+	+	±
Рост на средах с 10% NaCI	+	+	± (слабо)	+
Рост при:
15°С	?	+	– (слабо)	+
45°С	–	+	+	±
Образование кислоты при ферментации углеводов в аэробных условиях:
ксилоза	–	–	–	–
арабиноза	–	–	–	–
раффиноза	–	–	–	–
сахароза	+	+	+	+
маннит	–	+	–	±
манноза	–	+	±	–
трегалоза	–	+	–	+
лактоза	–	+	±	±
галактоза	–	+	±	–
фруктоза	+	+	+	+
ксилит	–	–	–	±
Восстановление нитратов	–	+	+ (слабо)	–
Щелочная фосфатаза	+	+	+	–
Гиалуронидаза	+	+	+	?
Уреаза	?	±	+	+
Коагулаза (на сыворотке кролика)	+	+	–	–
Фибринолизин	?	±	±	?
Гемолитическая активность	+	+	– (слабо)	–
ДНКаза	+	+	– (слабо)	–
Чувствительность к новобиоцину (МИК >1,6 мкг/мл)	+	+	+	–

С целью дифференциации патогенных стафилококков от сапрофитных, а также от микрококков, используют среды, позволяющие одновременно определить один из признаков, характеризующих патоген­ные стафилококки. Приводим рецепты некоторых питательных сред.

Молочно-солевой агар

В 100 мл МПБ растворяют 6,5 г хлорида натрия, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,4, стерилизуют при 121°С 20 минут. Перед использованием агар расплавляют, охлаждают до 45°С, добавляют 10% стерильного обезжиренного молока и разливают по чашкам Петри. На этой среде определяют пигментообразование и способность к росту при наличии 6,5% хлорида натрия.

Лактозо-солевой бульон с фенолротом

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара. Устанавливают рН 6,8, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121°С 15 минут. При росте коагулазоположигельных стафилококков среда желтеет (тест на коагулазу положительный).

Теллурит-полимиксин-желточный агар Крисли

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г маннита, 20 г хлорида натрия, 2 г хлористого лития, 18 г агара. Устанавливают рН 7,3, стерилизуют 15 минут при 121°С. Перед использова­нием в среду добавляют 100 мл 30%-ной желточной эмульсии (на фи­зиологическом растворе), 0,4 мл стерилизованного фильтрацией 1%-ного водного раствора полимиксина М, 10 мл стерилизованного автоклавированием (121°С 15 мин) 1%-ного водного раствора теллурита натрия.

Среда Джиолиотта и Кантони

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 5 г дрожжевого экст­ракта, 5 г хлористого лития, 20 г маннита, 5 г хлористого натрия, 1,2 г глицина, 3 г пирувата натрия. Устанавливают рН 6,9, стерилизуют при 115°С 20 мин. Перед употреблением к среде добавляют 0,1 мл 1%-ного водного раствора теллурита натрия, стерилизованного фильтра­цией, При росте коагулазоположительных стафилококков наблюдается почернение среды или черный осадок.

Среда Бэрда-Паркера

К 90 мл основной среды с температурой 45°С добавляют 6,3 мл глицинового раствора, 1 мл раствора теллурита натрия, 5 мл эмульсии желтка, перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда пригодна к использованию в течение 28 дней (хранение при 4°С). Перед посевом на поверхность среды наносят 0,5 мл 20%-ного водного раствора пирувата натрия, стерилизованного фильтра­цией; распределяют по поверхности, подсушивают. Колонии коагула­зоположительных стафилококков черные, блестящие, с узкой серо-белой полосой и окружены прозрачной зоной.

Желточная эмульсия. Свежее куриное яйцо выдерживают в 0,001%-ном растворе HgCl₂. Соблюдая требования асептики, отделяют желток и эмульгируют его в 200 мл физиологического раствора.

Глициновый раствор. Глицин — 20 г, дистиллированная вода — 100 мл. Стерилизуют при 120°С 15 минут.

Раствор теллурита натрия. Теллурит натрия — 1 г, дистиллированная вода — 100 мл. Стерилизуют фильтрацией.

Желточно-солевой агар Чистовича

В расплавленный МПА с 10% хлорида натрия (рН 7,2), охлажденный до температуры 60°С, добавляют желточную эмульсию. После тщательного перемешивания питательную среду разливают в чашки Петри.

Среда Чаплина-Бернса

К 100 мл МПА добавляют 3,3 мл 0,1%-ного водного раствора кристаллического фиолетового и 5 г лактозы. Устанавливают рН 6,8. Стерилизуют автоклавированием (110°С 30 минут). Колонии патогенных стафилококков растут быстрее, чем непатогенных, и приобретают фиолетовый или оранжевый цвет.

Среда Чемпена (для выделения патогенных стафилококков)

Вариант 1: пептон — 1%, D-маннит — 1%, натрия хлорид — 7,5%, дрожжевой экстракт — 0,25%, двузамещенный фосфорнокислый ка­лий — 0,5%, агар-агар — 1,5%. Среду стерилизуют 90 минут при 110°С, устанавливают рН 7,0 и добавляют 10% стерильного обезжиренного молока (молоко способствует лучшему образованию пигмента).

Вариант 2: пептон — 1%, дрожжевой экстракт — 0, 25%, желатин — 3%, лактоза — 0,2%, D-маннит — 1%, натрия хлорид — 7,5%, двузамещен­ный фосфорнокислый калий — 0,5%, агар-агар — 1,5%. Стерилизуют 90 минут при 110°С, устанавливают рН 7,0.

Материал	Метод исследования	Результаты
Гной, эксудат, некроти-ческие массы	1. Микроскопический 2. Бактериологический Посев на ЖСА, МСА А. Микроскопия мазков из колоний Б. Выделение чистой культуры Установление принадлежности культуры к роду Staphylococcus А. Микроскопический Б. Культуральное определение ферментации глюкозы в анаэробных условиях Видовая идентификация I. Коагулаза Определение признаков патогенности 1. Плазмокоагуляция 2. Лецитиназа 3. Гемолизин 4. Гиалуронидаза 5. ДНК-аза	Гр+кокки Рост пигментированных кокков Гр+кокки Гроздекокки Пигментообразование. Ферментация с образо-ванием кислоты Коагулазоположительные

Идентификация стафилококков

Целью первичной идентификации является установление принадлежности выделенной культуры к семейству Micrococcaceae и роду Staphylococcus. Для установления принадлежности культур к семейству микрококков используют тест на каталазу.

Отмечают способность представителей семейства микрококков, имеющих фермент каталазу, расщеплять перекись водорода, образуя воду и газообразный кислород.

В отличие от микрококков представители родственного семейства стрептококков каталазы не имеют.

Видовая идентификация стафилококков

Последним этапом исследования является дифференциация S. aureus от представителей двух коагулазоотрицательных видов стафилококков. Если установлено, что штамм относится к виду S. aureus, проводят его идентификацию.

Идентификация S. aureus

Ориентировочные данные о принадлежности культуры к Staphylococcus можно получить при изучении характера колоний, выросших после посева исходного материала на элективную среду (для стафилококков – молочно-желточный солевой агар).

Определение лецитоветиллазы (лецитиназы)

Хлористый натрий является элективным фактором, так как подавляет рост большинства представителей микрофлоры, главным образом, грамотрицательной. Из компонентов яичного желтка – лецитоветиллаза является субстратом для фермента лецитоветиллазы. При расщеплении лецитоветиллина вокруг лецитиназоположительной колонии на поверхности среды образуется радужный венчик. Добавление в среду молока путем сложных химических процессов стимулирует образование стафилококками золотистого или лимонно-желтого пигмента, относящегося к группе каротиноидов.

Как правило, штаммы S. aureus обладают лецитиназой и пигментом, а культуры двух других видов лишены их. Возможны, однако, исключения: некоторые штаммы S. aureus не имеют пигмента или лецитиназы, а ряд штаммов S. epidermidis обладают лецитиназной активностью.

Реакция плазмокоагуляции

Принцип. Под действием фермента плазмокоагулазы активизируется естественная система свертывания крови (плазминогенротромбин).

Приготовление свежей плазмы. Стерильно взятую из сердца кровь кролика в количестве 3 мл вносят в пробирку с 2 мл стерильного 5 % раствора лимоннокислого натрия, смешивают и центрифугируют для осаждения форменных элементов крови в течение 10 минут при 1500 об/мин.

Плазму отсасывают, разводят в 5 раз стерильным физиологическим раствором и разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл.

Ход исследования. В пробирку вносят 1 петлю суточной агаровой культуры исследуемого штамма, которую суспензируют в плазме. Штатив с пробиркой помещают в термостат при 37 °С и регистрируют результаты через 1, 2, 4 и 18 часов инкубации.

Оценка результатов. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка любого размера считается положительным результатом реакции. Отсутствие свертывания плазмы в течение 18 часов расценивается как отрицательный результат. В качестве контроля рекомендуется ставить реакцию с заведомо коагулирующим и некоагулирующим штаммами, а также оставлять одну пробирку с плазмой незасеянной.

Окончательная идентификация S. aureus требует постановки еще двух тестов. На первом этапе определяют наличие у штаммов плазмокоагулазы. Если после этого штамм идентифицировать не удается, дополнительно определяют один из двух следующих признаков: наличие ДНК-азы (что предпочтительнее) или способность ферментировать маннит в анаэробных условиях.

При наличии положительного результата в реакции плазмокоагуляции и хотя бы в одном из двух предварительных тестов (пигмент лецитиназа) исследуемый штамм может быть отнесен к виду S. aureus (варианты 2-3).

Отсутствие плазмокоагулазы и хотя бы одного из двух первых признаков дает основание считать, что штамм не принадлежит к S. aureus (варианты 5-7).

Расхождения между результатами реакции плазмокоагуляции, с одной стороны, и двух предварительных тестов – с другой (варианты 4 и 8), требует постановки одного из двух дополнительных тестов (ДНК-азы или ферментации маннита в анаэробных условиях). В случае совпадения результатов дополнительного теста с результатами реакции плазмокоагуляции штамм считается либо относящимся к виду S. aureus при положительных результатах (варианты 4а и 4в), либо не относящимся к нему (при отрицательных, варианты 8б и 8г), или отрицательных (принадлежность к другим видам, варианты 4б и 4г) результатов.

Проводить идентификацию S. aureus лишь на основании результата одного теста не рекомендуется.

Определение ДНК-азы

Принцип. Под действием ДНК-азы (дезоксирибонуклеазы) добавленная в плотную среду высокополимерная ДНК распадается на низкополимерные фрагменты. При этом мутная, среда становится прозрачной.

Определение ферментации маннита в анаэробных условиях

Определение ферментации глюкозы в анаэробных условиях. Определение проводят аналогичным путем, в качестве субстрата используют 1% раствор маннита.

Идентификация S. epidermidis и S. saprophyticus

Те штаммы, которые после исследований, описанных выше, признаны не относящимися к S. aureus, подвергаются дальнейшей идентификации для установления их видовой принадлежности.

Дифференциацию S. epidermidis; и S. saprophyticus рекомендуется проводить в трех тестах:

1) определение устойчивости к новобиоцину;

2) наличие фосфатазы;

3) способность окислять маннит.

Для штаммов S. epidermidis характерны: чувствительность к новобиоцину, наличие фосфатазы, неспособность окислять маннит; для штаммов S. saprophyticus – противоположные свойства. Поскольку не все стафилококки по своим характеристикам укладываются в указанную схему, такие штаммы следует обозначать Staphylococcus Spp.

Вопросы для обсуждения

1. Общая характеристика патогенных кокков.

2. Морфология, тинкториальные и культуральные свойства стафилококков.

3. Токсины и ферменты "агрессии".

4. Классификация стафилококков.

5. Способы обнаружения токсинов и ферментов "агрессии".

6. Лабораторная диагностика.

7. Препараты, применяемые для специфического лечения и профилактики стафилококковых заболеваний.

Клетки стафилококков сферические, 0,5 - 1,5 мкм в диаметре. В результате деления более чем в одной плоскости образуют гроздьевидные скопления. Неподвижные, грамположительные. Образуют внеклеточные ферменты и токсины. Температурный оптимум 35 - 40°С. пределы для роста 6,5 - 46°С. Оптимум рН 7,0 - 7,5, пределы рН для роста - 4,2 - 9,3. Стафилококки активно образуют пигмент (липохром) золотистый, эмалево-белый, лимонно-желтый, особенно при комнатной температуре (20°С) и при доступе воздуха. Колонии стафилококков на плотных средах имеют форму правильных дисков от 2 до 4 мм в диаметре. Края колонии ровные, поверхность слегка выпуклая, блестящая, непрозрачная, окрашена в цвет пигмента. В жидких средах дают сильное диффузное помутнение, образуя постепенно осадок. Согласно последней классификации (Берги, 1980) род Staphylococcus включает три вида: Staph.aureus, St.epidermidis, St.saprophyticus. Стафилококки, относящиеся ко всем трем видам, могут быть причиной различных заболеваний человека, а стафилококки, вырабатывающие энтеротоксины, при определенных условиях могут вызывать пищевые интоксикации. В настоящее время Sasph.aureus целесообразно использовать в качестве санитарно-показательного микроорганизма при исследовании пищевых продуктов, а также при обследовании объектов общественного питания, особенно пищеблоков в детских дошкольных и подростковых учреждениях для оценки их санитарного содержания.

4.5.1. Методика количественного определения Staph.aureus.

Методика выделения St.aureus предусматривает его количественное определение в пищевых продуктах и наличие его в смывах.

1 этап: Из исходной 10% взвеси продукта производят посев на элективные среды: желточно-солевой (ЖСА) или молочно-солевой (МСА) агары. Основную 10% взвесь в количествах 0,5 и 0,1 мл (0,05 и 0,01 г продукта) наносят на поверхность среды, равномерно распределяют и тщательно растирают шпателем. Кроме этого, 1 мл исходной взвеси (0,1 г продукта) засевают в пробирки с 5 мл 6,5%-го солевого бульона. Продукты жидкой консистенции высевают на плотные среды в количестве 0,5 и 0,1 мл, а в жидкие - 1,0 мл. Продукты с пониженной водной активностью (аw 0,86) или с повышенным содержанием поваренной соли дополнительно засевают также в количестве 1,0 мл (0,1 г, мл продукта) на сахарный бульон, разлитый в пробирки по 5 мл.

Посевы инкубируют при 37°С в течение 18 - 24 часов, чашки с плотными средами оставляют еще на сутки при комнатной температуре*(7).

2 этап. а) Просматривают посевы на МСА или ЖСА, на ЖСА колонии стафилококков дают радужный венчик, на МСА - образуют пигмент: золотистый, кремовый, эмалево-белый и др. Изолированные колонии, подозрительные на стафилококк, изучают, микроскопируют с окраской по Граму и высевают на скошенный МПА или на сектора чашки с молочным агаром. Число колоний, взятых для идентификации, должно быть не менее 5 - 7.

б) Из сред обогащения производят высевы на сектора чашки с молочным агаром.

Все посевы инкубируют при 37°С в течение 18 - 24 часов.

3 этап: Выделенную чистую культуру с секторов на чашках с молочным или из пробирок со скошенным МПА подвергают микроскопии с окраской по Граму. При наличии мелких грамположительных кокков ставят реакцию плазмокоагуляции.

4.5.2. Постановка реакции плазмокоагуляции.

Наилучшим методом предварительной идентификации St.aureus в лабораторных условиях является коагулазная проба в пробирке, закрытой ватной пробкой, с кроличьей или человеческой плазмой. При чтении реакции плазмокоагуляции установлено 3 градации активности фермента коагулазы:

1) ++++ - сгусток плотный, 2) +++ - сгусток, имеющий небольшой отсек, 3) ++ - сгусток в виде взвешенного мешочка.

Эту реакцию следует читать очень осторожно, чтобы не повредить и не нарушить начало ее образования.

Постановка реакции: В пробирку с 0,5 мл цитратной плазмы, разведенной изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:4, вносят петлю суточной культуры стафилококка и ставят в термостат при 37°С. Осторожно просматривают реакцию плазмокоагуляции через 30 минут, 1 час, 2 - 4 часа и оставляют до утра при комнатной температуре для окончательного учета. Ускорение реакции производят за счет использования 3 - 4 часовых бульонных культур, добавляя их в количестве 0,1 мл к 0,5 мл разведенной плазмы.

После полного подтверждения принадлежности выделенных штаммов к St.aureus производят подсчет колоний на плотной среде и устанавливают содержание стафилококков в 1 г (мл) исследуемого продукта.

4.5.3. Определение St.aureus в особо скоропортящихся продуктах, имеющих микробиологический норматив*(8).

В ряде продуктов общественного питания, микробиологические нормативы предусматривают отсутствие St.aureus в 0,1 г и в 1,0 г продукта.

В тех случаях когда отсутствие St.aureus предусматривается в 0,1 г продукта, необходимо 1 мл 10%-й взвеси продукта, приготовленной в соответствии с п.4.2., внести в 9 мл солевого бульона (6,5% aCl). В тех случаях, когда отсутствие St.aureus предусматривается в 1 г продукта, для этих целей усредненная проба массой в 10 г растирается в стерильной ступке и отсюда делается навеска на стерильном часовом стекле или стерильном пергаменте массой 1,0 г и засевается в 9 мл солевого бульона.

Посевы инкубируют при 37°С в течение 18 - 24 часов. После чего из солевых бульонов производят подтверждающий посев петлей на сектора чашки Петри с желточно-солевым агаром или молочно-солевым агаром. Инкубацию посевов производят при 37°С в течение 18 - 24 часов. После чего чашки просматривают. При отсутствии роста типичных колоний для St.aureus делают заключение об отсутствии этого микроорганизма в исследуемой навеске продукта (в 1,0 г или 0,1 г).

При наличии роста подозрительных на стафилококки колоний производят их изучение, как в п.4.5.1. (этапы 2 и 3), п.4.5.2.

При наличии коагулазоположительных St.aureus делают заключение о присутствии этого микроорганизма в исследуемой навеске продукта. Следовательно, данный продукт не соответствует требуемому нормативу - "отсутствие St.aureus в 1,0 или в 0,1 г продукта".

4.5.4. Дополнительные тесты идентификации.

При наличии санитарно-эпидемического неблагополучия следует использовать дополнительные тесты. Прежде всего еще раз уточнить реакцию плазмокоагуляции, с этой целью культуру пересевают 2 - 3 раза на скошенном МПА и повторяют постановку реакции, или рассевают культуру на чашках с мясо-кептонным агаром для проведения повторной идентификации из новых колоний стафилококков. В случае неудовлетворительных результатов целесообразно из первичных посевов взять ряд других колоний и подвергнуть их вновь идентификации.

Если выделенную культуру не идентифицировали как St.aureus, следует использовать дополнительные тесты: постановку реакции на термостабильную ДНКазу, окисление маннита, фосфатазу, лецитовителлазу.

4.5.4.1. Тест на лецитовителлазу

При использовании для первичного посева среды, содержащей желток, специального, дополнительного определения лецитовителлазной активности у стафилококков проводить на следует. В случае выделения культур с других сред и необходимости определения у них этого признака на чашку с желточным агаром сеют испытуемую культуру штрихом или бляшкой - последнее экономнее. Чашки инкубируют при 37°С в течение 18 - 20 часов. При положительном результате вокруг колонии стафилококка образуется радужный венчик, что обусловлено выделением фермента лецитовителлазы и разложением лецитина, находящегося в среде. Реакцию следует учитывать в отраженном свете.

4.5.4.2. Реакция на разложение маннита в анаэробных условиях

Используют среду, приготовленную из сухого препарата с индикатором ВР и маннитом, разливают в пробирки по 10 мл, стерилизуют при 0,7 атм 20 минут. Перед посевом среду освобождают от воздуха, для чего пробирки кипятят в водяной бане при 100°С 10 минут, затем быстро охлаждают в ледяной воде и немедленно производят посев уколом. Сверху засеянную среду заливают расплавленным 2% водным агаром слоем 2 - 3 см, чтобы исключить попадание воздуха. Посевы термостатируют при 37°С в течение 4 дней. Просмотр осуществляют на 2 и 4 дни. Результаты расценивают как ферментацию маннита, когда нижняя и верхняя части среды четко изменяют цвет из зеленого на синий. В этом случае микроорганизмы идентифицируют как St.aureus. Если посинеет только верхняя часть среды, то имеет место окисление маннита. Если спустя 4 дня инкубации на произошло посинения, сбраживания маннита на произошло. В 2-х последних случаях микроорганизмы относят к St.epidermidis или St.saprophyticus.

4.5.4.3. Определение активности кислой фосфатазы

Среда: к 100 мл 2% МПА, расплавленного и остуженного до 45°С, добавляют 50 мг паранитрофенилфосфата натрия, разливают в чашки Петри. Посев производят бляшками - до 20 бляшек на чашку. Реакцию можно учитывать уже через 2 часа инкубации при 37°С. Вокруг бляшек при положительной фосфатазной пробе среда окрашивается в желтый цвет. Интенсивность окрашивания увеличивается через 18 - 24 часа - практически окрашивается вся среда.

4.5.4.4. Тест на наличие термостабильной дезоксирибонуклеазы (ДНКазы)

ДНКаза определяется по методу, основанному на метахроматических свойствах толуидина голубого. Этот метод диффузии в агар термостабильной ДНКазы St.aureus позволяет определить ее в концентрации примерно 0,005 мг/мл.

Среда: к 1000 мл 0,05 М трис-буфера (оксиметиламинометан) рН 9,0, добавляют 0,3 г ДНК, затем 10,0 г агара Дифко, 1 мл 0,01 М CaCl2, 10,0 г NaCl, 3,0 мл 0,1 М толуидина голубого. Среду разливают в пробирки по 12 - 15 мл, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике до 3 - 5 месяцев. Перед постановкой реакции среду растапливают и разливают в чашки Петри, подсушивают при 4°С в течение 1 часа, вырезают лунки диаметром 3 мм, отсасывают пипеткой агар и вносят в лунки пастеровской пипеткой культуры, инкубируют при 37°С.

Перед изучением культур пробирки с суточным ростом стафилококков на полужидком агаре прогревают в кипящей водяной бане 15 минут и вносят в лунки в агаровой пластинке, содержащей толуидин голубой. Зоны просветления с розовым окрашиванием образуются в результате гидролиза ДНК, находящейся в среде, термостабильной ДНКазой стафилококков. Проявление через 1 - 2 часа после внесения розовоокрашенных зон расценивается как положительная реакция на наличие термостабильной ДНКазы.

4.5.8. Идентификация стафилококков*(9)

|Дифференцирующие признаки:| Наименование вида |

| |St.aureus | St.epidermides |St.saprophyticus|

|1. Морфология с окраской|мелкие | кокки, грам + |крупные кокки,|