Биопсия при болезни паркинсона

С появлением дофасодержащих препаратов, ознаменовавших прорыв в лечении паркинсонизма, использование этого метода заметно снизилось. Однако побочное действие лекарств приводило к дополнительным двигательным нарушениям, значительно ухудшающим качество жизни, и инвалидности.

Развитие современных компьютерных программ дало методу вторую жизнь, поскольку стало возможным рассчитывать очень тонкие цели.

Сегодня стереотаксический метод гарантирует исключительную точность доставки инструмента хирургического воздействия (для биопсии, деструкции, стимуляции) в заранее определенную зону сквозь толщу мозга без опасности повреждения критических для здоровья и жизни пациента структур.

В Беларуси закуплена одна из лучших стереотаксических систем в мире — Leksell, признанная мировым стандартом стереотаксиса. Станция планирования помогает рассчитывать цель с допуском в 0,6 мм . Имеет 5 программ, позволяющих проводить общие стереотаксические операции (например, биопсии опухолей), функциональные (при болезни Паркинсона); совмещать изображения КТ и МРТ, радиоизотопных исследований электронно-эмиссионной томографии — для получения координат цели-мишени; располагает электронным атласом мозга, с помощью которого также определяется точка-мишень и контролируется точность попадания.

Перед началом операции пациенту проводится КТ или МРТ-исследование. Цель — получить изображение головного мозга с маркерами. На голове пациента жестко закрепляется стереотаксическая рамка и специальный адаптер, позволяющий оценить маркеры, которые видны на МРТ.

Затем начинается сама операция (длится приблизительно 2 часа). К стереотаксической рамке дополнительно крепится градуированная арка-дуга, на которой выставляются трехмерные координаты цели согласно компьютерному моделированию. Пациент — в сознании, лишь на время наложения фрезевого отверстия для введения электрода его седатируют и обезболивают.

Диаметр трепанационного отверстия — 1,5 см . В него вводится электрод для функциональной диагностики. С помощью многофункционального нейрогенератора проводится стимуляция мозга — для определения реального положения электрода относительно мишени-цели. В этот момент врач разговаривает с больным, спрашивает, что тот ощущает. По ответам определяет, насколько близко, точно подошли к точке-мишени, которая имеет размер всего несколько миллиметров. Когда же у оперируемого появляются принудительные движения или ощущения (выворачивание рук, спазмы), это значит, что электрод стоит слишком близко к важным структурам мозга — необходимо срочно уйти из опасной зоны. Ведь если в области капсулы провести деструкцию, человека может парализовать.

Самое частое осложнение — развитие внутричерепных гематом (3–5% по мировой статистике; летальные исходы — 1%).

Для получения ожидаемого эффекта важен четкий отбор больных, точная оценка хирургических факторов риска. Критерии: неэффективность лекарств; длительность заболевания более 5 лет, желание больного получить помощь хирургическим путем. У пациента не должно быть острых или обострений хронических болезней, ему нельзя принимать лекарства, разжижающие кровь (угроза внутричерепной гематомы).

Убежден, если проводить нормальную селекцию больных, адекватно оценивать их МРТ и КТ, то при грамотном использовании стереотаксического аппарата, осложнения минимальны. Я за 10 лет провел около 1,5 тыс. стереотаксических операций, из них 1050 биопсий, остальные — при болезни Паркинсона. За все время — 1 летальный случай, 13 — кровотечений, в т. ч. 3–5 больших гематом, остальные — незначительные, не потребовавшие реопераций.

Результат и уровень белорусских нейрохирургов такой же, как и в других европейских клиниках.

Проведено 5 операций: 3 — пациентам с болезнью Паркинсона, 1 — с невралгией тройничного нерва, 1 — биопсия. Все прошли успешно.

Результаты стереотаксических операций обсудим на научно-практической конференции в РНПЦ: нужно разобрать ошибки и неточности, сложности, организационные недочеты. Признаюсь, сложно провести операции такого класса, не имея собственной базы. ЯМР, например, нам пришлось делать в РНПЦ травматологии и ортопедии: там точнее аппарат.

Нейрохирургическую подготовку 2 наших специалиста проходили в Амстердаме. Решаем вопрос об обучении в Германии еще 1 — нейрофизиолога.

Работали с больными на 3 базах — в неврологическом отделении нашего РНПЦ, нейрохирургическом отделении 5 ГКБ, РНПЦ травматологии и ортопедии, где проводилось надевание рамки и МРТ у 3 больных.

Алгоритм МРТ разработан врачами нашего центра совместно с профессором С. Ислекелем и врачом-радиологом И. Булаевым. Станция планирования стереотаксической системы предъявляет жесткие требования к полученным изображениям. Перед операцией вместе с инженером из Швеции с помощью МР-фантома были оценены искажения изображений, полученные с МРТ, для определения ошибки.

Провели 5 операций (4 — стереотаксические и 1 термолизис).

У 65-летней Валентины В. из Брестской области, 15 лет страдавшей невралгией тройничного нерва, даже прием пищи (жевание) вызывал невыносимую боль. Лекарства (ежедневный прием 6–8 таблеток карбамазепина) не помогали. 3 из 5 блокад за последние 5 лет, тоже оказались неэффективны.

Ретрогассеровый термолизис чувствительных волокон второй ветви тройничного нерва через естественные отверстия черепа устранил боль. Операция выполнялась под неглубоким наркозом в условиях операционной под рентгеновским контролем. Остался менее выраженный болевой синдром, обу-словленный поражением третьей ветви. Пациентка принимает лекарства только 2 раза в день вместо 8, как ранее, а через 3–4 недели и они не понадобятся.

У 37-летней Оксаны М. из Полоцка — образования глубинной локализации в 2 местах. Для дифференциальной диагностики характера опухоли (первичное поражение или метастаз) выполнена стереотаксическая биопсия данного образования (открытая операция имела высокий риск осложнений и большую угрозу для жизни). После операции больная чувствует удовлетворительно. Послеоперационная КТ (выполнена через 6 часов), показала отсутствие осложнений.

У 45-летней жительницы Г. из Минска, инвалида 2 группы проведена трехочаговая стереотаксическая паллидотомия. Больна с 1997 г ., заболевание начиналось с правой руки. Теперь поражены обе половины тела; не могла полноценно себя контролировать, ходить, в покое — значительный тремор, лекарства разных групп оказали побочное действие — через 9 лет после начала заболевания.

Операция прошла удачно, больная может полностью управлять правой половиной тела, доза лекарств уменьшена вдвое. Через 6 месяцев будет решаться вопрос о воздействии на другую непослушную конечность.

47-летняя Нина К. из Бобруйска болеет с 1999 г ., с каждым годом у нее нарастала скованность в правой руке, нога подкашивалась из-за побочного действия лекарств. В первый же день после операции смогла держать в руке столовые принадлежности, ручку, газету. Тремора нет, может самостоятельно вставать и ходить.

Стереотаксическая нейрохирургия совместно с методами временной и постоянной нейромодуляций помимо обратимого и дозированного воздействия при болезни Паркинсона также применяется в лечении тяжелых фантомных и нейрогенных болей, синдрома Туретта, эссенциального тремора, сложных гиперкинезов, спастических синдромов, возникающих при ДЦП, травмах спинного мозга. Находит широкое применение в лечении мышечной дистонии, критической ишемии конечностей, выраженном спазме дистальных сегментов коронарных артерий (Х-синдром), при тяжелых посттравматических нарушениях мочеиспускания, эректильной дисфункции, дефекации. Используется для восстановления спонтанного дыхания, в профилактике и лечении пролежней при высоких травмах спинного мозга и тяжелых ЧМТ.

"Мой супруг — офицер, человек очень уравновешенный. Он всю жизнь работал, ни на что не жаловался, я никогда не слышала от него про усталость. Но приблизительно шесть лет назад он стал слишком тихим, мало разговаривал — просто сидел и смотрел в одну точку. Мне даже в голову не пришло, что он болен. Наоборот, ругала, что раньше времени постарел. Примерно тогда же к нам приехала двоюродная сестра из Англии — она работает в больнице — и сразу сказала, что у Рафика все очень плохо, нужно завтра же вести его к врачу. Так мы узнали о болезни Паркинсона", — вспоминает Седа из Еревана.

Что такое болезнь Паркинсона

Паркинсон — одна из самых страшных фамилий, что можно услышать в кабинете у невролога. Ее носил английский врач, который в 1817 году подробно описал шесть случаев загадочной болезни. День рождения Джеймса Паркинсона, 11 апреля, и выбран памятной датой Всемирной организацией здравоохранения. Из-за основных симптомов Паркинсон называл недуг дрожательным параличом: движения больных замедляются, становятся скованными, мышцы сильно напрягаются, а руки, ноги, подбородок или все тело бесконтрольно трясутся. Впрочем, в четверти случаев дрожания — самого известного признака болезни — нет.

Все это напоминает обыкновенную старость. Двигательные симптомы — собирательно их называют паркинсонизмом — встречаются у многих здоровых стариков. Но болезнь Паркинсона этим не исчерпывается. На поздних стадиях человек легко теряет равновесие, то и дело застывает на месте во время ходьбы, ему трудно говорить, глотать, спать, появляются тревога, депрессия и апатия, мучают запоры, падает кровяное давление, слабеет память, а под конец часто развивается слабоумие. Самое печальное — вылечить болезнь Паркинсона пока невозможно.

В начале XX века российский невропатолог Константин Третьяков выяснил, что при болезни Паркинсона гибнут клетки черной субстанции, области мозга, которая частично отвечает за движения, мотивацию, обучение. Что вызывает смерть нейронов, неизвестно. Возможно, дело в сбоях внутри клеток, но еще замечено, что внутри них скапливается вредный белок. Оба процесса наверняка как-то связаны, но ученые не знают, как именно.

В 2013 году физиолог Сьюзан Гринфилд из Оксфордского университета представила новую модель развития нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезней Паркинсона и Альцгеймера. Гринфилд предположила, что при повреждении мозга, например, от сильного удара выделяется особое вещество. У маленьких детей из-за него растут новые клетки, а на взрослых оно, судя всему, действует противоположным образом, дальше повреждая клетки. После этого следует еще больший выброс вещества, и цепная реакция постепенно разрушает мозг. По злой иронии взрослые впадают в младенчество из-за фермента, необходимого младенцам.

Впрочем, догадка Гринфилд объясняет не все. Болезнь Паркинсона связана с наследственностью: близкий родственник с таким же диагнозом или тремором другой природы — главный фактор риска. На втором месте — запоры: иногда их вызывают изменения в мозге, когда еще не появились двигательные симптомы. Также риск растет, если человек никогда не курил, живет за городом, пьет колодезную воду, но при этом сталкивался с пестицидами, а снижается — у любителей кофе, алкоголя и гипертоников. В чем тут секрет, непонятно, как непонятно, почему болезнь Паркинсона обычно начинается в старости: если на пятом десятке лет болеет примерно один из 2500 человек, то на девятом — уже один из 53.

Новую зацепку дала свежая работа ученых из Университета Томаса Джефферсона: возможно, болезнь Паркинсона связана с иммунной системой. Исследователи взяли мышей с мутантным геном, который часто встречается у больных, и ввели им безвредные остатки бактерий. Из-за этого у зверьков началось воспаление, затронувшее и мозг, причем иммунных клеток было в 3–5 раз больше, чем у обычных мышей. Из-за этого в мозге мутантов начались процессы, губительные для нейронов черной субстанции. Как и в модели Гринфилд, процессы эти оказались циклическими: воспаление в мозге может остаться даже после того, как тело справилось с инфекцией. Впрочем, сами авторы исследования признаются, что в этом механизме еще многое не ясно.

Каково живется больным и их близким

В России болезнь Паркинсона есть примерно у 210–220 тыс. человек. Но эти данные рассчитаны по косвенным показателям, а единого реестра не существует. Анастасия Обухова, кандидат медицинских наук с кафедры нервных болезней Сеченовского университета и специалист по болезни Паркинсона, считает эту статистику заниженной. "Многие больные впервые приходят уже на развернутых стадиях болезни. При расспросе удается выяснить, что признаки появились еще несколько лет назад. У большинства наших людей действует принцип "Пока гром не грянет, мужик не перекрестится": они читают в интернете, спрашивают соседок, а к врачу не обращаются. Это в Москве, а в маленьких городках и поселках к врачу идут только если совсем помирают", — объясняет Обухова.

Вдобавок попасть на прием не так-то просто. Для этого сначала нужно сходить к терапевту, чтобы тот направил к неврологу. Но и тогда нет гарантии, что человеку поставят правильный диагноз и назначат нужное лечение. "Врач в поликлинике не может разбираться во всем, поэтому должен послать больного к узкому специалисту. А окружных паркинсонологов, по-моему, убрали. Во всяком случае, пациенты на это жаловались", — рассказывает Обухова. Правда, если больной все-таки попал к нужному доктору, лечить его будут на мировом уровне. Оттого в Россию с болезнью Паркинсона прилетают даже из других стран.

Одиссею по кабинетам приходится часто повторять, потому что болезнь прогрессирует — терапию нужно подстраивать. Лечение обходится дорого: месячный запас некоторых лекарств стоит по 3–5 тыс. рублей, а на поздних стадиях назначают сразу несколько препаратов. "В районных поликлиниках лекарства иногда дают бесплатно, но только дешевые дженерики. Комментировать их качество не буду. Иногда нужных лекарств нет. Тогда их заменяют чем-то другим. Пациентам от этого плохо", — объясняет Обухова.

Клиническая медицина

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Валерий Борисович Соболев, Рудольф Михайлович Худоерков, Ринат Равильевич Богданов, Илья Андреевич Давыдов, Снежана Юрьевна Борисова

Статья посвящена особенностям и ключевым техническим аспектам выявления фосфорилированного α-синуклеина в биоптатах слюнных желез у пациентов с болезнью Паркинсона . Проведено сравнение различных гистологических методов приготовления срезов перед иммуногистохимическим и иммунофлюоресцентным исследованиями. Обосновывается наиболее информативная методика выявления нервных волокон в биоптатах слюнных желез . Представлена верификация данных, получаемых при биопсии слюнных желез , с помощью результатов изучения гистологического материала черной субстанции пациента с болезнью Паркинсона , имеющего иммуноположительные тельца Леви. На основании полученного опыта выработан наиболее подходящий протокол работы с биопсийным материалом слюнных желез человека.

Identification of Phosphorylated α-synuclein in Salivary Gland Biopsy Samples in Parkinson’s Disease

The article is devoted to key technical aspects of identification of phosphorylated α-synuclein in the biopsy samples of salivary glands in patients with Parkinson’s disease . Comparative analysis of different histological methods of preparation of the samples before immunohistochemical and immunofluorescent studies is presented. The scientific background is provided for the most informative method of revealing nervous fibers in the salivary biopsies. The results of the biopsy of salivary glands were verified using the data from the s. nigra histology studies obtained from the subject with Parkinson’s disease and immunopositive Lewy bodies. Based on this experience, optimal protocol for the processing of human salivary glands biopsy samples has been designed.

Выявление фосфорилированного а-синуклеина в биопсийном материале слюнных желез при болезни Паркинсона

В.Б. Соболев, Р.М. Худоерков, Р.Р. Богданов, И.А. Давыдов, С.Ю. Борисова, С.Н. Иллариошкин

Статья посвящена особенностям и ключевым техническим аспектам выявления фосфорилированного а-синуклеина в биоптатах слюнных желез у пациентов с болезнью Паркинсона. Проведено сравнение различных гистологических методов приготовления срезов перед иммуногистохимическим и иммунофлюоресцентным исследованиями. Обосновывается наиболее информативная методика выявления нервных волокон в биоптатах слюнных желез. Представлена верификация данных, получаемых при биопсии слюнных желез, с помощью результатов изучения гистологического материала черной субстанции пациента с болезнью Паркинсона, имеющего иммуноположительные тельца Леви. На основании полученного опыта выработан наиболее подходящий протокол работы с биопсийным материалом слюнных желез человека.

Ключевые слова: болезнь Паркинсона, слюнные железы, биопсия, иммуногистохимия, иммунофлюоресценция, протокол.

С молекулярной точки зрения болезнь Паркинсона (БП) относится к протеинопатиям. Это нейродегенеративное заболевание характеризуется наличием в цитоплазме гибнущих нейронов включений, основу которых составляет белок а-синуклеин (а-вуп) [1]. Исследование его специфических форм рассматривают как перспективное направление в разработке ранней диагностики БП, а сам а-вуп - как возможный биомаркер заболевания [2].

В группу синуклеинов помимо а-вуп входят р-, у-синук-леины и синоретин [3]. а-синуклеин впервые был идентифицирован в ткани мозга человека при ультраструктурном

Валерий Борисович Соболев - мл. науч. сотр. лаборатории функциональной морфохимии отдела исследований мозга ФГБНУ "Научный центр неврологии", Москва. Рудольф Михайлович Худоерков - докт. мед. наук, зав. лабораторией функциональной морфохимии отдела исследований мозга ФГБНУ "Научный центр неврологии", Москва.

Ринат Равильевич Богданов - докт. мед. наук, профессор кафедры неврологии ФУВ ГБУЗ МО "Московский областной научно-исследовательский институт им. М.Ф. Владимирского".

Илья Андреевич Давыдов - науч. сотр. отделения че-люстно-лицевой хирургии, ассистент кафедры челюст-но-лицевой хирургии и госпитальной хирургической стоматологии ФУВ ГБУЗ МО "Московский областной научно-исследовательский институт им. М.Ф. Владимирского".

Снежана Юрьевна Борисова - аспирант кафедры неврологии ФУВ ГБУЗ МО "Московский областной научно-исследовательский институт им. М.Ф. Владимирского". Сергей Николаевич Иллариошкин - член-корр. РАН, зам. директора по научной работе, рук. отдела исследований мозга ФГБНУ "Научный центр неврологии", Москва. Контактная информация: Соболев Валерий Борисович, [email protected]

исследовании амилоидных бляшек у пациентов с болезнью Альцгеймера в 1993 г. [4]. Было установлено, что основная изоформа включает 140 аминокислотных остатков, но есть и более короткие формы [5]. Однако только основная изо-форма проходит полную посттрансляционную модификацию, а более короткие ее формы не проходят и, вероятно, несут наибольшую опасность аномальной конформации и патологической агрегации [6].

Полная версия белка состоит из трех участков молекулы - ^концевой спирали, центрального участка и отрицательно заряженного С-участка [7]. ^концевой участок обеспечивает липофильные свойства, что способствует фиксации белка с мембранными структурами с образованием липопротеиновых комплексов. Центральный участок молекулы обеспечивает взаимодействие с другими молекулами а-вуп и формирование нерастворимых олигомерных и полимерных белковых образований [2]. Взаимодействие с этой областью потенциально может влиять на агрегацион-ные свойства белка [8].

а-синуклеин составляет до 1% от общего белка цитозо-ля, чем, предположительно, можно объяснить большое его значение во внутриклеточных процессах [9]. Однако функции а-вуп до сих пор не выяснены. Предполагается, что а-вуп участвует в стабилизации мембран, везикулярном транспорте и пресинаптической сигнализации 10. Установлено, что в нормальных условиях а-вуп существует преимущественно в мономерном состоянии, но в условиях стресса он может формировать физиологически альтернативные конформации (мономерные и димерные). Патологические димерные и полимерные формы образуют фибриллы и превращающиеся в цитоплазматические включе-

ния - тельца и нейриты Леви 12. Последние рассматриваются как патоморфологические маркеры БП [2].

Нейротоксины, тяжелые металлы и другие факторы окружающей среды, как и мутации гена БЫСЛ, повышают склонность белка к полимеризации и агрегации [12]. Предполагаемые механизмы нейротоксичности измененного а-вуп и его агрегатов связаны с митохондриальной дисфункцией, протеолитическим стрессом, оксидативным повреждением и др. [11].

Тельца Леви как патоморфологический маркер БП наиболее характерны для черной субстанции среднего мозга, но также обнаруживаются в двигательных ядрах блуждающего нерва, базальных ядрах Мейнерта, голубом пятне и располагаются диффузно в других структурах на более поздних сроках болезни 14. Однако агрегаты а-вуп могут быть маркерами и других нейродегенеративных заболеваний - деменции с тельцами Леви, мультисистемной атрофии, нейродегенераций с накоплением железа и др. При БП и деменции с тельцами Леви агрегаты выявляются не только в телах клеток, но и в отростках нейронов и глии [7, 14]. При мультисистемной атрофии агрегаты а-вуп видны как цитоплазматические включения в нейронах и клетках глии. При нейроаксональной дистрофии (нейродегене-рации с накоплением железа II типа) эти включения встречались в виде аксональных сфероидов [14].

При БП локализация агрегатов а-вуп не ограничивается структурами центральной нервной системы. Они обнаруживаются также в периферических тканях и органах, что может иметь большое значение для верификации патологического процесса в наиболее ранней (латентной) стадии, т.е. еще до дебюта классических (моторных) признаков заболевания и гибели большей части нейронов черной субстанции [10, 17]. Выявление ранних патологических синуклеинположительных включений, телец и нейритов Леви легло в основу известной гипотезы Браака, предполагающей периферическое начало нейродегенеративного процесса при БП [10]. В поддержку этой гипотезы получено большое количество данных о периферической локализации иммуногистохимических маркеров, что также подтверждается работами на основе метаанализа [2].

В аутопсийном материале обонятельных луковиц агрегаты а-вуп выявляли у 95% лиц с БП и лишь у 7% пожилых неврологически здоровых лиц [18].

На биопсийном материале слизистой оболочки толстой кишки была установлена 100% специфичность фосфори-лированного а-вуп как маркера БП, но чувствительность этого метода не превышала 70-80% [19]. По данным других исследователей, выявляемость а-вуп в слизистом и подслизистом слоях кишечника у больных БП составила 55%, в то время как в контроле проба была положительной у 1 из 10 индивидуумов [20]. Включения а-вуп обнаруживались в метасимпатической нервной системе кишечника

даже на ранних стадиях БП, при этом а-вуп также выявлялся в дорсальном моторном ядре блуждающего нерва [10].

При исследовании биоптатов малых слюнных желез в полости рта а-вуп находили в 60% случаев при БП и в 30% случаев в группе контроля [21]. Согласно другим оценкам, при исследовании слюнных желез специфичность и чувствительность иммуногистохимического метода выявления а-вуп при БП достигали 100% [2]. В нервах гортани при БП плотность положительных включений и волокон, содержащих а-вуп, была выше у пациентов с дисфагией [22]. В образцах биопсий кожи а-вуп регистрировали лишь в 20% случаев при специфичности примерно 80% [2].

Помимо этого а-вуп в мономерной и олигомерной форме представлен в эритроцитах, цереброспинальной жидкости, плазме крови, слюне, что плохо укладывается в концепцию исключительно внутриклеточной локализации белка [17, 23-26]. До настоящего времени исследование биологических жидкостей (ликвора и плазмы крови) на различные изоформы а-вуп не давало надежных результатов с точки зрения выявления нейродегенеративного процесса [2, 22, 25, 27]. На этом фоне поиск а-вуп в тканях, иннер-вируемых вегетативной нервной системой, выглядит более перспективным [28, 29].

В разных ганглиях и сплетениях периферической нервной системы отмечена разная частота выявления а-вуп. Так, при исследовании симпатических ганглиев агрегаты а-вуп находили в 80% случаев, при исследовании блуждающего нерва - в 73%, седалищного нерва - в 50%, желудочно-кишечного тракта - в 65%, дыхательных путей (гортани, первичных бронхов, легких) - в 12,5%, эндокринных органов - в 22%, мочеполовой системы - в 12,5% [2, 18]. По данным биопсии кожи при паркинсонизме (БП и мультисистемная атрофия) продемонстрирована широкая вариабельность частоты включений а-вуп - от низкой до 70% 30. В биоптатах кожи спины (на уровне нижнего грудного и верхнего поясничного позвонков) а-вуп выявлялся в 16 (52%) из 31 пробы, в биоптатах кожи проксимального отдела ноги (внутренняя поверхность бедра) -в 6, в дистальном отделе - в 4, на указательном пальце ноги - в 5 [30].

Включения а-вуп локализуются в основном в немие-линизированных нервных волокнах [10, 33]. Показана преимущественная выявляемость а-вуп в нейронах и их отростках, положительно окрашиваемых на субстанцию Р (ЭР) и тирозингидроксилазу (ТН) [2, 30]. Также накопления а-вуп встречаются в волокнах, положительных на ва-зоактивный интестинальный пептид и кальцитонин-ген-связанный пептид. Предполагают, что выявление а-вуп в ЭР-положительных структурах может быть признаком ранних этапов развития заболевания [10, 30, 34].

Тельца Леви - конечная стадия агрегации патологической формы а-вуп в нейронах - имеют диаметр до 25 мкм и приобретают насыщенный цвет хромогена при иммуно-

Таблица 1. Результаты иммуногистохимического исследования и сравнение систем детекции и мечения

Проводка, системы детекции Условия

без обработки Трис-ЕДТА цитратный буфер муравьиная кислота

Результаты иммуногистохимического исследования в зависимости от проводки и условий обработки биопсийного материала

Сравнение систем детекции и мечения в зависимости от условий демаскировки антигена

Примечание. Была использована система вторичной детекции Т_-012 МШРН в виде балльной шкалы. Обозначения: "-" - положительное окрашивание не выявлено ни в одной партии, либо оно единично; "+" - положительное окрашивание встречается в меньшей части партий препаратов; "++" - положительное окрашивание встречается в половине и более партий препаратов; "+++" - положительное окрашивание встречается в большинстве партий препаратов.

гистохимическом окрашивании. Известно, что a-syn в составе телец Леви или в виде неоформленных агрегатов может выявляться и у небольшой части здоровых пожилых лиц; это было установлено на аутопсийном материале в нейронах центральной нервной системы у неврологически здоровых лиц старше 60 лет [16, 35]. Возможно, это маркер пресимптоматической стадии синуклеинопатии.

Таким образом, задача совершенствования методов выявления агрегатов a-syn в периферических тканях весьма актуальна как с теоретической, так и с практической точки зрения.

Целью исследования была отработка оптимальных условий иммуногистохимического выявления фосфорили-рованного a-syn в биопсийном материале слюнных желез человека (n = 7).

Материал и методы

Объектом исследования служили нервные волокна в биоптатах слюнных желез человека, которые фиксировали в 10% нейтральном формалине, промывали проточной водой, затем часть образцов дегидратировали для заливки в парафин, сравнивая два варианта проводки - через хлороформ и изопропанол [36]. Парафиновые срезы толщиной от 10 до 40 мкм готовили на санном микротоме Leica SR2000. Первую партию образцов делили на две части, одну часть проводили по вышеописанной методике, другую - через 15 и 30% растворы сахарозы, а затем пропитывали средой O.C.T. (Tissue-Tek), после этого образцы замораживали и раскладывали на срезы при помощи замораживающего микротома (Sakura Tissue-Tek). В работе использовали мо-ноклональные мышиные антитела к фосфорилированному a-syn (a-syn-p129) двух разных производителей - Wako и BioLegend. Для работы на световом микроскопе светлого поля использовали полимерную систему двойной детекции MultiVision TL-012-MARH (Thermo Fisher) и отдельный набор для пероксидазного метода детекции EXTRA 3 Kit (Sigma). Для флюоресцентной микроскопии в качестве вторичных антител брали меченные флюорохромами антитела фир-

мы Sigma - sab4600060 (CF555) и sab4600045 (CF488). Для раскрытия эпитопа антигена проводили демаскировку, используя разные способы обработки срезов: их нагревание в кислом и щелочном буферных растворах (цитратный буфер, pH 6,0, и буфер Трис-ЭДТА, pH 9,0-9,2) в условиях микроволнового излучения (600 Вт, до 10 мин); проводили также обработку в концентрированной муравьиной кислоте с разной длительностью воздействия.

С целью верификации результатов иммунной реакции для каждого типа обработки использовали срезы среднего мозга человека на уровне черной субстанции. Выявление телец и нейритов Леви служило критерием удачно проведенной реакции.

При подготовке образцов к заливке в парафин наилучшие результаты были получены с применением изопропи-лового спирта (табл. 1). В работе с парафиновыми и крио-томными срезами мы отдали предпочтение первым, так как на криотомных срезах наблюдается высокий уровень неспецифического окрашивания в слюнной железе при использовании антител, меченных щелочной фосфатазой. При сравнении разных наборов детекции полимерный набор (с включением модификаций MARH и MHRA) продемонстрировал наибольшие чувствительность и воспроизводимость результатов (см. табл. 1).

Условия демаскировки антигена существенно влияли на связывание антител фирмы Wako, тогда как антитела фирмы BioLegend были менее чувствительны к способу предварительной обработки материала (табл. 2). Если демаскировку антигена не проводили, то антитела от обоих производителей демонстрировали слабую иммунореак-тивность. Демаскировка антигена в кислой среде была более эффективна, чем в щелочной, при этом антитела фирмы Wako давали лучшие результаты (см. табл. 2).

Результаты обработки срезов концентрированной муравьиной кислотой в значительной степени зависят от длительности обработки: так, при инкубации срезов на

Таблица 2. Влияние условий обработки на выявление фосфорилированного а-вуп разных производителей

Производитель Вариант гистологической проводки Процедура восстановления антигена Система детекции Разведение первичных антител Оценка результата

BioLegend Изопропиловый спирт Цитратный буфер, рН 6,0 IF 1 : 500 +

Читайте также: