Пцр коронавируса covid 19
Заболевание COVID-19 развивается настолько быстро (иногда в течение нескольких часов на 3-5 сутки после начала заболевания), что Минздрав разрешил медикам ставить диагноз по характерной клинической картине, без лабораторных подтверждений и проведения тестов.
Как заявил министр здравоохранения Михаил Мурашко в программе "Вести" на телеканале "Россия 1", врачи уже работают по новому алгоритму: если при госпитализации в стационар у пациента нет результатов теста, но при обследовании в приемном отделении выявляются признаки пневмонии и характерные клинические проявления COVID-19, то его лечат как больного с коронавирусом.
Если этого не сделать, то у большинства больных из тех, кто поздно обратился к врачам, возникают серьезные проблемы, вплоть до летальных исходов. Поэтому крайне важно начинать лечение уже при первых симптомах, опираясь не на тесты, а клиническую картину в сочетании с данными компьютерной томографии или рентгена.
Накануне московские врачи предложили объединить в одну систему больницы для лечения COVID-19 и пневмонии, так как резко выросло число пневмоний без лабораторных подтверждений коронавируса. Виной тому невысокий процент точности тестов на SARS-CoV-2 и значительная доля ложноотрицательных результатов.
Минздрав: до 30% ПЦР-тестов на COVID-19 могут дать ложноотрицательный результат
Департамент здравоохранения Москвы на днях признал низкую точность тестов на COVID-19, в связи с чем существуют высокие риски тяжелых форм заболевания.
8 апреля Департамент здравоохранения Москвы предупредил медучреждения столицы о большом количестве ошибочных результатов тестов, которые говорят об отсутствии коронавируса у пациентов. В письме главы департамента Алексея Хрипуна отметается, что в связи с этим существуют высокие риски развития тяжелых форм заболевания. Он рекомендовал отправлять больных с пневмонией на компьютерную томографию при подозрении на осложнения, назвав единственным достоверным анализом сочетание КТ и клиническую картину заболевания.
Развитие осложнений может происходить стремительно, иногда в течение нескольких часов, чаще на 3-5 сутки от начала заболевания. А "наличие отрицательных результатов мазков на COVID-19 у пациентов с признаками респираторного заболевания не позволяет полностью исключать новую коронавирусную инфекцию и скоротечного развития осложнений".
По словам главы Департамента здравоохранения Москвы, КТ и рентгенография - важнейшие методы комплексной диагностики коронаровирусной инфекции, так как тяжелые случаи заболеваний и смертей от COVID-19 связаны с развитием у пациентов вирусных и бактериальных (вторичных) пневмоний.
Около 20-30% существующих ПЦР-тестов для выявления коронавирусной инфекции COVID-19 дают ложноотрицательный результат. То есть треть инфицированных граждан, прошедших тестирование, могут получить ложное подтверждение, что они здоровы, хотя на самом деле они заражены.
О большом количестве ложноотрицательных результатов при ПЦР-тестах сообщил и главный внештатный пульмонолог Минздрава РФ Сергей Авдеев. Выступая 7 апреля на конгрессе "Человек и лекарство", он заявил, что точность существующих ПЦР-тестов для выявления новой коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 не более 70-80%. Он сослался на результаты исследования с участием 1,4 тыс. пациентов. У 300 из них был отрицательный лабораторный тест на SARS-CoV-2, но результаты компьютерной томографии легких показывали изменения, характерные для новой коронавирусной инфекции.
"Таким образом, наиболее чувствительным тестом для диагностики больных COVID-19 является компьютерная томография легких. Чувствительность методов КТ выше, чем методов ПЦР-диагностики", - цитирует врача портал "Медвестник".
Именно поэтому медики предложили изменить маршрутизацию пациентов: если при помещении в стационар у них еще нет результатов теста, но были выявлены КТ-признаки пневмонии COVID-19, то таких пациентов госпитализируют в стационар и ведут как больных с коронавирусной инфекцией.
Письмо руководителя департамента здравоохранения Москвы, где он прямо пишет: наши тесты фигня, они ничего не выявляют pic.twitter.com/Y2tk2s7c9M
"Никогда такого не видела": пациент с тобой разговаривает, а легких у него уже нет
Главной опасностью коронавирусной инфекции COVID-19 является поражение органов дыхания человека. У пациента за считанные часы может развиться легочная недостаточность, нередко со смертельным исходом.
В 30% случаев тесты показывают ложноотрицательный результат, поэтому отличить COVID-19 от других инфекций с уверенностью можно только после комплексного обследования: теста на конкретный коронавирус, КТ легких и клинического анализа крови.
Как рассказала кардиолог-реаниматолог Ирина Ильенко, работающая в московской ГКБ N15 им. Филатова, переоборудованной под лечение пациентов с коронавирусом, больные с COVID-19 в разы тяжелее тех, с которыми ей приходилось работать раньше.
"Сейчас половина в моем отделении уже на искусственной вентиляции легких, вторая - потенциальные кандидаты на нее. Людей привозят на скорых из дома, из других стационаров - могут 100 человек в сутки привезти, могут 200. Кого-то - уже подключенными к аппарату искусственной вентиляции. На днях осматривали женщину лет 50-60 с Covid-19 без тяжелой сопутствующей патологии, она на кислородной маске, но особо не жалуется: "Да, тяжеловато дышать, но ничего, терпимо". Разговаривает. По рентгену - небольшая пневмония, не критично. Мы таких пациентов на живот на несколько часов переворачиваем, чтобы спина дышала, раздыхивались отделы, которые зажимаются, когда человек на спине лежит. У нас приборчик есть, на палец надевается, мы по нему насыщение крови кислородом смотрим".
"Показаний для искусственной вентиляции нет. Но буквально на глазах показания эти меняются, а пациентка вроде как так же, особо не жалуется. Везем ее на КТ. Смотрим результаты томографии - а там легких нет! В труху! И я теперь понимаю, почему ковидные, у кого пневмония, умирают один за другим! Они с тобой разговаривают, а легких у них уже нет! И они все такие! И это так страшно! Женщину перевели тут же на ИВЛ, не знаю, выживет ли. Я более 20 лет в реанимации работаю, но что происходит сегодня - такого не видела никогда", - приводит рассказ врача портал "Правмир".
Согласно руководству ВОЗ, анализы на вирус SARS-CoV-2 должны проводиться:
- Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Это самый точный и надежный метод диагностики вирусной инфекции, который позволяет обнаружить даже очень небольшое количество генетического материала (РНК) вируса в биологическом материале человека. Предпочтительно брать мазок из ротоглотки или носоглотки, потому что в кале и крови вирусов меньше.
- В лаборатории с уровнем биологической безопасности 2 (BSL-2). Всего существует четыре уровня безопасности. На первом уровне требования минимальные, на четвертом — самые строгие. В лабораториях с уровнем безопасности BSL-2 исследуют микробов, представляющих умеренную опасность для сотрудников лаборатории и для окружающей среды.
ПЦР-анализ с обратной транскрипцией на SARS-CoV-2 можно провести только в лабораторных условиях, потому что для него требуется набор реактивов и лабораторное оборудование. Для этого нужны:
- микроцентрифуга,
- мешалка,
- детекторный модуль ПЦР в реальном времени с реакционным модулем амплификатора.
Но даже если в конце концов экспресс-тесты на основе ИФА и появятся, они будут уступать лабораторной ПЦР и в точности, и в скорости определения заражения вирусом. ИФА-тест обнаруживает не генетический материал вируса, а антитела — иммунные белки, которые организм вырабатывает к вирусу. Чтобы организм успел выработать антитела, с момента заражения должно пройти около недели. Если сделать ИФА-тест раньше, он не покажет заражения, даже если в организме у человека уже есть вирус SARS-CoV-2.
Где делают тест. В Европе, Великобритании и Австралии тесты делают в любой лаборатории с уровнем безопасности BSL-2, в которой есть оборудование для ПЦР-реакции с обратной транскрипцией и реактивы, которые необходимы для поиска РНК вируса SARS-CoV-2. В США тесты делают в лабораториях Центра по контролю и профилактике инфекционных заболеваний (CDC) и в государственных лабораториях общественного здравоохранения. Тест проводится в соответствии с протоколом, принятым в конкретной стране.
Принцип действия теста. В США и других странах для анализа берут мазок с задней стенки глотки, образец слюны или жидкости из нижних дыхательных путей (то есть мокроты). Затем образец доставляют в лабораторию и выделяют из него рибонуклеиновую кислоту (РНК), содержащую геном вируса. Затем к смеси реагентов добавляют фермент, который превращает РНК в ДНК — это и есть обратная транскрипция. После этого вирусную ДНК копируют миллионы раз и ищут в ней участок, соответствующий геному SARS-CoV-2. Если такой участок есть, анализ признают положительным.
Точность. Тест способен обнаружить 0,3–3 копии вирусной РНК в микролитре (0,001 мл).
Сроки. 24–48 часов.
Сколько сделано анализов. По данным CDC, на 16 марта 2020 года в США на SARS CoV-2 было проверено: в лабораториях CDC — 4 тыс. 255 анализов; в 48 государственных лабораториях — 20 тыс. 907 анализов. Анализы начали делать 18 января 2020 года.
Цена. Тестирование оплачивает государство. Сдать анализ на SARS-CoV-2 в частной лаборатории за деньги нельзя.
Это соответствует уровню безопасности BSL-3. Пример микроба, с которым обычно работают в лаборатории BSL-3 — Mycobacterium tuberculosis, то есть бактерии, вызывающие туберкулез. Получается, что в нашей стране для работы с коронавирусом лаборатории нужен почти что самый высокий уровень биологической безопасности из возможных — BSL-3. Это притом что большинство российских лабораторий, как и везде в мире, имеет уровень безопасности BSL-2. (Дополнение от 17.03.2020, 18:27 мск: в этот фрагмент внесены изменения, уточнена информация об уровнях безопасности лабораторий.)
Принцип действия теста. Как и за рубежом, анализ проводят методом ПЦР-реакции с обратной транскрипцией.
- реагент-1, прозрачная бесцветная жидкость, 0,70 мл, 1 пробирка;
- реагент-2, прозрачная бесцветная жидкость, 1,20 мл, 1 пробирка;
- положительный контроль (ПКО), прозрачная бесцветная жидкость, 0,20 мл, 1 пробирка;
- отрицательный контроль (ОКО), прозрачная бесцветная жидкость, 0,20 мл, 1 пробирка;
- эксплуатационная документация: инструкция по применению и паспорт.
Точность. ТАСС сообщает, что тест позволяет обнаружить 50–500 вирусных частиц в образце.
Цена. Тестирование оплачивает государство. Сдать анализ на SARS-CoV-2 в частной лаборатории за деньги нельзя.
Россия готовится к тотальному тестированию, новые тест-системы позволяют быстро провести масштабную проверку на вирус. К массовому выпуску приступил один из разработчиков нового продукта, два других начинают производство. Олег Гусев, ведущий научный сотрудник Научно-клинического центра прецизионной и регенеративной медицины Казанского федерального университета и института физико-химических исследований RIKEN (Япония) помог РБК Тренды разобраться в том, как устроено тестирование на коронавирус в России и в мире.
Что предлагает ВОЗ
Глава Всемирной организации здравоохранения Тедрос Гебреисус еще в середине марта призвал страны проводить как можно больше тестов на вирус, который вызывает заболевание SARS-CoV-2, даже людям без симптомов. Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Как говорится в рекомендациях, на сегодня это самый точный и надежный метод диагностики вирусной инфекции. Он позволяет определить даже очень небольшое количество РНК вируса в биологическом материале человека. Это помогает выявить болезнь в инкубационном периоде.
Изобретенный в 1983 году метод и сейчас считается фундаментальным в молекулярной диагностике. Американский ученый, который придумал способ значительного увеличения малых концентраций фрагментов ДНК в биологической пробе, получил за него Нобелевскую премию. Выявление ДНК/РНК методом ПЦР позволяет диагностировать такие заболевания, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие. Метод используют в археологии, криминалистике, генетике.
Как работает ПЦР-тест
Для анализа из физиологических жидкостей извлекают одноцепочечную РНК, моделируют на ее основе двуцепочечную ДНК и многократно дублируют с помощью специального фермента (полимеразы). Увеличение числа копий ДНК называется амплификацией. В результате концентрация определенных фрагментов ДНК/РНК в биологическом образце, изначально минимальная, значительно увеличивается. При исследовании копируется только необходимый для теста участок ДНК. И, конечно, дублирование происходит только в том случае, если искомый участок вирусной ДНК или РНК присутствует в исследуемом биоматериале. В случае с коронавирусом мазок для анализа берут из ротоглотки или носоглотки, поскольку в крови или в кале вирус появляется на более продвинутой стадии болезни.
Тест-система EMG — продукт совместной разработки российских и японских разработчиков, проводившейся с 2016 года, рассказывает Олег Гусев. На данный момент эти тесты включены в систему обязательного медицинского страхования в Японии.
В ближайшее время планируется производить до 2,5 млн. тестов и 1 тыс. портативных лабораторий в неделю. Сами тесты, как и многие реагенты производятся в России. Планируется, что цена на тесты EMG будет в среднем в пять раз меньше, чем на стандартные ПЦР-тесты в Европе.
Российско-японские тесты основаны на методе изотермальной молекулярной диагностики SmartAmp, превосходящем метод ПЦР по скорости работы в восемь раз, а переносная лаборатория позволяет тестировать до 20 пациентов в час, говорит Гусев.
Ключевое отличие теста EMG в том, что многие тесты, которые производятся сейчас, это тесты ИФА (имунноферментный анализ), а не ПЦР. Данные системы определяют антитела, которые организм начинает вырабатывать не ранее, чем через неделю после заражения. Российско-японская разработка позволяет получать результат уже за 30 минут, с точностью, равной почти 100%. Кроме того, тест EMG позволяет определить наличие вируса уже на самых ранних стадиях, в то время как другие системы диагностики короновируса обладают меньшей чувствительностью и не могут выявлять вирус на ранней стадии инфицирования.
Принцип технологии российско-японского теста, по сути, не отличается от классической ПЦР — это наращивание количества целевых фрагментов ДНК и их детекция. Однако в изотермической амплификации, в отличие от классической ПЦР, где необходимы циклы нагрева и охлаждения, все происходит при одной температуре. Это позволяет многократно увеличивать скорость реакции. Метод SmartAmp был изобретен более 15 лет назад (как и LAMP — другая популярная технология изотермальной амплификации, предшествующая SmartAmp). Впервые для инфекционных заболеваний эту технологию применили в 2009 году для быстрого выявления пандемического гриппа (H1N1) в Японии.
Повторные тесты необходимы при любом методе. Отрицательный тест на COVID-19 не гарантирует, что человек не заразится этим вирусом на следующий день. Поэтому, например, в японских лабораториях персонал тестируют каждые несколько дней. Повторный тест нужен и для того, чтобы подтвердить, что человек излечился.
Эта тест-система будет использоваться для диагностики COVID-19 не только в России и Японии. 40 тыс. тестов закупила Австрия, поступили заказы из других стран Европы, Ближнего Востока, и Латинской Америки. Подана заявка в Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) для поставок в эту страну.
На данный момент в России прошли регистрацию еще три теста на коронавирус.
По некоторым данным, в Москве проводится около 700 тестов на коронавирус в сутки. В планах у московских властей увеличить этот показатель до 10 тыс. тестов в сутки, а затем довести его до 25—28 тыс. тестов ежедневно.
Новые разработки за рубежом
Компания Bosch выводит на рынок свой тест на коронавирус, который сначала будет доступен в Германии, а вскоре появится в других странах. В его основе лежит диагностический аппарат Vivalytic, который, по словам изготовителей, станет первым автоматизированным тестом на COVID-19. Тест распознает не только коронавирус, но еще шесть респираторных заболеваний, например, вирусы гриппа А и B. Во время лабораторных испытаний аппарата его точность составила 95%.
Как пишет издание ZME Science, анализ может проводиться прямо в стационаре или медицинском центре — не нужно отправлять образцы в лабораторию и ждать, пока придет ответ. Врачи смогут быстрее идентифицировать и изолировать зараженных, а пациентам не придется пребывать в неизвестности несколько дней. Тест прост в обслуживании и не требует специальной подготовки. Медперсоналу нужно только взять мазок из носа или горла пациента, нанести его на картридж, содержащий реагент, и вставить картридж в анализатор. Каждый аппарат может выполнять до десяти анализов за 24 часа.
Еще более оперативный тест на COVID-19 разработали в Великобритании. Он позволяет выявить COVID-19 всего за 30 минут. Чтобы провести его, достаточно портативного оборудования стоимостью около $120 и набора полосок для мазков из носа и горла по $5 каждая. Одновременно проходить тест могут до шести человек.
FDA в экстренном порядке одобрило сверхбыстрый тест на коронавирус, разработанный калифорнийской компанией Cepheid. С его помощью диагноз можно будет поставить всего за 45 минут. Как отмечает Business Insider, для обработки результатов теста не требуется специальное обучение. Нужен лишь доступ к системе Cepheid GeneXpert — в США их 5 тыс., а по всему миру — 23 тыс.
Начало тотального тестирования людей на COVID-19 во всем мире — хорошая новость как для людей, так и для национальных органов здравоохранения. До сих пор в мире нет четкого представления о том, сколько людей заражены коронавирусом и выявление тех, у кого он уже есть: их госпитализация или отправка на домашний карантин позволит быстрее оценить масштаб угрозы и вовремя принять правильные меры.
Вирус SARS-CoV-2 (желтый), изолированный у пациента в США, на поверхности культивируемых клеток. Сканирующая электронная микроскопия.
В последнюю неделю много говорят о том, что число случаев инфекции новым коронавирусом (теперь для него предложено название SARS-CoV-2) может быть недооценено сейчас и способно существенно вырасти в будущем.
Показатель летальности пока ниже, чем у SARS и MERS (вероятно, около 2%), но при широком распространении инфекции и число умерших может быть значительным. Большинство экспертов считают, что репродуктивное число R0 не достигает четырех (то есть один заболевший в незащищенной популяции может заразить двух-трех человек). Инкубационный период может составлять от 2 до 11 дней, среднее — 6,4. О том, может ли он превышать две недели (срок карантина во многих странах), а также о возможности заразиться от бессимптомного носителя все еще идут споры. Если инфицирована беременная женщина, вирус, по-видимому, не передается плоду.
Отслеживаются пути трансмиссии вируса в других странах. Сообщалось о передаче вируса немецкому бизнесмену от китайского делового партнера. В Таиланде водитель такси заразился SARS-CoV-2, возможно, от китайских туристов, обратился за медицинской помощью только через три дня после появления симптомов (20 января), а верный диагноз был поставлен только на восьмой день; к счастью, уже 5 февраля больного выписали, и он не заразил никого из тех, с кем регулярно общался. Описан также случай передачи инфекции на Тайване от жены к мужу (женщина посещала Ухань). В Таиланде сейчас зарегистрировано 33 случая, на Тайване 18, в Германии 16.
Аналогичные меры принимает Евросоюз. В Европейской экономической зоне 38 лабораторий могли бы выполнять тест на коронавирус, все вместе более 8000 тестов в неделю, и этот показатель можно увеличить. У стран-членов Евросоюза пока нет единого мнения, ограничивать ли въезд из Китая или достаточно тщательного контроля в аэропортах.
Жесткие карантинные меры представляются обоснованными. Моделирование эффективности температурного скрининга в аэропортах показывает, что не будут обнаружены около 46% инфицированных пассажиров (95%-ный доверительный интервал — 36–58%).
Одна из причин для беспокойства — нехватка тестов и, возможно, их недостаточная точность. Некоторые государственные лаборатории общественного здравоохранения в США заявили, что новые тест-наборы на коронавирус 2019-nCoV (SARS-CoV-2), отправленные Центрами по контролю и профилактике заболеваний, при валидации дали неубедительные результаты; вероятно, придется заменить один из реагентов. Об этом CDC сообщили 12 февраля. CDC начал на прошлой неделе поставку около 200 комплектов в лаборатории США (каждый комплект может тестировать около 700-800 образцов пациентов), и такого же количества — в другие страны.
Работы по созданию вакцины ведутся. В Китае вакцина на основе мРНК тестируется на мышах. Однако испытания на людях удастся начать, очевидно, не раньше лета, и необходимо думать о лечении.
Очевидно, что для снижения смертности необходимо бороться с тяжелыми клиническими синдромами и осложнениями: дыхательной недостаточностью, вторичными инфекциями, сердечной и почечной недостаточностью. По этому поводу есть рекомендации, и ВОЗ, и национальные, но обсуждения продолжаются: например, назначать ли кортикостероиды при тяжелой пневмонии.
В качестве мишеней специфических средств против SARS-CoV-2 чаще всего называют S-белок и протеазу (протеиназу), необходимую для процессинга вирусной репликазы. Как показали немецкие ученые в опытах с частицами вируса везикулярного стоматита, которые несли на себе белок S нового коронавируса, SARS-CoV-2 использует для входа в клетку тот же рецептор, что и SARS, — ACE2 (статья опубликована на BioRxiv). (О S-белке SARS-CoV-2, который связывается с клеточным рецептором ACE2, сейчас опубликовано множество статей, одна из самых свежих — от 11 февраля.)
Те же немецкие ученые продемонстрировали, что проникновение вируса в клетку блокирует ингибитор клеточного фермента — протеазы TMPRSS2, то есть мишенью может быть белок не только вируса, но и хозяина. Что примечательно, проникновение гибридных вирусных частиц в клетки подавляла также сыворотка крови пациента, выздоровевшего после атипичной пневмонии (SARS). (Кросс-реактивность антител к белкам возбудителя атипичной пневмонии SARS-CoV и SARS-CoV-2 возможна, поскольку между белками есть значительное сходство, однако нельзя гарантировать, что из антител против SARS-CoV получатся хорошие лекарства.)
Тем не менее логично использовать против COVID-19 уже существующие противовирусные препараты, для которых по крайней мере доказана безопасность и не понадобятся длительные клинические испытания. Это, например, ремдесивир, лопинавир/ритонавир, интерферон бета-1b, рибавирин.
Клинические испытания ремдесивира (Gilead Sciences) против SARS-CoV-2 начались в Китае 6 февраля. До этого в опытах in vitro (с инфицируемыми вирусом клеточными культурами) было показано, что ремдесивир и хлорохин наиболее успешно подавляют SARS-CoV-2. Ремдесивир ранее использовался как лекарство против лихорадки Эбола (хотя два новых препарата в этом году показали лучшие результаты). Очень хорошо ремдесивир и родственные ему соединения проявили себя против высоколетального коронавируса, правда, не человеческого, а кошачьего — возбудителя вирусного перитонита кошек.
Еще вариант — терапия антителами. Против вируса можно использовать не только моноклональные антитела, например, к рецептор-связывающему домену S-белка, но и поликлональные (к разным вирусным эпитопам), полученные от животных, которых иммунизировали вирусными белками. Последний способ хорош тем, что терапию можно получить быстро.
Агентство Синьхуа сообщило со ссылкой на компанию China National Biotec Group об использовании продуктов крови (плазмы и иммуноглобулинов) пациентов, выздоровевших после COVID-19, для лечения более десятка больных в тяжелом состоянии. Через 12-24 часа состояние пациентов существенно улучшилось. Минус этой терапии при массовом применении очевиден: опасность инфекции каким-либо другим вирусным патогеном. В данном случае представители компании заверяют, что плазму крови тщательно проверяли на отсутствие вирусной активности, тем не менее это дополнительный риск.
Конечно, идет активный поиск потенциальных лекарств in silico, методами компьютерного моделирования (результаты пока в основном в виде препринтов). В работе корейских исследователей наилучшие шансы на ингибирование вирусной протеазы показали атазанивир, эфавиренц, ритонавир и долутегравир. Недавно на BioRxiv появилась еще одна публикация на ту же тему, где наилучшими оказались бортезомиб, флуразепам и понатиниб ; в других работах были отмечены как перспективные противовирусный препарат нелфинавир , а также прулифлоксацин, биктегравир, нелфинавир, тегобувир . Есть статья о потенциальных ингибиторах уже упоминавшейся клеточной протеазы TMPRSS.
— Первый вопрос: а как вообще выглядит тест на коронавирус? Экспресс-тест на ВИЧ мы все видели: белая лопаточка с ручкой и пробирка с реагентом. Через 15 минут готов результат. Новый коронавирус тестируется по методу полимеразной цепной реакции (ПЦР). Насколько вообще его сложно производить?
— Выглядит тест на коронавирус как пробирки с прозрачными жидкостями в коробочке или пакетике, как-то так. Но чтобы провести саму реакцию и получить результат, нужно еще специальное оборудование.
Производить тест умеренно сложно, это высокие технологии, но очень хорошо отлаженные за много лет. Ограничения — как на любом производстве: реагенты и материалы, производственные мощности и должная культура производства — не надо объяснять, что будет, если чихнуть в пробирку, — плюс кадры. Каких объемов реально достигнуть — зависит от того, какие мощности будут задействованы: если, например, какие-то линии, которые сейчас производят ПЦР-тесты для других инфекционных заболеваний, волевым решением перебросить на SARS-CoV-2, производство возрастет.
— Почему сейчас тестируют коронавирус именно по методу ПЦР, а не иммуноферментного анализа, например, как ВИЧ? С ИФА диагностика была бы быстрее, дешевле? Или это вообще не имеет значения?
За подробностями лучше обратиться к специалистам в области молекулярной диагностики. Но, на мой взгляд, ПЦР с обратной транскрипцией, а именно он используется в случае с COVID-19, — хороший метод. Для ПЦР-тестов характерна высокая чувствительность. В их основе лежит амплификация нуклеиновой кислоты, то есть даже при малом количестве копий в образце можно получить хороший сигнал. Кроме того, для разработки таких тестов нужен, по большому счету, только геном вируса или часть генома.
— По факту ПЦР-тесты для COVID-19 появились почти сразу после того, как китайцы опубликовали расшифровку генома вируса. То есть для того, чтобы начать их разработку, не нужно было никаких образцов, хватило журнальной публикации и специалистов, способных быстро разработать технологию.
— Да. В том и прелесть ПЦР-теста, что для него достаточно генома вируса. Зимой, как только первый геном был опубликован, специалисты во всех странах начали заказывать синтез генетического материала nCoV-19. Зная нуклеотидную последовательность генома, в лаборатории можно получить участок этого генома и дальше экспериментировать уже с ним. В частности, проверить чувствительность и специфичность теста, используя вместо клинических образцов растворы ДНК.
В январе у ученых большинства стран вообще и не было другого выхода, настоящие пациенты имелись только в Китае. К такому методу могут быть претензии. Например, если чувствительность теста проверяется по растворам кДНК, не учитываются потери при обратной транскрипции. Тут разные другие тонкости. Но в целом ученые сработали очень оперативно.
КАК УСТРОЕН МЕТОД ПЦР?
ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это метод тестирования, который способен находить генетический материал вируса непосредственно в крови пациента, слюне или любой другой жидкости, изобретенный в 1983 году американским биохимиком Кэрри Муллисом.
Как это работает?
Сначала вирусную ДНК выделяют из материала, представленного в лабораторию, денатурируют: на этом этапе двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C, чтобы цепи ДНК разошлись. Затем добавляют так называемые праймеры — начальные звенья цепочки, которые необходимы для старта синтеза новой копии, и так называемую полимеразу — тот самый фермент, который и будет заниматься репликацией ДНК.
Как правило, для лабораторной ПЦР используются ДНК-полимеразы из термофильных бактерий, поскольку в течение реакции смесь многократно охлаждают и нагревают. На следующем этапе в смесь из ДНК, полимеразы и праймеров добавляются нуклеотиды — то есть строительный материал для воспроизводства, после чего емкость с нею нагревается до 37°C, и процесс запускается.
На последующей стадии элонгации полимераза начинает синтез на каждой из двух цепочек разделенной ДНК недостающей пары. Происходит это по принципу комплементарности: фермент присоединяет напротив каждого нуклеотида, из которых состоят ДНК, противоположный. По завершении реакции цикл неоднократно повторяется (см. видео ниже).
Ингибиторы обратной транскриптазы — одни из самых распространенных видов лекарств от ВИЧ-инфекции. К ним относятся, например, зидовудин и ламивудин — самые первые препараты АРВТ, разработанные еще в 80-х.
Производится ПЦР на специальных приборах, амплификаторах, или так называемых термоциклерах (Thermal cycler).
Наглядно, как работает метод ПЦР, можно посмотреть на приведенном ниже видео.
— Что касается ИФА-тестов для коронавируса, их разработать так и не успели?
— Почему? Тесты на определение антител к антигенам SARS-CoV-2 в крови существуют. У теста на антитела свои преимущества. Но я бы сказала так: они с ПЦР-тестом дополняют друг друга. Тест на антитела лучше работает на поздних стадиях. Антитела в крови сохраняются и тогда, когда вирус исчезает из организма, то есть с помощью такого теста можно узнать, кто переболел COVID-19 в прошлом.
— Даже если у пациента не было выраженных симптомов и дело обошлось без госпитализации?
— А что за организации, кто в нашей стране занимается этими тестами? Роспотребнадзор?
У каждого теста есть погрешность. При низкой заболеваемости ложноположительных результатов может быть намного больше, чем выявленных реальных пациентов, даже если тест вполне хороший.
На первом заседании координационного совета по борьбе с коронавирусом вице-премьер РФ Татьяна Голикова сказала, что правительство ждет от регионов предложений о том, на базе каких еще лабораторий можно будет проводить эти исследования. Частные компании тоже смогут делать тесты на коронавирус на платной основе. Возможно, в самом скором времени будет новая информация о том, как все это будет происходить.
— На 15 марта появилась информация, что в России было произведено почти 110 тысяч тестов на коронавирус. Это много для наших масштабов или мало?
— По поводу возможности произвести достаточное количество тестов — тут много вопросов: производственные мощности, которыми мы располагаем, количество реагентов, которые понадобятся, наконец, лаборатории с необходимой техникой и обученным персоналом, где эти тесты проводить. Мало нам будет пользы и от миллиона тестов, если не хватит рук, чтобы эти тесты запускать. Все эти вопросы надо исследовать.
Читайте также: