Стафилококк на байрд паркере

Также известно, как BP Agar; Egg Yolk Tellurite Glycine Pyruvate Agar; ETGP Agar

Назначение

Плотная селективная среда для быстрого определения стафилококков в различных образцах, согласно фармакопеи и стандартам ISO.

Описание

Основа Агара Бэрда-Паркера специально рекомендована для определения и подсчета стафилококков в пище и других образцах, кроме того позволяет хорошо дифференцировать коагулазо-позитивные штаммы. Рост сопутствующей флоры обычно подавляется благодаря высокой концентрации лития, глицина и пирувата. Литий и глицин усиливают рост стафилококков. Изредка на этой среде могут давать рост некоторые виды Bacillus, дрожжи и вполне вероятно, протеи. Рост протея может быть подавлен путем добавления в среду 50 мг/л сульфаметазина.

Присутствие теллурита и яичного желтка, которые всегда добавляются в среду после стерилизации, позволяют дифференцировать патогенные стафилококки. Имеется высокая корреляция между коагулазным тестом и присутствием очищенной зоны липолиза в среде, которая образуется у лицитиназных видов стафилококков. Во-первых, исследования показывают, что почти 100% коагулазо-позитивных стафилококков способны редуцировать теллурит, что проявляется образованием черных колоний на данной среде (другие стафилококки не всегда могут обладать таким эффектом).

При использовании стерильных реагентов не от Scharlau microbiology среду готовят, добавляя 50 мл стерильной эмульсии яичного желтка и 10 мл 1% раствора теллурита калия. Во избежание потери четкости в зонах преципитации, чашки следует использовать в день приготовления или в течение 48 часов. Основа среды, без желтка или теллурита, идеально стабильна и поэтому может подвергаться повторному плавлению.

Развести 60 г порошка в 950 мл дистиллированной воды. Дать настояться и затем довести до кипения при постоянном помешивании. Стерилизовать автоклавированием 15 минут при температуре 121ºС. Остудить до 50ºС и затем добавить 50 мл Яично-желточной стерильной эмульсии. Хорошо перемешать и разлить в пластины. После приготовления, среда не должна повторно нагреваться, и не должна стерилизоваться снова.

На чашку с питательной средой наносится 0,5 мл исследуемого образца, и с помощью петли он Дригальского растирается по поверхности среды. После 18-24 часов инкубации при 35ºС выбирают черные блестящие выпуклые колонии с характерной зоной просветления вокруг нее. Это первичная идентификация коагулаз-позитивного Staphylococcus aureus.

Проявления колоний после 24 часов инкубации при 35ºС:

-Staphylococcus aureus: черные, блестящие, выпуклые правильные колонии, 1,0-1,5 мм в диаметре, с зоной липолиза 2-5мм вокруг колонии. После 48 часов преципитирующая зона может стать матовой.

-Другие штаммы Staphylococcus: Черные, обычно нечеткие, с правильными краями. Иногда они коричневые с зоной просветления, но широко присутствует в основном мутная зона.

-Micrococcus spp: коричневые, очень маленькие и без зоны липолиза.

-Bacillus spp: колонии различных оттенков коричневых цветов, большие. Могут образовывать через 48 часов зону липолиза.

-Дрожжи: белые, большие и гладкие колонии.

Эмульсию яичного желтка можно приготовить путем смешивания свежего яичного желтка с равным количеством (в/о) солевого раствора. Эмульсию стерилизуют путем фильтрования и добавляют в среду с соблюдением правил асептики. (Scharlau microbiology продает этот реагент в стерилизованном виде, Артикул 06-016). Раствор теллурита калия готовят путем растворения 3,5 г теллурита калия в 100 мл дистиллированной воды. Стерилизуют путем фильтрования. (Scharlau microbiology продает этот реагент в стерилизованном виде, Артикул 06-011). Хотя эти растворы можно смешивать и добавлять в агаровую основу для получения компонента, известного под названием желточно-теллуритовая стерильная эмульсия (Артикул 06-026 и 064-BA1018 ИСО), они также стабильны как отдельная добавка и могут быть использованы в составе многих других питательных сред.

Хранение

Среда предназначена только для использования в лабораториях. Храните среду в банке с плотно закрытой крышкой, в темном, сухом, прохладном месте (при температуре от +4°C до 30°C и влажности Контроль качества

Температура инкубации: 35°C ± 2,0

Время инкубации: 48 часов

Инокуляция: 10-100 КОЕ (Продуктивность)/ 1.000-10.000 КОЕ (Селективность). Метод посева: спиральный (согласно стандарту ISO11133-1/2)

3.22. Методы определения Staphylococcus aureus

Средства контроля и вспомогательные устройства. Аппаратура, материа­лы, реактивы по ГОСТ 9225 со следующими дополнениями:

Питательные среды. Гидролизованное и стерильное обезжиренное молоко по ГОСТ 10444.11.

Желточную эмульсию готовят следующим образом. Свежее куриное яйцо моют водопроводной водой, затем протирают ваткой, смоченной в спирте, и обсушивают. Отделяют желток и вносят его в 100 см 3 сте­рильного раствора хлористого натрия по ГОСТ 9225. Тщательно пере­мешивают. Приготовленная эмульсия может храниться при темпера­туре 0–5 °С не более 72 ч.

Солевой бульон (допускается применение солевого бульона, который готовится согласно указанию на этикетке). Состав: натрий хлористый (NaCl) – 7,5 г; питательный сухой бульон – 1,5 г (или гидролизован­ное молоко – 100 см 3 ).

Приготовление: в 100 см 3 дистиллированной воды вносят 1,5 г сухо­го питательного бульона, кипятят 1–2 мин, фильтруют через ватный тампон, добавляют 7,5 г NaCl, устанавливают рН (6,9 ± 0,1).

Разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение(10 ± 1) мин.

Или к 100 см 3 гидролизованного молока добавляют 7,5 г NaCl, уста­навливают рН (6,9 ± 0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.

Желточно-солевой агар [1] . Состав: питательный агар [2] для культи­вирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) – 35 г или питательный агар II 8 (на основе гидролизата кормовых дрожжей) 24 г; натрий хлористый (NaCl) – 75 г; эмульсия желточная – 50,0 см 3 ; вода дистиллированная – 1 дм 3 .

Приготовление: в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 г пита­тельного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г пи­тательного агара сухого II, добавляют 75 г хлористого натрия (NaCl), кипятят до полного расплавления агара, фильтруют через ватный там­пон, разливают во флаконы или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин. После стерилизации охлаждают до температуры (45 ± 1) °С и добавляют 50 см 3 предварительно под­готовленной желточной эмульсии. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.

Молочно-солевой агар [3] . Состав: питательный агар [4] для культиви­рования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) – 35 г; или питательный агар II 10 (на основе гидролизата кормовых дрож­жей) – 24,0 г; натрий хлористый (NaCl) – 75,0 г; молоко обезжирен­ное – 100 см 3 ; вода дистиллированная – 1 дм 3 .

Приготовление: среду готовят, как указано выше, но после охлажде­ния до температуры (45 ± 1) °С добавляют вместо желточной эмульсии 100 см 3 стерильного обезжиренного молока. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.

Агар Байрд-Паркера. Среда готовится согласно указанию на этикет­ке. Состав. Основа среды: триптон – 10,0 г; дрожжевой экстракт – 1,0 г; мясной экстракт – 5,0 г; литий хлористый гексагидрат – 5,0 г; агар – 12,0–20,0 г; вода дистиллированная – 1 дм 3 .

Раствор пирувата натрия: пируват натрия – 20,0 г; вода дистилли­рованная –100 см 3 .

Раствор глицина: глицин – 20,0 г; вода дистиллированная – 100,0 см 3 .

Приготовление основы среды: в 1 дм 3 дистиллированной воды вно­сят 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара.

При отсутствии мясного экстракта, триптона и дрожжевого экстрак­та вместо дистиллированной воды применяют 1 дм 3 мясопептонного бульона или питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой или питательный агар сухой II.

Все компоненты, внесенные в 1 дм 3 дистиллированной воды (мясопептонный бульон), нагревают и перемешивают до полного рас­творения, охлаждают до температуры 50–60 °С. Устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают в колбы или бутылки по 90 см 3 и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин.

При использовании сухой среды в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганиз­мов или 24 г питательного агара сухого II, добавляют 5 г хлористого лития. Нагревают до полного растворения, охлаждают до температуры 50–60 °С, устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают и стерилизуют как указано выше.

Готовую основу среды хранят не более 30 сут при температуре (6 ± 2) °С.

Перед использованием к 90 см 3 расплавленной основы среды добав­ляют асептически стерилизованные фильтрованием через мембран­ный фильтр растворы: 6,3 см 3 раствора глицина, 5 см 3 раствора пирува­та натрия; 1 см 3 раствора теллурита калия; 5 см 3 желточной эмульсии.

Допускается растворы глицина, пирувата натрия, теллурита калия и желточную эмульсию готовить в асептических условиях на стериль­ной дистиллированной воде.

После тщательного перемешивания приготовленную среду разлива­ют в чашки Петри. Чашки со средой можно хранить не более 48 ч.

Порядок подготовки к проведению контроля. Приготовление раство­ров и реактивов . Раствор плазмы кроличьей цитратной готовится со­гласно инструкции по применению плазмы, прилагаемой к упаковке.

Растворы и реактивы для окраски препаратов готовят по ГОСТ 9225.

Приготовление реактивов для окраски по Грaму . Приготовление реак­тива 1: в 100 см 3 этилового спирта растворяют 0,5 г кристаллического фиолетового.

Приготовление реактива 2: к 96 см 3 спиртового раствора йодисто­го калия массовой концентрацией 5 г/дм 3 добавляют 2 см 3 спиртового раствора основного фуксина массовой концентрацией 50 г/дм 3 и 2 см 3 спиртового раствора йода массовой концентрацией 50 г/дм 3 .

Йодистый калий растворяют в спирте на водяной бане при темпера­туре (45 ± 5) °С при постоянном помешивании.

Отбор и подготовка проб по ГОСТ 9225.

Метод определения количества Staphylococcus aureus с предварительным обогащением

Подготовка и проведение контроля. Из навески продукта готовят ряд де­сятикратных разведений по ГОСТ 9225 так, чтобы можно было опре­делить наличие или отсутствие Staphylococcus aureus в определенной массе (объеме), указанной в нормативном документе на конкретный продукт.

Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см 3 в пробирки или колбы с солевым бульоном.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эк­вивалентным разведенной питательной средой 1:10.

Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.

Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне, к Staphylococcus aureus делают пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний или на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркера, желточно-солевой агар или молочно-солевой агар.

Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24-48 часов.

После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.

На желточно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus имеют форму плоских дисков диаметром 2–4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний об­разуется радужное кольцо и зона помутнения среды.

На молочно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus растут в виде непрозрачных круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром 2–4 мм, слегка выпуклых.

На среде Байрд-Паркера колонии Staphylococcus aureus растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром 1–1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1–3 мм.

С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных коло­ний и пересеивают на поверхность скошенного питательного агара, 1 см желточно-солевого агара, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии.

Посевы выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в те­чение 24 часов.

У выросших колоний определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика.

Из пяти изолированных, характерных для Staphylococcus aureus, колоний делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Для приготовления препарата на чистое и охлажденное после фламбирования предметное стекло наносят петлей каплю дистиллирован­ной воды, в которую вносят петлей небольшое количество агаровой культуры, не размешивая в воде. Затем вносят петлей каплю реакти­ва 1, для окраски по Граму.

Смесь распределяют на участке примерно 1 см 2 , просушивают при температуре (20 ± 2) °С, фиксируют, медленно пронося предметное стекло над пламенем горелки. На одном стекле можно готовить по шесть-восемь мазков, отделяя их один от другого линиями, проведен­ными с лицевой стороны стекла.

Препарат ополаскивают водой и тщательно просушивают фильтро­вальной бумагой.

После просушивания на препарат наносят с избытком реактив 2 для окрашивания по Граму так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность стекла. Продолжительность окрашивания 0,5–1 мин. После окрашива­ния препарат быстро ополаскивают проточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально. Препарат просушива­ют фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Микробы, красящиеся по Граму, будут темно-фиолетового цвета, не красящиеся по Граму – красного цвета.

Стафилококки окрашиваются по Граму положительно (темно-фиолетового цвета), имеют шарообразную форму и располагаются скоплениями, чаще всего напоминающими гроздья винограда.

Постановка реакции плазмокоагуляции. В пробирку с 0,5 см 3 разве­денной кроличьей плазмы вносят петлю суточной агаровой культуры. Внесенную культуру тщательно размешивают. Одну пробирку с плаз­мой оставляют незасеянной, в другую засеивают контрольный штамм Staphylococcus aureus (коагулазоположительный стафилококк).

Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температу­ре (37 ± 1) °С в течение 3–6 ч. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то оставляют эти пробирки до 24 ч. Если через 24 ч плазма не свернулась, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.

При определении коагулазной активности реакцию считают отри­цательной в тех случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки, или в тех случаях, когда в плазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на один плюс).

Реакцию считают положительной, если:

+++ – сгусток, имеющий небольшой отсек;

++ – сгусток в виде взвешенного мешочка.

Все три варианта являются положительным результатом.

При получении положительной реакции считают, что в посевах об­наружен Staphylococcus aureus.

Обработка результатов контроля. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

Оформление результатов контроля. Морфологические, культуральные свойства и положительная реакция плазмокоагуляции свидетель­ствуют о присутствии коагулазоположительных стафилококков в за­сеянной массе продукта.

Метод определения количества Staphylococcus aureus без предварительного обогащения

После термостатирования подсчитывают количество характерных колоний на каждой чашке Петри (желточно-солевой агар, молочно-солевой агар и агар Байрд-Паркера, см. предыдущий метод). С каж­дой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных и/или подо­зрительных колоний Staphylococcus aureus, а в случае роста менее пяти – все колонии, характерные для Staphylococcus aureus, и пере­севают на поверхность скошенного питательного агара, разлитого в пробирки (см. желточно-солевой агар), но без добавления хлористо­го натрия и желточной эмульсии. Пробирки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.

У выросших культур определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика как в предыдущем методе.

Обработка результатов контроля. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

Оформление результатов контроля. Количество колоний Staphylococ­cus aureus в 1 г или 1 см 3 после определения его в определенной наве­ске продукта вычисляют по формуле:

где Σn₁, Σn₂ – количество колоний, выросших на всех чашках Петри в пределах одного разведения или засеянного объема; n – число деся­тикратных разведений.

Пример. Подсчитываем количество колоний Staphylococcus aureus, выросших на трех засеянных чашках при посевах продукта или его разведений:

1 г или 1 см 3 продукта:	84	96	72
10 -1 разведение:	9	10	7

10 -1 разведение:	84	96	72
10 -2 разведение:	99	10	7

[1] Допускается использовать солевой агар, который готовится согласно ука­занию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.

[2] При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм 3 дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указа­нию на этикетке.

[3] Допускается использовать солевой агар, который готовится согласно ука­занию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.

[4] При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм 3 дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указа­нию на этикетке.

Основными источниками обсеменения стафилококками пищевых продуктов являются люди и животные с гнойно-воспалительными процессами (абсцессы, фурункулы, гнойные раны и др.), а также носители этих микроорганизмов. Перенос стафилококков от людей на пищевые продукты может происходить воздушно-капельным путем, при непосредственном контакте людей с продуктами, оборудованием, в процессе убоя скота и разделки туш.

Чаще всего причиной стафилококковых токсикозов является употребление молока, мяса и мясных изделий, кондитерских изделий с заварным кремом и др., контаминированных патогенными стафилококками. Органолептические свойства продуктов, в которых размножаются стафилококки и накапливаются энтеротоксины, не изменяются [2].

Энтеротоксигенные стафилококки размножаются в пищевых продуктах даже при содержании в них около 40% влаги. Они могут развиваться в продуктах, содержащих от 7% до 12% хлорида натрия. Сахар угнетает развитие стафилококков при концентрациях 30–40%. Некоторые микроорганизмы (В. сеreus, дрожжи из рода Саndidа и др.) оказывают на стафилококки стимулирующий эффект (они усиливают образование энтеротоксина).

Энтеротоксин стафилококков обладает высокой термоустойчивостью. Инактивирование (разрушение) токсина происходит только через 2,5–3 часа кипячения. При автоклавировании (120°С) токсин разрушается через 20 мин. При благоприятных температурных условиях энтеропатогенные стафилококки быстро размножаются в продуктах и продуцируют токсин. Пищевые токсикозы, вызванные энтеропатогенными стафилококками, протекают в форме острого гастроэнтерита, сопровождающегося рвотой, реже диареей, головной болью. Инкубационный период очень короткий – от 30 мин до 6 ч. Длится заболевание один, реже – два, три дня [1].

Выявление и определение количества этих микроорганизмов в пищевых продуктах проводят в соответствии с ГОСТ 31746-2012. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus.

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов, и устанавливает методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus посевом: в жидкую селективную среду (с предварительным обогащением) и на (в) агаризованные селективно-диагностические среды [4].

Метод определения наиболее вероятного числа (НВЧ) коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом в жидкую селективную среду предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 см
жидкого продукта менее 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) коагулазоположительных стафилококков и S. aureus.

Метод определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом на агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 или в 1 см
жидкого продукта более 150 КОЕ коагулазоположительных стафилококков и S. aureus [4].

Метод выявления и метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом с предварительным обогащением основаны на высеве навески продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus.

При пересеве на агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном выросшие типичные колонии без подтверждения по биохимическим признакам относят к коагулазоположительным стафилококкам.

Определенное количество жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции вносят в жидкую селективную питательную среду [6].

Перед посевом анаэробные условия в среде создают кипячением при (100±1) °С в течение 15 мин, наслоением агара или парафина в каждую пробирку после посева, а также с помощью альтернативной процедуры - инкубирования пробирок в емкости или инкубаторе в анаэробных условиях.

Пробирки с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч. Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков на Жиолитти-Кантони бульоне определяется по редукции теллурита калия, а на глюкозном или солевом бульоне - по помутнению среды [3].

Поверхность одной из агаризованных селективно-диагностических сред (Байрд-Паркер агара, молочно-солевого, яично-желточно-азидного, яично-желточно-солевого агара, агара с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном), инокулируют из предположительно положительных пробирок после 24 ч и все оставшееся пробирки после 48 ч.

Чашки Петри с посевами инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 ч. Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по редукции теллурита калия и яично-желточной реакции (лецитиназной активности) [7].

На агаре с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном после инкубирования присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по типичным колониям, показавшим специфичную реакцию (бычий фибриноген/кроличья плазма).

Подтверждение принадлежности типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам проводят по изучению отношения выявленных микроорганизмов к окраске по Граму, определению присутствия у них каталазы и коагулазы.

Подтверждение принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S. aureus проводят по определению образования ацетоина, определению ферментации в аэробных условиях мальтозы и, при необходимости, определению термостабильной нуклеазы и гемолитической активности. Результаты выявления коагулазоположительных стафилококков и S. aureus выражают: "обнаружены" или "не обнаружены"[5].

Метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus. Навески продукта и (или) серию разведений навески продукта вносят в жидкую селективную питательную среду. Наиболее вероятное число коагулазоположительных стафилококков и S. aureus в 1 см или в 1 г продукта определяют для подтвержденных посевов, пользуясь НВЧ-таблицей по ГОСТ 26670.

Методы определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом на (в) агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве навески продукта и/или разведения навески продукта на (в) агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете типичных и (или) атипичных колоний, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus [4].

Проводят посев определенного количества жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции на (в) агаризованную селективно-диагностическую питательную среду на две параллельные чашки Петри. Аналогично проводят посев десятикратных разведений испытуемого продукта. Посевы в чашках Петри инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч.

Количество коагулазоположительных стафилококков в 1 см
или 1 г продукта определяют по числу типичных и/или атипичных колоний, выросших на чашках Петри, принадлежность которых к коагулазоположительным стафилококкам подтверждена путем определения отношения микроорганизмов из этих колоний к окраске по Граму, наличия у них каталазы и коагулазы [3,4].

При посеве в (на) агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном определяют только типичные колонии и без подтверждения по биохимическим признакам их относят к коагулазоположительным стафилококкам.

Количество S. aureus в 1 см
или 1 г продукта определяют исходя из количества коагулазоположительных стафилококков, принадлежность которых к S. aureus подтверждена по образованию ацетоина, определению ферментации в аэробных условиях мальтозы и, при необходимости, определению термостабильной нуклеазы и гемолитической активности.

При выявлении коагулазоположительных стафилококков в определенной навеске исследуемого продукта или его эквивалентном разведении с предварительным обогащением эту навеску или разведение вносят в одну из питательных сред [6,7].

Перед использованием Жиолитти-Кантони бульон прогревают кипячением при (100±1) °С в течение 15 мин для удаления воздуха. Охлаждают до 44 °С - 47 °С и с соблюдением правил асептики прибавляют раствор теллурита калия.

В 10 см модифицированного Жиолитти-Кантони бульона нормальной концентрации или сред вносят 1 см
жидкого продукта или 1 см исходной суспензии (т.е. 0,1 г или 0,1 см продукта). После посева навески продукта и (или) его разведений на поверхность Жиолитти-Кантони бульона осторожно наслаивают слой стерильного голодного агара или слой стерильного парафина и охлажденных до температуры 44 °С - 47 °С, дают полученному слою агара или парафина застыть и герметично закрывают.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой нормальной концентрации 1:10. При использовании среды двойной концентрации соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой 1:1 [3].

Если при последующем подтверждении принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S. aureus не определяют наличие термостабильной нуклеазы и гемолитической активности, то допускается проводить посев в Жиолитти-Кантони бульон без прогрева перед посевом и без наслаивания голодного агара или парафина после посева.

Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч. Если появилось почернение или черный осадок в Жиолитти-Кантони бульоне или помутнение в солевом или сахарном бульоне, то проводят подтверждение принадлежности выросших микроорганизмов к коагулазоположительным стафилококкам. Если почернения, черного осадка или помутнения нет, то посевы инкубируют еще (24±2) ч [2].

Для получения изолированных колоний стерильной петлей делают пересевы культур из каждого посева на поверхность чашки Петри с одной из агаризованных селективно-диагностических сред: Байрд-Паркер агара, Байрд-Паркер агара с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном, молочно-солевого агара, яично-желточно-азидного агара или яично-желточно-солевого агара. Пересевы проводят также из пробирок, в которых нет видимых признаков роста.

Чашки Петри с пересевами инкубируют в термостате при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч или (48±2) ч. После 24 ч инкубирования чашек Петри по отмечают на дне чашек присутствие типичных и атипичных для коагулазоположительных стафилококков колоний [1].

На Байрд-Паркер агаре после инкубирования в течение 24 ч коагулазоположительные стафилококки образуют типичные колонии черного или серого цвета, блестящие и выпуклые, окруженные прозрачной зоной, диаметр колоний около 1,0-1,5 мм и до 1,5-2,5 мм после инкубирования в течение 48 ч. После инкубирования в течение 24 ч непосредственно около колонии в прозрачной зоне может появиться опалесцирующее кольцо, окружающее колонию.

Принадлежность выявленных коагулазоположительных стафилококков к S. aureus проводят по определению их способности образовывать ацетоин и ферментировать мальтозу в аэробных условиях [5].

Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера). Культуру высевают в пробирки со средой Кларка. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 48 ч. После инкубирования посевов к 1 см
отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см
раствора - нафтола и 0,2 см
раствора гидроокиси калия. Появление розового окрашивания через 15-60 мин указывает на положительную реакцию. S. aureus образует ацетоин.

Определение ферментации мальтозы в аэробных условиях. Способность ферментации мальтозы в аэробных условиях определяют с целью дифференциации S. aureus от других коагулазоположительных видов S. intermedius и S. hyicus. Для определения ферментации мальтозы в аэробных условиях культуры, подлежащие исследованию, высевают уколом петлей в среду Гисса с мальтозой. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 48 ч. При ферментации мальтозы в аэробных условиях с образованием кислоты цвет среды Гисса изменяется. S. aureus ферментирует мальтозу в аэробных условиях [4].

Оценка результатов подтверждения принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S. aureus. Если коагулазоположительные стафилококки образуют ацетоин и сбраживают мальтозу в аэробных условиях, то считают, что выявленные коагулазоположительные стафилококки относятся к S. aureus. Для биохимической идентификации допускается использование тест-систем промышленного производства, зарегистрированных на территории государства, принявшего стандарт.

Оценка результатов посевов в жидкие среды. При определении НВЧ коагулазоположительных стафилококков или S. aureus или при их выявлении в определенной навеске продукта посевы считают положительными (то есть коагулазоположительные стафилококки или S. aureus выявлены в испытуемой навеске продукта), если при последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и подтверждении типичных и (или) атипичных колоний, выросших на этих средах, хотя бы в одной колонии будут обнаружены коагулазоположительные стафилококки или S. aureus [6].

Результаты выявления коагулазоположительных стафилококков или S. aureus записывают: обнаружены (не обнаружены) в 1 г (см3) продукта; масса или объем продукта, в котором выявляли коагулазоположительные стафилококки или S. aureus.