Золотистый стафилококк на чашке петри
Глава 14. Стафилококки
Впервые стафилококки были обнаружены Л. Пастером в 1897 г. Подробно они были изучены А. Огстоном (1882) и Ф. Розенбахом (1884).
Морфология. Стафилококки (от греч. staphyle - виноградная гроздь) имеют вид круглых шаров диаметром 0,5-1,5 мкм. Размножаясь, образуют скопления в виде грозди винограда. Такая форма является результатом деления микробов в различных плоскостях. Однако в гное встречаются единичные и парные кокки. Стафилококки неподвижны, не имеют спор, при специальных условиях культивирования образуют микрокапсулу, грамположительны.
Культивирование. Стафилококки - факультативные анаэробы, однако лучше растут в присутствии кислорода. Растут и размножаются на обычных питательных средах, хорошо растут на средах с кровью, оптимальные условия - температура 37° С, рН 7,2-7,4.
Элективными средами являются желточно-солевой агар и солевой агар. На МПА колонии стафилококка выпуклые, круглые, непрозрачные, блестящие, размером 2-4 мм с ровными краями. При росте стафилококки образуют пигмент: золотистый, лимонно-желтый или белый. Лучше всего пигмент образуется на молочной среде при комнатной температуре и рассеянном свете. Стафилококковый пигмент не растворяется в воде, растворяется в ацетоне, эфире, спирте и т. д. При росте некоторых штаммов стафилококка на агаре с кровью вокруг колонии образуется зона гемолиза. Рост на бульоне характеризуется равномерным помутнением и осадком на дне.
Ферментативные свойства. Стафилококки вырабатывают сахаролитические и протеолитические ферменты. Сахаролитические ферменты расщепляют ряд сахаров: лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, глицерин и другие с образованием кислоты.
Протеолитические свойства стафилококка выражаются в способности растворять казеин, разжижать желатин (медленно), расщеплять другие белковые субстраты.
Стафилококки продуцируют ферменты патогенности: 1) коагулазу (сворачивает плазму крови); 2) гиалуронидазу (фактор распространения); 3) лецитиназу (растворяет лецитин оболочки клеток); 4) фибринолизин (лизирует фибрин); 5) ДНКазу (деполимеризует ДНК); 6) фосфатазу и др.
Наличие плазмокоагулазы позволяет дифференцировать золотистый стафилококк от стафилококков других видов. Многие стафилококки вырабатывают пенициллиназу, разрушающую пенициллин.
Токсинообразование. Стафилококки вырабатывают экзотоксины. К их числу относятся гемолизины четырех типов, из которых наибольшее значение имеет α-токсин. Он обладает следующими свойствами: гемолитическим - вызывает гемолиз эритроцитов, дермонекротическим - при внутрикожном введении вызывает некроз, летальным - при внутривенном введении приводит к гибели чувствительных к нему животных.
Кроме гемолизинов стафилококки образуют лейкоцидин, убивающий лейкоциты, энтеротоксины шести типов, вызывающие пищевые отравления, эксфолиатины двух типов, приводящие к отслаиванию эпидермиса у новорожденных детей.
Антигенная структура. Стафилококки имеют протеиновый антиген А, общий для всех золотистых стафилококков, и полисахаридные антигены: А, Б, С.
Стафилококки выделяют бактериоцины (стафилоцины), которые обладают антагонистическим действием по отношению к микроорганизмам данного рода.
Среди золотистых (реже эпидермальных) стафилокков различают около 40 фаговаров. Определение чувствительности выделенных из различных объектов стафилококковых культур к типовым фагам имеет важное эпидемиологическое значение (при установлении источника и путей передачи возбудителя).
Классификация. В настоящее время стафилококки, выделенные от человека, делят на 3 вида (табл. 23): S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus.
Таблица 23. Дифференциация видов стафилококков, выделенных от человека
Примечание. + наличие ферментации, устойчивости, - отсутствие ферментации, устойчивости.
Устойчивость к факторам окружающей среды. Стафилококки довольно устойчивы, поэтому они обнаруживаются в воздухе, почве, воде, на предметах обихода. При температуре 100° С они погибают моментально, при температуре 70° С - через 10-15 мин. Они хорошо переносят низкие температуры. При замораживании сохраняют жизнеспособность в течение нескольких лет. Хорошо переносят высушивание. Прямой солнечный свет убивает их только через несколько часов. Обычные растворы дезинфицирующих веществ (например, сулема в разведении 1:1000) убивают их через 15-20 мин. При обезвреживании выделений, содержащих гной, белок, мокроту, не следует применять фенол. Это дезинфицирующее вещество вызывает коагуляцию белков, что предохраняет микроорганизмы от гибели. Стафилококки чувствительны к бриллиантовому зеленому.
Восприимчивость животных. К стафилококку чувствительны крупный и мелкий рогатый скот, лошади, свиньи, куры. Из экспериментальных животных - кролики, белые мыши и котята.
Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель.
Пути передачи. Контактно-бытовой, воздушно-капельный, воздушно-пылевой, пищевой.
Заболевания у человека. Пиодермия, фурункулы, карбункулы, панариции, абсцессы; воспалительные процессы различных органов и тканей; ангины, циститы, остеомиелиты, холециститы, маститы; сепсис и септикопиемия; пищевые токсикоинфекции и многие другие. Описано около 120 нозологических форм стафилококковой этиологии.
Патогенез. Стафилококки проникают через кожу и слизистые оболочки.
Преимущественное значение при стафилококковых заболеваниях имеет золотистый стафилококк (S. aureus). Менее выражена роль в патологии человека S. epidermidis и S. saprophyticus. Патогенез обусловливается свойствами возбудителя - ферментами, экзотоксинами, веществами бактериальной клетки и состоянием иммунной системы макроорганизма.
Чаще поражается кожа и подкожная клетчатка - возникают пиодермиты, фурункулы, панариции. Нередко стафилококки обусловливают вторичные заболевания, например пневмонию при гриппе. Они также вызывают раневые инфекции. Особенно велика роль стафилококков в акушерской практике, так как новорожденные очень чувствительны к ним. В течении стафилококковых заболеваний имеет значение развитие аллергии, поэтому заболевание характеризуется рецидивами.
Особое место среди стафилококковых заболеваний занимают пищевые интоксикации. Клинически они протекают как токсикозы, сопровождаются рвотой, поносом, головной болью и другими явлениями.
Иммунитет. У человека имеется естественная резистентность, связанная с механическими факторами, фагоцитозом и наличием антител. Воспалительный процесс, возникающий в месте внедрения возбудителя, обусловливает задержку стафилококков и затрудняет их распространение по организму. В образовавшемся очаге стафилококки подвергаются фагоцитозу.
Образующийся в процессе заболевания антитоксин является важным фактором в общем комплексе иммунитета. Однако приобретенный иммунитет нестойкий, поэтому наблюдаются рецидивы.
Профилактика. Сводится к улучшению санитарно-гигиенических условий, активному выявлению больных и бактерионосителей, правильному режиму работы больничных учреждений.
Специфическая профилактика. Стафилококковый анатоксин и антистафилококковый иммуноглобулин.
Лечение. Антибактериальные препараты, поливалентный стафилококковый бактериофаг, антистафилококковая плазма и иммуноглобулин. В некоторых случаях при хроническом течении стафилококковых инфекций применяют аутовакцину.
1. По какому признаку кокки объединены в одну группу?
2. Какие ферменты и факторы патогенности продуцируют стафилококки?
3. Какие заболевания вызывают стафилококки?
4. Какие виды стафилококков Вы знаете?
Цель исследования: выделение и идентификация стафилококков.
1. Гной (фурункулы, карбункулы, абсцессы).
2. Слизь из зева (ангина).
3. Мокрота (пневмония).
4. Моча (пиелиты и циститы).
5. Дуоденальное содержимое (холецистит).
6. Кровь (подозрение на сепсис).
7. Рвотные массы, промывные воды желудка, пищевые продукты (пищевые отравления).
8. Слизь из носа (обследование на бактерионосительство).
Способы сбора материала
Первый день исследования
Все посевы ставят в термостат на сутки.
Обнаружение стафилококков при микроскопии гноя из закрытого абсцесса и осадка мочи, взятой катетером, позволяет дать предварительный положительный ответ: обнаружен стафилококк.
Посевы на плотных и жидких питательных средах вынимают из термостата и изучают. Подозрительные в отношении стафилококка колонии, выросшие на желточно-солевом агаре, отсевают на скошенный агар для получения и дальнейшего изучения чистой культуры. При этом учитывают наличие лецитиназы, которое проявляется в образовании радужного венчика вокруг колонии. Чашки с оставшимися колониями оставляют на 2-3 дня при комнатной температуре для выявления пигмента. Просматривают посевы на чашках с агаром, содержащим кровь. Колонии с четкой зоной гемолиза (просветление) вокруг них выделяют на скошенный агар. Посев крови в сахарном бульоне инкубируют 10 сут, производя через 2-3 дня высевы на агар с кровью и желточно-солевую среду.
При отсутствии роста на плотных питательных средах делают высев из бульона с глюкозой на агар с кровью. Посевы ставят в термостат на сутки.
Вынимают посевы из термостата. Из выделенных на скошенный агар культур делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии грамположительных стафилококков проводят дальнейшее изучение выделенной культуры:
а) ставят реакцию плазмокоагуляции;
б) изучают гемолитические свойства;
в) определяют продукцию ДНКазы;
г) определяют ферментацию маннита в анаэробных условиях;
д) определяют устойчивость к новобиоцину.
Реакция плазмокоагуляции. Цитратную плазму, полученную из крови кролика, разводят изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:4 и наливают в две преципитационные пробирки по 0,3-0,5 мл. В одну пробирку вносят петлю исследуемой культуры, другая пробирка служит контролем. Обе пробирки ставят в термостат при температуре 37° С. Учет реакции производят через 2-3 ч. При отсутствии свертывания плазмы посевы оставляют при комнатной температуре на 24 ч, после чего учитывают реакцию. При наличии фермента коагулазы плазма свертывается (не выливается из перевернутой пробирки). В контрольной пробирке консистенция плазмы не изменяется.
Ускоренный метод определения коагулазы. В стерильной капле воды на предметном стекле суспендируют выделенную культуру, к ней прибавляют одну каплю неразведенной плазмы. При положительной реакции из микробных клеток в течение 20-60 с образуются крупные хлопья. Этот метод используют при массовых обследованиях.
Определение гемолитических свойств. Производят посев на агар с 5% крови (штаммы, продуцирующие α-гемолизин, дают зоны просветления среды и на кроличьей и на бараньей крови, продуцирующие β-гемолизин лизируют только эритроциты барана).
Определение ДНКазы. Исследуемую культуру засевают на среду, содержащую ДНК. Посевы инкубируют. Через 18-20 ч на чашку с выросшими колониями стафилококка добавляют 5-7 мл раствора хлороводородной кислоты. ДНК реагирует с кислотой и среда становится мутной. Если выделенная культура продуцирует фермент ДНКазу, он деполимеризует ДНК и помутнение не образуется.
Расщепление маннита в анаэробных условиях. Исследуемую культуру засевают уколом на полужидкий агар с маннитом. Поверхность среды заливают вазелиновым маслом. Инкубируют 18-24 ч при 37° С. Положительная реакция характеризуется изменением цвета среды (в среде имеется индикатор).
Производят учет результатов (табл. 24).
Таблица 24. Свойства золотистого стафилококка
Примечание. + положительная реакция.
Наличие перечисленных признаков позволяет отдифференцировать золотистые стафилококки от стафилококков других видов и дать окончательный ответ: выделен S. aureus (рис. 37).
Рис. 37. Схема выделения и идентификации стафилококка
Для установления эпидемиологической цепочки выделенную культуру фаготипируют. Фаготипирование может подтвердить идентичность стафилококков, выделенных от разных больных и из объектов внешней среды.
Для фаготипирования используют критические тест-разведения фагов. Критическим тест-разведением называют то максимальное разведение фагов, при котором происходит полусливной лизис соответствующего штамма стафилококка.
Методика фаготипирования. В чашку Петри наливают 20 мл 1,5% МПА, дают ему застыть и подсушивают в термостате в течение 30-40 мин. На поверхность агара наносят 1 мл 4-6-часовой культуры выделенного стафилококка, распределяют по поверхности всей чашки, избыток жидкости отсасывают или дают ей испариться в термостате в открытой чашке. Предварительно дно чашки делят на секторы или квадраты. Число квадратов или секторов должно соответствовать количеству используемых фагов. Затем на каждый квадрат или сектор наносят один фаг.
Чашки ставят в термостат при температуре 37° С. Результаты определяют через 6-7 ч. Если чашки оставляют при комнатной температуре, то учет фаголизиса производят через 18-24 ч.
Биологические пробы. Проба на определение летальных свойств культуры. Для выявления летального действия токсина кролику вводят внутривенно (или внутрибрюшинно) фильтрат бульонной культуры стафилококка из расчета 0,1-0,2 мл фильтрата на 1 кг массы кролика. Гибель кролика через 3-4 дня свидетельствует о наличии летального действия токсина.
Дермонекротическая проба. Пробу ставят на кролике (наиболее чувствительному к этому токсину животному). Предварительно на боку или на спине животного выщипывают шерсть и вводят внутрикожно 0,2 мл двухмиллиардной взвеси стафилококковой культуры в изотоническом растворе натрия хлорида. При наличии в выделенной культуре некротических свойств в месте введения образуется инфильтрат, сопровождающийся некрозом.
Реакцию учитывают через 24-18 ч.
Полученную культуру стафилококка проверяют на чувствительность к антибиотикам методом бумажных дисков (см. главу 9).
1. Какой материал исследуют при заболеваниях, вызываемых стафилококками?
2. Каковы основные методы лабораторного исследования для выявления стафилококков?
3. Какова методика постановки реакции плазмокоагуляции?
4. На какой среде выявляют гемолитические свойства стафилококков?
5. С какой целью проводят фаготипирование?
Проверьте, к какому антибиотику чувствительна выделенная культура стафилококка.
Желточно-солевой агар Чистовича. Готовят желточную смесь (1 желток куриного яйца на 150 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида). К мясопептонному солевому агару (8-10% натрия хлорида), растопленному и остуженному до 45° С, добавляют 20% желточной взвеси (соблюдают стерильность) и разливают в чашки.
Агар с кровью. См. главу 7.
Солевой бульон, солевой агар. Готовят как обычные среды - МПБ и МПА, только натрия хлорид вносят в большем количестве (8-10%). Бульон разливают в колбы, пробирки, агар - в чашки.
Стафилококки вместе со стрептококками относятся к гноеродным (вызывающим нагноение) коккам. Кокки — это неподвижные шарообразные бактерии диаметром от 0,5 до 1,5 мкм (1 мкм = 1 микрометр = 0,001 мм).
Для сравнения: диаметр эритроцита равен 7-8 мкм (микрометров, 10 ?6 м). Из физики известно, что на расстоянии 25 см глаз человека может различить два точечных объекта, только если расстояние между этими объектами не меньше 73 мкм (0,073 миллиметра).
Стафилококк. 500 нм = 0.5 мкм.
Стафилококки располагаются одиночно, попарно или гроздьями (от греч. staphyle — виноградная гроздь). Стрептококки — попарно или короткими цепочками (от греч. streptos — крученый, витой; ожерелье, цепочка). При росте на плотных питательных средах в присутствии кислорода стафилокки образуют пигмент, поэтому колонии микроба имеют желтый или оранжевый вид (отсюда название — золотистый стафилококк).
Колонии стафилококка в чашке Петри.
Стафилококки довольно устойчивы во внешней среде, хорошо переносят высушивание, под прямыми солнечными лучами гибнут за 10-12 часов, а при температуре 150° С — за 10 минут. Устойчивы к действию чистого этанола.
Известно 27 видов стафилококков, из них на коже встречались 14, но основные поражения у человека вызывают только три:
- Staphylococcus aureus (стафилокОккус аурЭус), S. aureus — золотистый стафилококк. Он самый частый и опасный.
- S. epidermidis (эпидЭрмидис) [от греч. epi — на и derma — кожа] — эпидермальный стафилококк. Вызывает поражения кожи, слизистых, мочевыводящей системы и инфицирование различных устройств (протезы, катетеры, дренажи).
- S. saprophyticus (сапрофИтикус) [от греч. sapros гнилой] — сапрофитный стафилококк. Выявляется обычно на гениталиях и слизистой мочеиспускательного канала. Чаще всего вызывает циститы у женщин, ведущих активную половую жизнь.
Стафилококки собираются в гроздья.
Золотистый стафилококк распространен повсеместно, часто входит в состав нормальной микрофлоры человека (то есть люди являются его носителями, и он не вызывает никаких инфекций). Поскольку во внешней среде стафилококков много, они часто попадают на кожные покровы людей. В большинстве случаев стафилококки обитают на коже лишь несколько недель или месяцев и потом не обнаруживаются. Золотистый стафилококк может быть выделен у 15-30% клинически здоровых лиц.
Чаще всего заражение стафилококком детей и подростков школьного возраста происходит во время купаниях в прудах, стоячих и малопроточных водоемах.
Хроническое носительство бывает:
- у медперсонала (работа в медицине автоматически относит человека в группу риска, особенно опасна работа в отделениях реанимации и интенсивной терапии, гнойной хирургии),
- у пациентов с атопическими дерматитами,
- при регулярных инъекциях (наркоманы, пациенты на хроническом гемодиализе, больные сахарным диабетом и др.).
Золотистый стафилококк способен поражать практически любые ткани организма. Эта бактерия имеет много патогенных факторов, в том числе несколько важных токсинов:
токсин синдрома токсического шока: впервые зарегистрирован в 1980 году у женщин 15-25 лет, использующих сорбирующие тампоны в период менструаций. Клинически проявляется температурой 38-39° С, рвотой, диареей, скарлатиноподобной сыпью (через 1-2 недели происходит шелушение), рвотой, диареей, значительным снижением артериального давления до шока.
Сыпь при скарлатине: наблюдается выраженное покраснение кожи, на фоне которого появляются множественные мелкоточечные узелки величиной с просяное зерно, расположенные вокруг корней волос и возвышающиеся над поверхностью кожи. При надавливании сыпь под пальцем исчезает, а при отпускании снова появляется.
Синдром может развиться также как осложнение после хирургических вмешательств после родов, особенно на пазухах носа. Сейчас синдрома токсического шока встречается реже благодаря тампонам с пониженными сорбирующими свойствами и без полиакриловых наполнителей.
Энтеротоксины B и С могут также вызвать синдром токсического шока в случаях, не связанных с менструациями.
Золотистый стафилококк наиболее часто поражает:
-
кожу и ее придатки (волосы, ногти, потовые и сальные железы).
инфекции опорно-двигательного аппарата (остеомиелиты, артриты и т.д.). Например, золотистый стафилококк вызывает до 75% случаев гнойных артритов у подростков.
Артрит — воспаление сустава.
Остеомиелит — инфекционное заболевание костного мозга, обычно распространяющееся на вещество кости и надкостницу.
Эндокардит — воспаление внутренней оболочки сердца (эндокарда). Относится к разновидностям сепсиса.
Гнойничковые инфекции кожи называются пиодермиями (пио — гной, дерма — кожа) или даже пиодермитами (суффикс -ит в медицине обозначает воспаление). Чаще всего пиодермии вызываются гноеродными кокками (стафилодермии — стафилококками, стрептодермии — стрептококками) и реже другими бактериями (синегнойная палочка, кишечная палочка, вульгарный протей).
- остиофолликулит (стафилококковое импетиго) — воспаление верхушки волосяной луковицы (волосяного мешочка). Это поверхностный фолликулит.
- фолликулит — воспаление всех отделов волосяной луковицы,
- обыкновенный сикоз — хроническая рецидивирующая форма стафилококковых фолликулитов, т.е. когда фолликулитов много.
- фурункул (чирей) — острое воспаление волосяного мешочка и окружающей соединительной ткани. В центре формируется 1 гнойный стержень.
- фурункулез — хроническая рецидивирующая форма с множеством фурункулов,
- карбункул (углевик, огневик) — воспаление нескольких близлежащих волосяных мешочков и окружающих тканей. По сравнению с фурункулом образуется два и более гнойных стержней.
- гидраденит — воспаление потовых желез,
- псевдофурункулез (множественные абсцессы у детей) — длительное воспаление потовых желез у детей. Выводные протоки потовых желез у детей шире, поэтому стафилококкам проникнуть туда проще.
-
Стрептококковое импетиго — образуются небольшие пузырьки с прозрачной жидкостью (фликтены), которые потом подсыхают до желтой корочки или лопаются с образованием эрозий.
- вульгарное — в случае присоединения стафилококковой инфекции. В этом случае жидкость в пузырьках быстро становится гнойной, а корки после подсыхания имеют грязно-зеленый цвет.
- кольцевидное (цирцинарное) — на конечностях, сливаются в гирлянды, полукольца, дуги.
- пузырное (буллезное).
- поверхностный панариций — вдоль ногтевой пластинки.
- заеда (ангулярный стоматит) — в углу рта образуется эрозия с глубокой трещиной.
- стрептококковая опрелость — чаще у полных лиц с повышенной потливостью.
Часто удается высеять ассоциации стафилококков и стрептококков, но не только их.
- Пиогенная гранулема (ботриомикома) — напоминает опухоль на ножке, возвышающуюся над кожей. Состоит из расширенных кровеносных сосудов.
- Шанкриформная пиодермия — безболезненная округлая эрозия или язва, напоминает твердый шанкр при первичном сифилисе.
- Хроническая глубока язвенная и вегетирующая пиодермия — синюшно-красное сочное уплотнение с похожими на бородавки сочными разрастаниями на поверхности. Бывает изъязвление.
- Хроническая язвенная пиодермия — обычно одна язва с красным дном, которая не покрывается коркой и длительно существует без изменений.
- Хроническая абсцедирующая пиодермия — в подкожной клетчатке или глубоко в коже возникают плотные воспаленные узлы, которые со временем вскрываются несколькими свищевыми ходами, через которые постоянно выделяются небольшие количества гноя.
- (Пери)фолликулит абсцедирующий и подрывающий — на коже головы у мужчин множественные глубокие воспалительные узлы, которые нагнаиваются. Считаются вариантом тяжелых акне.
Итак, пиодермии могут быть вызваны не только стафилококками и стрептококками, но и другими бактериями. Даже могут напоминать первичный и вторичный период сифилиса, но одна из характерных особенностей сифилиса — безболезненность кожных высыпаний.
Постоянное присутствие в организме очень небольшого количества бактерий золотистого стафилококка может провоцировать развитие такого аутоиммунного заболевания, как системная красная волчанка, предполагают специалисты из клиники Майо, чья работа опубликована онлайн в журнале Journal of Immunology.
Во всяком случае, именно такой результат был получен в опытах на мышах, которые в течение длительного времени были подвергнуты воздействию малых доз вырабатываемого бактериями золотистого стафилококка белка энтеротоксин B. В итоге у мышей развилось системное воспалительное заболевание, по своим проявлениям аналогичное системной красной волчанке у людей.
Как предполагают авторы работы, энтеротоксин B активирует аутореактивные Т и В-лимфоциты — тип белых кровяных телец, играющие ключевую роль в процессе развития такого аутоиммунного воспалительного заболевания, как волчанка. Ранее уже была обнаружена связь между бактериями золотистого стафилококка и такими аутоиммунными заболеваниями, как псориаз, синдром Кавасаки и гранулематоз Вегенера.
Основными источниками обсеменения стафилококками пищевых продуктов являются люди и животные с гнойно-воспалительными процессами (абсцессы, фурункулы, гнойные раны и др.), а также носители этих микроорганизмов. Перенос стафилококков от людей на пищевые продукты может происходить воздушно-капельным путем, при непосредственном контакте людей с продуктами, оборудованием, в процессе убоя скота и разделки туш.
Чаще всего причиной стафилококковых токсикозов является употребление молока, мяса и мясных изделий, кондитерских изделий с заварным кремом и др., контаминированных патогенными стафилококками. Органолептические свойства продуктов, в которых размножаются стафилококки и накапливаются энтеротоксины, не изменяются [2].
Энтеротоксигенные стафилококки размножаются в пищевых продуктах даже при содержании в них около 40% влаги. Они могут развиваться в продуктах, содержащих от 7% до 12% хлорида натрия. Сахар угнетает развитие стафилококков при концентрациях 30–40%. Некоторые микроорганизмы (В. сеreus, дрожжи из рода Саndidа и др.) оказывают на стафилококки стимулирующий эффект (они усиливают образование энтеротоксина).
Энтеротоксин стафилококков обладает высокой термоустойчивостью. Инактивирование (разрушение) токсина происходит только через 2,5–3 часа кипячения. При автоклавировании (120°С) токсин разрушается через 20 мин. При благоприятных температурных условиях энтеропатогенные стафилококки быстро размножаются в продуктах и продуцируют токсин. Пищевые токсикозы, вызванные энтеропатогенными стафилококками, протекают в форме острого гастроэнтерита, сопровождающегося рвотой, реже диареей, головной болью. Инкубационный период очень короткий – от 30 мин до 6 ч. Длится заболевание один, реже – два, три дня [1].
Выявление и определение количества этих микроорганизмов в пищевых продуктах проводят в соответствии с ГОСТ 31746-2012. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus.
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов, и устанавливает методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus посевом: в жидкую селективную среду (с предварительным обогащением) и на (в) агаризованные селективно-диагностические среды [4].
Метод определения наиболее вероятного числа (НВЧ) коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом в жидкую селективную среду предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 см 
жидкого продукта менее 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) коагулазоположительных стафилококков и S. aureus.
Метод определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом на агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 или в 1 см
жидкого продукта более 150 КОЕ коагулазоположительных стафилококков и S. aureus [4].
Метод выявления и метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом с предварительным обогащением основаны на высеве навески продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus.
При пересеве на агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном выросшие типичные колонии без подтверждения по биохимическим признакам относят к коагулазоположительным стафилококкам.
Определенное количество жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции вносят в жидкую селективную питательную среду [6].
Перед посевом анаэробные условия в среде создают кипячением при (100±1) °С в течение 15 мин, наслоением агара или парафина в каждую пробирку после посева, а также с помощью альтернативной процедуры - инкубирования пробирок в емкости или инкубаторе в анаэробных условиях.
Пробирки с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч. Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков на Жиолитти-Кантони бульоне определяется по редукции теллурита калия, а на глюкозном или солевом бульоне - по помутнению среды [3].
Поверхность одной из агаризованных селективно-диагностических сред (Байрд-Паркер агара, молочно-солевого, яично-желточно-азидного, яично-желточно-солевого агара, агара с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном), инокулируют из предположительно положительных пробирок после 24 ч и все оставшееся пробирки после 48 ч.
Чашки Петри с посевами инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 ч. Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по редукции теллурита калия и яично-желточной реакции (лецитиназной активности) [7].
На агаре с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном после инкубирования присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по типичным колониям, показавшим специфичную реакцию (бычий фибриноген/кроличья плазма).
Подтверждение принадлежности типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам проводят по изучению отношения выявленных микроорганизмов к окраске по Граму, определению присутствия у них каталазы и коагулазы.
Подтверждение принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S. aureus проводят по определению образования ацетоина, определению ферментации в аэробных условиях мальтозы и, при необходимости, определению термостабильной нуклеазы и гемолитической активности. Результаты выявления коагулазоположительных стафилококков и S. aureus выражают: "обнаружены" или "не обнаружены"[5].
Метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus. Навески продукта и (или) серию разведений навески продукта вносят в жидкую селективную питательную среду. Наиболее вероятное число коагулазоположительных стафилококков и S. aureus в 1 см или в 1 г продукта определяют для подтвержденных посевов, пользуясь НВЧ-таблицей по ГОСТ 26670.
Методы определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом на (в) агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве навески продукта и/или разведения навески продукта на (в) агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете типичных и (или) атипичных колоний, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus [4].
Проводят посев определенного количества жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции на (в) агаризованную селективно-диагностическую питательную среду на две параллельные чашки Петри. Аналогично проводят посев десятикратных разведений испытуемого продукта. Посевы в чашках Петри инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч.
Количество коагулазоположительных стафилококков в 1 см
или 1 г продукта определяют по числу типичных и/или атипичных колоний, выросших на чашках Петри, принадлежность которых к коагулазоположительным стафилококкам подтверждена путем определения отношения микроорганизмов из этих колоний к окраске по Граму, наличия у них каталазы и коагулазы [3,4].
При посеве в (на) агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном определяют только типичные колонии и без подтверждения по биохимическим признакам их относят к коагулазоположительным стафилококкам.
Количество S. aureus в 1 см
или 1 г продукта определяют исходя из количества коагулазоположительных стафилококков, принадлежность которых к S. aureus подтверждена по образованию ацетоина, определению ферментации в аэробных условиях мальтозы и, при необходимости, определению термостабильной нуклеазы и гемолитической активности.
При выявлении коагулазоположительных стафилококков в определенной навеске исследуемого продукта или его эквивалентном разведении с предварительным обогащением эту навеску или разведение вносят в одну из питательных сред [6,7].
Перед использованием Жиолитти-Кантони бульон прогревают кипячением при (100±1) °С в течение 15 мин для удаления воздуха. Охлаждают до 44 °С - 47 °С и с соблюдением правил асептики прибавляют раствор теллурита калия.
В 10 см модифицированного Жиолитти-Кантони бульона нормальной концентрации или сред вносят 1 см
жидкого продукта или 1 см исходной суспензии (т.е. 0,1 г или 0,1 см продукта). После посева навески продукта и (или) его разведений на поверхность Жиолитти-Кантони бульона осторожно наслаивают слой стерильного голодного агара или слой стерильного парафина и охлажденных до температуры 44 °С - 47 °С, дают полученному слою агара или парафина застыть и герметично закрывают.
Соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой нормальной концентрации 1:10. При использовании среды двойной концентрации соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой 1:1 [3].
Если при последующем подтверждении принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S. aureus не определяют наличие термостабильной нуклеазы и гемолитической активности, то допускается проводить посев в Жиолитти-Кантони бульон без прогрева перед посевом и без наслаивания голодного агара или парафина после посева.
Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч. Если появилось почернение или черный осадок в Жиолитти-Кантони бульоне или помутнение в солевом или сахарном бульоне, то проводят подтверждение принадлежности выросших микроорганизмов к коагулазоположительным стафилококкам. Если почернения, черного осадка или помутнения нет, то посевы инкубируют еще (24±2) ч [2].
Для получения изолированных колоний стерильной петлей делают пересевы культур из каждого посева на поверхность чашки Петри с одной из агаризованных селективно-диагностических сред: Байрд-Паркер агара, Байрд-Паркер агара с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном, молочно-солевого агара, яично-желточно-азидного агара или яично-желточно-солевого агара. Пересевы проводят также из пробирок, в которых нет видимых признаков роста.
Чашки Петри с пересевами инкубируют в термостате при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч или (48±2) ч. После 24 ч инкубирования чашек Петри по отмечают на дне чашек присутствие типичных и атипичных для коагулазоположительных стафилококков колоний [1].
На Байрд-Паркер агаре после инкубирования в течение 24 ч коагулазоположительные стафилококки образуют типичные колонии черного или серого цвета, блестящие и выпуклые, окруженные прозрачной зоной, диаметр колоний около 1,0-1,5 мм и до 1,5-2,5 мм после инкубирования в течение 48 ч. После инкубирования в течение 24 ч непосредственно около колонии в прозрачной зоне может появиться опалесцирующее кольцо, окружающее колонию.
Принадлежность выявленных коагулазоположительных стафилококков к S. aureus проводят по определению их способности образовывать ацетоин и ферментировать мальтозу в аэробных условиях [5].
Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера). Культуру высевают в пробирки со средой Кларка. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 48 ч. После инкубирования посевов к 1 см
отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см
раствора - нафтола и 0,2 см
раствора гидроокиси калия. Появление розового окрашивания через 15-60 мин указывает на положительную реакцию. S. aureus образует ацетоин.
Определение ферментации мальтозы в аэробных условиях. Способность ферментации мальтозы в аэробных условиях определяют с целью дифференциации S. aureus от других коагулазоположительных видов S. intermedius и S. hyicus. Для определения ферментации мальтозы в аэробных условиях культуры, подлежащие исследованию, высевают уколом петлей в среду Гисса с мальтозой. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 48 ч. При ферментации мальтозы в аэробных условиях с образованием кислоты цвет среды Гисса изменяется. S. aureus ферментирует мальтозу в аэробных условиях [4].
Оценка результатов подтверждения принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S. aureus. Если коагулазоположительные стафилококки образуют ацетоин и сбраживают мальтозу в аэробных условиях, то считают, что выявленные коагулазоположительные стафилококки относятся к S. aureus. Для биохимической идентификации допускается использование тест-систем промышленного производства, зарегистрированных на территории государства, принявшего стандарт.
Оценка результатов посевов в жидкие среды. При определении НВЧ коагулазоположительных стафилококков или S. aureus или при их выявлении в определенной навеске продукта посевы считают положительными (то есть коагулазоположительные стафилококки или S. aureus выявлены в испытуемой навеске продукта), если при последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и подтверждении типичных и (или) атипичных колоний, выросших на этих средах, хотя бы в одной колонии будут обнаружены коагулазоположительные стафилококки или S. aureus [6].
Результаты выявления коагулазоположительных стафилококков или S. aureus записывают: обнаружены (не обнаружены) в 1 г (см3) продукта; масса или объем продукта, в котором выявляли коагулазоположительные стафилококки или S. aureus.
Читайте также: