Стафилококк на хью лейфсона
S. aureus вызывает (рис. 14):
1. Местные гнойно-воспалительные процессы кожи и подкожной клетчатки (пиодермии, фурункулы, карбункулы, абсцессы, флегмоны, маститы, травматические и послеоперационные нагноения ран).
2. Системные заболевания внутренних органов (бронхиты, пневмонии, ангины, фарингиты, отиты, синуситы, циститы, холециститы, менингиты, эндометриты).
3. Пищевые токсикоинфекции (отравления).
4. Септицемию и септикопиемию.
S.epidermidis занимает менее важную роль в патологии, но может быть причиной гнойно-воспалительных процессов у лиц пожилого возраста, конъюнктивитов новорожденных, послеоперационных эндокардитов.
S.saprophyticus – сапрофит, но при ослаблении иммунитета может вызывать воспалительные процессы, послеоперационные нагноения ран. У этого вида стафилококка есть олигосахаридные рецепторы, способствующие прикреплению его к эпителию мочевыводящих путей.
В развитии стафилококковой инфекции большую роль играют инвазионные и токсигенные свойства микроорганизмов, состояние иммунной системы макроорганизма (иммунодефициты). Возбудитель проникает через поврежденную кожу и слизистые оболочки. В стационаре этому способствуют различные оперативные вмешательства, катеризация кровеносных сосудов, использование протезов сосудов, использование искусственных клапанов, использование различной диагностической аппаратуры.
Предрасполагающими факторами для развития эндогенной инфекции являются болезни, угнетающие иммунитет, диабет, почечная и печеночная недостаточность, прием иммунодепрессантов, цитостатических препаратов.
Иммунитет. Здоровые взрослые люди устойчивы к стафилококкам, что объясняется защитными механизмами и наличием специфических АТ. В иммунитете имеют значение все виды антител: антимикробные, антитоксические, антиферментные, степень их защиты определяется и титром АТ, и местом их действия. Антимикробные АТ на пептидогликан, протеин А способствуют фагоцитозу, препятствуют связыванию опсонинов, антитоксины нейтрализуют a-токсин, антиферментные АТ – соответствующие ферменты; большую роль играют секреторные IgА, обеспечивающие местный иммунитет слизистых оболочек; АТ к тейхоевым кислотам определяются при остеомиелитах, сепсисе, эндокардитах.
Материал для исследования – гной, кровь, мокрота, моча.
1. Бактериоскопический метод имеет ориентировочное значение. Выявляют грамположительные кокки, расположенные в виде гроздей, что позволяет выбрать необходимые питательные среды.
2. Бактериологический метод – выделение чистой культуры и ее идентификация. Материал засевают на МЖСА, ЖСА и кровяной агар. Проводят учет лецитиназы, пигмента, гемолиза. В колониях бактерий, выросших на МЖСА выявляют каталазу, что позволяет отдифференцировать семейство Staphylococcaceae от семейства Streptococcaeae; так у стафилококков каталаза имеется, а у стрептококков отсутствует.
Устанавливают принадлежность бактерий к роду Staphylococcus. Стафилококки образуют пигмент, обладают лецитиназой, гемолитической, каталазной активностью, являются факультативными анаэробами, а микрококки – облигатные аэробы. Поэтому стафилококки способны расти и ферментировать глюкозу в анаэробных условиях (отмечается посинение в столбике среды под слоем вазелинового масла.
Установив принадлежность к роду Staphyloccocus, проводят видовую идентификацию стафилококков. Ведущий тест патогенности S.aureus – продукция плазмокоагулазы. Проводят посев культуры в цитратную плазму крови кролика. Отмечается коагуляция плазмы через 2-18 часов. Далее определяют анаэробную ферментацию маннита. При положительной реакции плазмокоагуляции, наличии лецитаназной, гемолитической активности, золотистого пигмента штамм может быть отнесен к виду S.aureus.
При отрицательной реакции плазмокоагуляции ставят дополнительные тесты на наличие ДНКазы, чувствительность к новобиоцину, определяют фосфатазу.
Для S.epidermidis характерны следующие тесты: чувствительность к новобиоцину, наличие фосфатазы, отсутствие окисления маннита; для S.saprophyticus – противоположные свойства.
Далее проводят определение чувствительности к антибиотикам. При необходимости по эпидпоказаниям осуществляют фаготипирование.
Заключение об этиологической роли стафилококков делают на основании многократного обильного выделения однотипных по свойствам и фаготипу стафилококков.
С целью эпидемиологического типирования изучают плазмидный профиль S.aureus: большие 2•10 7 Да плазмиды кодируют образование бета-лактамаз и резистентность к эритромицину. Мелкие (3•10 6 Да) плазмиды кодируют резистентность к тетрациклинам и хлорамфениколу.
Выделенная культура считается возбудителем инфекционного процесса при наличии следующих критериев: если из закрытых очагов, выделен один вид микроорганизма в количестве 10 3 и более; при открытых процессах этиологически значимыми считают культуры, численность которых более 10 5 . Лабораторный анализ непременно включает определение чувствительности выделенных бактерий к антибиотикам.
Серологические методы. Для оценки состояния антитоксического иммунитета у больных определяют уровень антитоксических антител по лизису эритроцитов крови альфа-токсином. Антитела к тейхоевым кислотам стафилококков определяют методом ИФА.
Иммунитет зависит от уровня антитоксических и антимикробных антител. Новорожденные защищены материнскими IgG-антителами, полученными через плаценту.
Профилактика и лечение.
Профилактика стафилококковых инфекций направлена на выявление носителей золотистых стафилококков, главным образом, среди персонала больниц и родовспомогательных учреждений с целью их санации. Иногда для профилактики стафилококковой инфекции вакцинируют беременных в конце беременности очищенным стафилококковым анатоксином (повышается уровень IgG-антител у новорожденных).
Для лечения острых стафилококковых заболеваний назначают антибиотики под контролем антибиотикограммы.
При септических процессах вводят донорские противостафилококковый иммуноглобулин или антистафилококковую плазму.
Для лечения хронических стафилококковых инфекций применяют стафилококковый анатоксин, а также аутовакцину, которые стимулируют синтез антитоксических и антимикробных антител.
В травматологии и дерматологии используют стафилопротеин – это комплексный препарат, включающий очищенный анатоксин и цитоплазменный антиген стафилококка.
Псевдомонады
Аэробные неферментирующие грамотрицательные палочки и коккобациллы – неспорообразующие бактерии, нетребовательные к условиям культивирования, разлагают углеводы неферментативным путем, не утилизируют их в качестве источника энергии, что устанавливают в тесте Хью-Лейфсона.
Род Pseudomonas относится к семейству Pseudomonadaceae и содержит более 20 видов. Для человека патогенна P. aeruginosa, реже патологические процессы вызывают P. putida, P. fluorescens.
Для P. aeruginosa характерны следующие признаки: грамотрицательная палочка, средних размеров, прямая или слегка изогнутая, подвижная (жгутики расположены по полюсам – амфитрихи), не имеет спор. Растет на простых средах, селективной средой является ЦПХ-агар. Вырабатывает феназиновый водорастворимый сине-зеленый пигмент с характерным запахом жасмина, в кислой среде пигмент красный. Пигмент дает флюоресценцию в ультрафиолетовых лучах. Вокруг колоний тонким слоем располагается внеклеточная слизь.
Синегнойная палочка является строгим аэробом, имеет окислительный тип метаболизма, обладает соответствующим набором ферментов (цитохромоксидазы), каталазный тест положительный, не образует индола и сероводорода, разжижает желатин, гидролизует казеин, восстанавливает нитраты, проба на оксидазу положительная. Содержание Г+Ц в ДНК составляет 67 моль%.
Другие патогенные для человека виды псевдомонад отличаются от синегнойной палочки по следующим биохимическим свойствам: флюоресценции в ультрафиолетовом свете, наличию аргининдегидролазы, желатиназы, амилазы, лизиндекарбоксилазы, росту при 42°С, образованию сероводорода и индола.
Распространение. Бактерии рода Pseudomonas широко распространены в природе: их обнаруживают в почве, воздухе. На коже у человека они локализованы в местах богатых потовыми и сальными железами.
Синегнойная палочка – условно-патогенный микроб. Заболевания возникают на фоне иммунодефицита. Способствует развитию инфекции высокая устойчивость возбудителя во внешней среде. В водопроводной воде она сохраняет жизнеспособность до 2,5 месяцев, в инфицированной пыли выживает до 3-х суток, на поверхности инфицированных рук в течение одного часа, в дистиллированной воде – до одного года. Чувствительны к 3% раствору Н2О2, 0,1% раствору сульфохлоратина, 2% раствору фенола.
Синегнойная палочка – типичный сапроноз, т.е. она накапливается в субстратах внешней среды, где создается резервуар инфекции, обусловловливающий эпидемиологическую опасность.
В стационарах часто циркулируют штаммы синегнойной палочки с повышенной вирулентностью, множественной лекарственной устойчивостью к антибиотикам и антисептикам, широким спектром антагонистического действия.
Возникновению внутрибольничной инфекции способствуют: неправильное проведение стерилизации, дезинфекции инструментов и аппаратуры, применение инфицированных лекарственных средств (глазные капли, мази), использование неэффективных дезинфицирующих средств (фурациллин, диоксидин), в которых синегнойная палочка может размножаться.
Подтверждение стафилококковой этиологии гнойно-воспалительного заболевания (ГВЗ) проводится не только с диагностической целью, но и для определения чувствительности выделенного штамма к средству этиотропной терапии с последующей ее коррекцией.
При внутрибольничном распространении стафилококка его выделение, идентификация и определение чувствительности к антибактериальным препаратам является необходимым для решения эпидемиологических проблем.
Материалом для исследования служат кровь, гной из абсцессов, гнойное и серозное отделяемое воспалительных очагов, ран, жидкость из серозных полостей, мокрота, моча, слизь из зева и носа, при подозрении на пищевое отравление — пищевые продукты, рвотные массы, промывные воды желудка, а также смывы с рук персонала и предметов окружающей среды.
Первый день исследования. Кровь (около 0,5 мл) берут из вены стерильно. Засевают в специальные жидкие или двухфазные среды для гемокультур. При посеве крови соблюдение правил асептики обязательно не только с целью защиты пациента, но и для предотвращения контаминации питательной среды стафилококком извне.
После инкубации в термостате при 37°С в течение суток из флакона с жидкой средой производится высев в чашки Петри с агаровыми средами, применяющимися для прямого посева материала, исследуемого на стафилококк с последующей идентификацией выделенной культуры.
Смывы с рук персонала, предметов внешней среды, обычно слабо обсемененные стафилококком, засевают для подращивания на тиогликолевый бульон или мясопептонный бульон с 7,5% хлоридом натрия (среда обогащения). Посевы инкубируют в термостате одни сутки, после чего производят высев на специальные плотные питательные среды для выделения стафилококка с последующей идентификацией.
Материал из локальных очагов предварительно микросконируют (кроме слизи из зева, смывов, фекалий) в препаратах-мазках, окрашенных по Граму. Преобладание в препаратах стафилококка среди сопутствующей микрофлоры позволяет предположить, что он является главным этиологическим агентом воспалительного процесса.
Для выделения стафилококка в чистой культуре и изучения его свойств материал высевают в чашки Петри с агаровыми средами, позволяющими получить представление о ряде биологических признаков выделяемой культуры и одновременно подавить рост сопутствующей флоры. К числу таких дифференциально-диагностических сред относится желточно-солевой агар (ЖСА) и молочно-желточно-солевой агар (МЖСА).
В этих средах благодаря наличию желтка, выявляется фермент лецитиназа (лецитинвителлаза); хлорид натрия в повышенной концентрации (7,5%) подавляет рост части сопутствующей флоры, что облегчает выделение чистой культуры. Молоко (10%) способствует лучшему выявлению пигмента колоний стафилококка. При невозможности использовать желточные среды производят посев только на 5% кровяной агар (КА). Последний можно применять наряду с желточной средой (см. 32.2.2.1).
Второй день исследования. Изучают посевы на агаровых средах в чашках Петри. Отмечают цвет выросших колоний (золотисто-желтый, палевый, кремовый, белый). Учитывают ореолы вокруг колоний, свидетельствующие о разложении желтка ферментом лецитиназой. Отмечают наличие или отсутствие зон гемолиза вокруг колоний на КА. Отобранные колонии (иногда разные варианты в одном и том же посеве) отсевают в пробирки со скошенным мясопептонным агаром (МПА) для получения чистых культур; помещают в термостат на одни сутки. В случае применения обогащения на жидкой среде в этот день делают высев в чашки с агаровыми средами.
Третий день исследования. Изучают выросшие на МПА культуры. Готовят препараты-мазки, окрашенные по Граму. Если при микроскопии выявлена чистая культура грамположительных кокков с характерным для стафилококка расположением клеток, ее изучают на предмет идентификации.
Для подтверждения принадлежности культуры к роду Staphylococcus ставят реакцию на каталазу на стекле. При положительной реакции, проявляющейся через несколько минут, культуру отсевают на среду Хью-Лейфсона с глюкозой для выявления ферментации в анаэробных условиях. Учет результатов проводят в течение 1-4 сут. инкубации в термостате. Для получения более быстрого результата, позволяющего ориентировочно отличить культуру стафилококка от каталазоположительных микрококков, отсевают культуру на КА (если этого не было сделано при первичном посеве материала). Микрококки никогда не образуют зон гемолиза в отличие от большинства штаммов стафилококка, особенно S. aureus.
Ставят реакцию плазмокоагуляции и производят ее учет через 1; 2 и 4 ч. Если первичный посев материала был сделан только на КА, пересевают культуру на среду для выявления лецитиназы.
Четвертый день исследования. При отсутствии плазмокоагулазы, но при наличии пигмента и/или лецитиназы для идентификации S.aureus необходимо поставить минимум два теста: на ДНКазу и ферментацию маннита в анаэробных условиях путем посева на среду Хью-Лейфсона с маннитом.
Положительный результат обеих проб или хотя бы одной из них позволяют отнести выделенный штамм к коагулазоотрицательному S. aureus.
Коагулазоположительные культуры кокков, не обладающие ни золотисто-желтым пигментом, ни лецитиназой, ДНКазой и анаэробной ферментацией маннита, к виду S. aureus не относятся.
Культура стафилококка, не являющаяся видом S. aureus, но нередко формирующая белые колонии, может относиться к видам S. epidermidis и S. saprophyticus. Эти представители нормальной флоры кожи и слизистых человека могут иногда вызвать гнойно-септические заболевания у ослабленных лиц, быть агентами внутрибольничной инфекции.
Для их идентификации необходимо поставить три дополнительных теста: на устойчивость к антибиотику новобиоцину дисковым методом, тесты на щелочную фосфатазу и на окисление маннита (путем посева на среду с маннитом и индикатором) в обычных условиях.
Свойства S. epidermidis и S. saprophyticus перечислены в таблице ниже.
Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 11.11.2019
Комплекты для приготовления 360 мл среды
Комплект для приготовления 300 мл среды, чашки Петри 40,90,100 мм
Комплект для приготовления 200 мл среды
Все образцы биосубстратов, взятые для посева, должны быть незамедлительно переданы в микробиологическую лабораторию для анализа. Однако, подобная практика не всегда реализуется. Одним из приемов, содействующих сохранению микрофлоры, причем, не только при отсрочке посева, но и сразу же при взятии биоматериала, является применение транспортных питательных сред (ТПС).
ТПС предупреждают гибель микробных клеток, сохраняют их жизнеспособность, а, следовательно, и способность к репликации после посева, но при этом препятствуют размножению. Для этого в рецептуру ТПС введены в том или ином сочетании вещества, обеспечивающие механическую защиту клеток, оптимальные показатели рН, редокс-потенциала, осмотические свойства сред. Некоторые ТПС создают анаэробные условия вегетации культур. Существуют ТПС с селективными свойствами.
ТПС могут использоваться как для сохранения микрофлоры биосубстратов, так и отдельных групп микроорганизмов. Среди последних особо выделяют кампилобактеры, шигеллы, бордетеллы, сальмонеллы, иерсинии, коринебактерии, облигатно-анаэробные бактерии, среди биосубстратов - мазки из цервикального канала, наружного уха, слизистой носа, конъюнктивы, гортани, биоптаты обсемененных тканей и костного мозга.
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГРИБОВ
Бульон Сабуро. Для культивирования грибов , в т . ч . дерматофитов .
Агар Сабуро. Для культивирования грибов , в т . ч . дерматофитов .
Флаконы , чашки Петри
Агар Сабуро с 3% и 5% хлорида натрия и селек ционирующей добавкой. Селективная среда для выделения грибов при смешанной микрофлоре.
Комплекты для приготовления 200 мл среды
Агар Сабуро с мальтозой д ля культивирования и хранения грибов , утилизирующих данный углевод.
Агар Сабуро в модификации Эммонса. Для культивирования Sporothrix spp ., Trichophyton spp .
Сред ы Чапека. Жидкая и плотная д ля культивирования сапрофитных грибов , в т . ч . Aspergillus и Penicillium .
Агар Чапека с пептоном для широкого круга грибов .
Агар Чапека с дрожжевым экстрактом для культивирования Aspergillus niger
Агар Чапека с 17% сахарозы для культиви рования Aspergillus spp .
Среда Чапека - Докса жидкая. Для широкого круга грибов , утилизирующих нитраты.
Сусло - агар для культивирования грибов с содержанием агара 0,5, 1,2, 2%
Флаконы , чашки Петри
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
Лактобактерии (Lactobacillus spp.) принадлежат к группе неспорообразующих грамположительных палочек. Они являются представителями резидентной микрофлоры человека, в первую очередь полости рта, кишечника и влагалища. Изменение количественного и качественного состава лактобактерий является диагностическим признаком дисбактериоза. В редких случаях лактобактерий могут явиться возбудителями инфекционной патологии, чаще у новорожденных: сепсис, эндокардит, менингит, пневмония и некоторые другие. Большое значение эти микроорганизмы имеют для пищевой промышленности, поскольку занимают ключевую позицию в производстве молочнокислых продуктов (простокваша, кефир, йогурт, ацидофилин). Таким образом, перед микробиологами стоят непростые задачи выделения, идентификации, культивирования и хранения Lactobacillus spp. Микроорганизм полиморфен (палочки, коккобациллы), разнообразен по типу дыхания (факультативный анаэроб, микроаэрофил, облигатный анаэроб). Он обладает немногочисленными культуральными признаками, позволяющими отличать его от морфологически сходных бактерий (образование молочной кислоты, отсутствие каталазы, устойчивость к ванкомицину и некоторые другие.). Важное место в выделении лактобактерий занимают питательные среды, обеспечивающие рост и , в определенной степени, селекцию этих микроорганизмов. В мировой микробиологической практике их насчитывают несколько десятков. Наибольшее признание получила среда de Man, Rogosa, Sharpe, которую по первым буквам фамилий авторов обычно обозначают как среда MRS (MPC в русской транскрипции). Существует ряд модификаций этой среды, улучшающих, по мнению разработчиков, их ростовые свойства и селективность. В России получила распространение среда МРС-4, которая заметно отличается от авторской по своей рецептуре, но признана достаточно эффективной. Среда МРС-2 (полужидкая) является одной из лучших при работе с чистой культурой и для хранения культур. Лактобациллы дают в столбике среды типичный рост.
Среда МРС авторская плотная. Среда de Man , Rogosa , Sharpe ( MRS ) плотная для культивирования молочнокислых бактерий.
Среда МРС авторская жидкая. Среда de Man , Rogosa , Sharpe ( MRS ) плотная для культивирования молочнокислых бактерий.
Среда МРС модифицированная плотная. Включен Твин 80, рН 6,2. Для выделения и культивирования Lacto - bacillus spp .
Среда МРС модифицированная жидкая . Включен Твин 80, рН 6,2. Для выделения и культивирования Lacto - bacillus spp .
Среда МРС жидкая ( вариант LHSB ), рН 4,3. Для выделения лактобактерий из продуктов питания.
Среда МРС плотная ( вариант LHSB ), рН 5,5. Для выделения лактобактерий из продуктов питания.
Среда Элликера плотная и жидкая для молочнокисло го стрептококка.
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ЛИСТЕРИЙ (ПО ГОСТ Р 51921-2ОО2 Г.)
Триптон - соевый бульон. *
Флаконы по 200 и 400 мл
Триптон - соевый агар. *
Флаконы по 200 и 400 мл
Триптиказо - соевый бульон. *
Флаконы по 200 и 400 мл
Триптиказо - соевый агар. *
Флаконы по 200 и 400 мл
СЕЛЕКТИВНЫЕ СРЕДЫ ОБОГАЩЕНИЯ ДЛЯ ЛИСТЕРИЙ
Питательныe бульон ы ПБЛ -1 и ПБЛ -2.
Селективная добавка к ПБЛ -1 и ПБЛ -2.
Флаконы по 225 мл
Селективн ые добавк и к бульону Фразера " полуконцентрированному " и " концентрированному ".
СРЕДЫ СЕЛЕКТИВНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ДЛЯ ЛИСТЕРИЙ
Селективная добавка к агару ПАЛ .
Набор на 1 л среды
Селективная добавка к Оксфордскому ага ру с циклогексимидом.
На 500 мл среды
Селективная добавка к Оксфордскому агару без циклогексимида.
Набор на 1 л среды
Селективная добавка к ПАЛКАМ - агару.
Набор на 1 л среды
Полужидкая среда для определения по движности листерий.
На 5 определений
На 5 определений
СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕМОКУЛЬТУР
