Ифа тест система корь

Иммуноферментный анализ (ИФА) — метод лабораторной диагностики, позволяющий обнаруживать специфические антитела и антигены при самых разных патологиях.

ИФА — один из самых распространенных и точных методов для выявления инфекций, передающихся половым путем, в частности ВИЧ, ВПЧ, гепатита В.

Для того чтобы результаты анализов были максимально достоверными, необходимо правильно подготовиться к их сдаче.

Спецпредложения, скидки и акции помогут существенно сэкономить на медицинском обследовании.

Контроль качества лабораторных исследований, осуществляемый по международным стандартам, — дополнительная гарантия точности результатов анализов.

Современная диагностика в медицине немыслима без высокочувствительных лабораторных анализов. Прежде для установления причин тех или иных симптомов врачи были вынуждены ориентироваться на косвенные признаки болезни, а также проводить многоступенчатые микроскопические исследования в попытке обнаружить возбудителя инфекции. Сегодня достаточно одного-единственного теста — такого как иммуноферментный анализ — чтобы подтвердить или опровергнуть первоначальный диагноз.

Основные понятия и принцип метода иммуноферментного анализа

Существует несколько разновидностей антител, каждая из которых вступает в действие на определенном этапе иммунного ответа. Так, первыми в ответ на проникновение антигена в организм синтезируются иммуноглобулины класса М (IgM). Содержание этих антител наиболее высоко в первые дни инфекционного процесса.

Следом за ними иммунная система выбрасывает в кровь иммуноглобулины класса G (IgG), которые помогают уничтожать антигены до полной победы над инфекцией, а также продолжают циркулировать по сосудам в дальнейшем, обеспечивая иммунитет к повторному заражению. На этом явлении основана вакцинация: благодаря прививкам, содержащим ослабленные антигены микробов и вирусов, в нашей крови появляется большое количество IgG, которые при контакте с реальной угрозой быстро подавляют инфекцию — до того, как она нанесет вред здоровью.

Как узнать, какие именно антигены или антитела присутствуют в организме человека? Когда врач предполагает, что причиной заболевания является определенная инфекция, или желает измерить концентрацию определенного гормона, он назначает пациенту иммуноферментный анализ.

ИФА бывает качественным и количественным. В первом случае подразумевается однозначный ответ: искомое вещество или найдено, или не найдено в образце. В случае с количественным анализом более сложная цепь реакций дает возможность оценить концентрацию антител в крови человека, что в сравнении с результатами предыдущих тестов даст ответ на вопрос о том, как развивается инфекционный процесс.

Бесспорные преимущества ИФА — высокая чувствительность и специфичность метода. Чувствительность — это возможность распознать искомое вещество, даже если его концентрация в образце невысока. Специфичность же подразумевает безошибочность диагностики: если результат положительный, значит, найдены именно те антитело или антиген, которые предполагались, а не какие-то другие.

Высокая степень технологичности проведения иммуноферментного анализа минимизирует влияние человеческого фактора, что снижает вероятность ошибки. Большинство используемых в современных лабораториях тест-систем и реактивов для ИФА выпускаются в промышленных условиях, что гарантирует точный результат.

В случае диагностики инфекционных заболеваний иммуноферментный анализ не может найти возбудителя и определить его специфичные свойства: он лишь указывает на наличие антител в крови у больного, косвенно свидетельствующих о присутствии чужеродного микроорганизма в теле человека.

ИФА — крайне точный, но не дешевый метод, поэтому обращаться к нему нужно с умом, а интерпретацией результатов должен заниматься квалифицированный врач.

Невозможно охватить полный список показаний к проведению ИФА. Вот наиболее распространенные цели анализа:

1. Диагностика острых и хронических инфекционных заболеваний:
   • IgM и IgG к вирусным гепатитам А, B, C, E, а также антигенов гепатитов В и С;
   • IgG к ВИЧ;
   • Ig M и IgG к цитомегаловирусной инфекции;
   • Ig M и IgG к вирусу Эпштейна-Барр;
   • Ig M и IgG к герпетическим инфекциям;
   • Ig M и IgG к токсоплазмозу;
   • Ig M и IgG к кори, краснухе, сальмонеллезу, дизентерии, клещевому энцефалиту и другим заболеваниям;
   • IgG к паразитарным заболеваниям;
   • Ig M и IgG к инфекциям, передающимся половым путем;
   • IgG к хеликобактерной инфекции.
2. Общая оценка показателей иммунитета человека и маркёров некоторых аутоиммунных заболеваний.
3. Выявление онкологических маркёров (фактора некроза опухоли, простатспецифического антигена, раково-эмбрионального антигена и других).
4. Определение содержания гормонов в сыворотке крови (прогестерона, пролактина, тестостерона, тиреотропного гормона и других).

Основной биоматериал для проведения ИФА — это сыворотка крови: в лаборатории у пациента берут образец крови из вены, из которого в дальнейшем удаляют форменные элементы, затрудняющие проведение анализа. В некоторых других случаях для анализа используется спинномозговая жидкость, околоплодные воды, мазки слизистых оболочек и т.д.

Для того чтобы избежать искажений в результатах, рекомендуется сдавать кровь натощак, а за две недели до исследования (если целью является диагностика хронических, скрыто протекающих инфекционных заболеваний) необходимо отказаться от приема антибиотиков и противовирусных препаратов.

При наличии необходимых реактивов и хорошей организации работы лаборатории результат анализа вы получите в течение 1–2 суток после забора крови. В некоторых случаях, при необходимости получения экстренного ответа, этот срок может быть сокращен до 2–3 часов.

• IgM — наличие этого класса иммуноглобулинов говорит об остром инфекционном процессе в организме. Отсутствие IgM может говорить как об отсутствии конкретного возбудителя в организме, так и о переходе инфекции в хроническую стадию.
• IgA при отрицательном результате теста на IgM чаще всего свидетельствует о хронической или скрыто протекающей инфекции.
• IgM и IgA (совместное присутствие) — два положительных результата говорят о разгаре острой фазы заболевания.
• IgG говорит либо о хронизации заболевания либо о выздоровлении и выработке иммунитета к инфекционному агенту.

В зависимости от содержания анализа в бланке могут быть представлены данные в виде таблицы с перечислением всех антител или антигенов с пометками об отрицательной или положительной реакции, либо будет указано количественное значение результата (отрицательный, слабоположительный, положительный или резко положительный). Последний вариант определяет, сколько антител содержится в анализируемом образце.

Еще один количественный показатель — индекс авидности антител, выраженный в процентах. Он указывает, сколько времени прошло от начала инфекционного процесса (чем выше индекс — тем больше).

Сегодня выпускаются тысячи видов тест-систем ИФА, позволяющих обнаруживать специфические антитела и антигены при самых разных патологиях. Поэтому этот анализ используется практически во всех медицинских отраслях. Диагноз, поставленный с помощью ИФА, — это гарантия назначения адекватной терапии и эффективного лечения заболевания.

Информативность ИФА делает этот анализ важным инструментом в работе многих медицинских центров. Но можно ли доверять такую диагностику государственным лабораториям или лучше самим выбрать, где провести такое исследование?

Для постановки диагноза корь зачастую необходимо лабораторное подтверждение инфекции. Самое лучшее время для сдачи анализов — первый контакт пациента с врачом. Врача необходимо вызывать на дом, так как корь — это заразное заболевание и поход в поликлинику может стать причиной заражения многих восприимчивых детей и взрослых. Забор материала для исследования может выполнить врач или медсестра, которую доктор может прислать чуть позже.

Стандартом лабораторной диагностики кори в большинстве стран являются серологическое исследование и ПЦР-диагностика.

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Суть метода заключается в идентификации РНК вируса кори в крови, слизи носоглотки/ротоглотки, бронхиальном секрете или моче.

ПЦР-исследование рекомендуется проводить как можно раньше после появления сыпи, так как количество вируса в организме снижается с течением времени. Наиболее информативным является период первых 1—3—7 дней от начала высыпаний [2—5]. В литературе имеются сведения о том, что у некоторых пациентов вирус кори может определяться в носоглоточном секрете до 10—14 дня болезни [5].

Для наиболее точной диагностики рекомендуется производить забор материала из трех разных локусов (кровь, мазок из носоглотки или ротоглотки и моча). Это повышает вероятность правильного диагноза [4,5].

После забора материала для ПЦР (мазок и моча) допустимо его хранение до 1 суток в холодильнике (4 °С), возможно замораживание. Если для исследования используется моча, то ее объем должен быть не менее 10 мл, но лучше 50 мл. Утренняя первая моча содержит максимальное количество вируса [4].

Отрицательный результат ПЦР не исключает диагноза кори [6].

Ложноотрицательный результат может быть получен при позднем заборе материала (более 3—7 дней с момента появления сыпи), предшествующей недавней вакцинации против кори, при нарушениях хранения и/или транспортировки образцов [4,5].

В соответствии с международными рекомендациями при выполнении ПЦР желательно определять генотип вируса кори. Это необходимо для четкого различения происхождения вируса (дикий штамм или вакцинный), учета распространения вируса по земному шару и происхождения очагов/вспышек заболевания [4].

На сегодняшний день известно 24 генотипа вируса кори. Большинство из них вышло из циркуляции, однако менее 10 из них (по данным ВОЗ — 6 [7]) все еще присутствуют на нашей планете [8].

2. Серологический метод.

Метод заключается в определении специфических антител (IgM и IgG) против вируса кори в сыворотке крови.

Для верификации диагноза кори достаточно определить один класс антител IgM или IgG. Каковы особенности анализа?

— IgM.

IgM определяется в крови в течение 1 месяца (28 дней [3]) у больного корью после появления высыпаний. Пик IgM отмечается на 7—10 сутки от момента появления сыпи, а затем количество антител постепенно снижается. Через 6—8 недель от начала сыпи IgM уже может не определяться [9].

Если больной ранее прививался против кори (1 или 2 прививки) то при реинфекции вирусом кори IgM у него может не определяться вовсе или быть повышенным только короткий промежуток времени, который трудно зафиксировать [6].

Отрицательный анализ на IgM не исключает наличие заболевания у ранее привитых.

В некоторых случаях у ранее не привитых пациентов IgM может быть ложноотрицательными (около 20—25% проб). Это характерно для образцов, взятых в первые 72 часа от начала появления сыпи. Дело в том, что концентрация антител в первые дни болезни еще мала и недостаточна для определения [10,11].

Если результат был отрицательным и сыпь присутствует более 72 часов должен быть выполнен повторный анализ (допустимо выполнить анализ до 10 дня болезни) [6].

Кроме того, ложноотрицательный результат может быть получен, если анализ выполнен позже 28 дней с момента появления сыпи.

Ложноположительный результат возможен при проведенной ранней вакцинации против кори (в течение предшествующих 6 недель до появления сыпи), наличии повышенного ревматоидного фактора, при сопутствующих острых воспалительных заболеваний [5].

В каждом отдельном случае проводится изучение течения заболевания, особенностей пациента и/или дополнительная диагностика.

Наряду с определением IgM / IgG для диагностики кори, также настоятельно рекомендуется выполнять ПЦР [12].

Положительный анализ на IgM только при наличии характерной клинической картины и данных о контакте с больным корью свидетельствует об остром течении коревой инфекции. Положительный анализ на IgM при отсутствии характерной клинической картины или контакта с больным корью не является основанием для постановки диагноза. В таких случаях рекомендуется выполнить ПЦР исследование [3].

— IgG.

Определение IgG является информативным анализом для подтверждения кори в случае отсутствия возможности провести ПЦР исследование и/или когда IgM является отрицательным или сомнительным [6].

Исследование проводится в парных сыворотках: первый анализ должен быть выполнен в первые 4—7 дней от начала высыпаний, второй — в течение 10—30 дней после первого [2,3].

IgG достигают пика через 4 недели от начала сыпи [9].

Положительным результат считается, если:

— произошла сероконверсия (в первом анализе IgG отрицательны, во втором — положительны);

— отмечается значительное (в 4 и более раз) повышение уровня IgG.

Сероконверсия не является информативной при недавно проведенной вакцинации (в течение предшествующих 6 недель).

Ранее вакцинированные, получившие две прививки и не выработавшие защитных антител (такое встречается, но очень редко), при заболевании корью могут не иметь повышение IgG в 4 раза при втором анализе IgG по сравнению с первым [3]. Отрицательное значение IgG в двух анализах исключает наличие коревой инфекции.

ИФА — метод, одобренный ВОЗ для определения IgG и IgM для диагностики коревой инфекции [10].

3. Вирусологический метод.

Для идентификации вируса кори иногда может применяться вирусологический метод. Суть его заключается в том, что вирус, полученный от больного, культивируется в клеточной культуре. Этот метод является особо точным, но занимает около двух недель. Вирусологический метод не рекомендуется для рутинного обследования при подозрении на корь [2,5,6,8].

[1] Strebel PM, Orenstein WA. Measles. N Engl J Med. 2019 Jul 10; 381:349-357. DOI: 10.1056/NEJMcp1905181.

[2] Профилактика кори, краснухи и эпидемического паротита. Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.2952-11; 2011.

[3] An Advisory Committee Statement Measles and Rubella Elimination Working Group. Guidelines for the Prevention and Control of Measles Outbreaks in Canada. Can Commun Dis Rep 2013;39. DOI:10.14745/ccdr.v39i00a03.

[6] American Academy of Pediatrics. Masles. In: Kimberlin DW, Brady MT, Jackson MA, Long SS, editors. Red Book: 2018-2021 Report of the Committee on Infectious Diseases. 31th ed. American Academy of Pediatrics; 2018. pp. 537–50.

[11] Gershon AA. Measles Virus (Rubeola). In: Bennett JE, Dolin R, Blaser MJ, editors. Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases. 9th edition. Elsevier;2020. pp. 2110—16.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии, а именно к выявлению нового штамма вируса кори NovO/96 для получения антигена - компонента диагностической тест-системы и тест-система для диагностики антител к вирусу кори. Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание штамма-продуцента вируса кори NovO/96, обладающего более высокой продуктивностью, и иммуноферментной тест-системы на его основе для диагноститики антител к вирусу кори с более высокой чувствительностью, чем при использовании тест-системы на основе зараженной вирусом кори культуры клеток. Штамм депонирован в коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии “Вектор” под регистрационным номером №VB-04. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии, а именно к выявлению нового штамма вируса кори NovO/96 для получения антигена - компонента диагностической тест-системы и тест-система для диагностики антител к вирусу кори.

Известен штамм вируса кори Ленинград 16 (Л-16), используемый для приготовления вакцины и в качестве компонента диагностической тест-системы (Руководство по вакцинному и сывороточному делу под ред. Академика АМН П.Н.Бургасова. М.: Медицина, 1978, - с.220-223).

Однако данный штамм вируса кори обеспечивает недостаточный урожай целевого продукта: на протяжении десяти пассажей концентрация вируса в культуральной жидкости не превышает (в среднем) 10 3,5 ТЦД₅₀/мл (Васильева Г.А., Бойчук Л.М. Отработка технологии получения вируса кори штамм Л-16 на тканевой культуре из эмбрионов японских перепелок. - Специфическая профилактика кори. - Материалы научно-практической конференции ЛНИИЭМ им. Пастера. - Л., 1970, - с.206-210).

Известна отечественная иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу кори "Корь-скрин" (разработчик и производитель тест-системы "Корь-скрин" - ЗАО Биотехнологическая компания "БИОСЕРВИС" (Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусу кори "Корь-скрин", Москва, 2001г.). Указанная тест-система содержит:

- иммуносорбент - полистироловые планшеты для иммунологических реакций, в лунках которых сорбирован антиген вируса кори (АгВК). АгВК - в рядах планшета А, С, Е, G и контрольный антиген (кАг) - в рядах В, D, F, Н. АгВК представляет собой инфицированные вирусом кори клетки Vero, содержащие не менее 80% вируссодержащих клеток; кАг представляет собой незараженные клетки Vero;

- положительный контрольный образец (К+) - сыворотка крови человека, содержащая антитела к вирусу кори;

- отрицательный контрольный образец (К-) - сыворотка крови человека или сывороточный альбумин человека, не содержащие антител к вирусу кори;

- конъюгат - антитела диагностические против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена;

- субстратная буферная смесь с гидроперитом (БСГ) - для приготовления раствора хромогена;

- хромоген - ортофенилендиамин (ОФД);

- стабилизатор - бычий сывороточный альбумин (БСА) или казеин;

- концентрат фосфатно-солевого буфера для отмывания планшетов и приготовления разведений сывороток и конъюгата.

Однако указанная тест-система (аналог) имеет низкую чувствительность вследствие того, что в ней используют АгВК, представляющий собой неочищенный антиген - инфицированные (не менее 80%) вирусом кори клетки Vero.

Наиболее близкой тест-системой (прототипом) является иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу кори американской фирмы Wampole Laboratories (Wampole Laboratories measles IgG ELISA// P/N 6000-29W REV В. - №4, 1996; Helfand R.F. et al. Comparative detection of measles and rebella IgM and IgG derived from filter paper blood and serum samples.// J.Med. Virol. 2001, 65(4): 751-7). Указанная иммуноферментная тест-система содержит планшет с иммобилизованным инактивированным антигеном вируса кори, концентрат буфера, блокирующий раствор; цитратно-фосфатный буферный раствор для субстрата с перекисью водорода (ЦФР); ортофенилендиамин (ОФД), жидкая положительная контрольная сыворотка (К+), жидкая отрицательная контрольная сыворотка (К-), антитела против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена (конъюгат) в жидкой форме, жидкий стоп-реагент.

Однако в указанной тест-системе (прототип) в качестве антигена использован неочищенный NP-белок вируса кори, вследствие чего тест-система имеет недостаточную чувствительность (не выявляет антитела к другим белкам).

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание штамма-продуцента вируса кори, обладающего более высокой продуктивностью и иммуноферментной тест-системы на его основе для диагностики антител к вирусу кори с более высокой чувствительностью.

Указанный технический результат достигается созданием штамма вируса кори NovO/96 с более высокой продуктивностью и на его основе более чувствительной иммуноферментной тест-системы для диагностики антител к вирусу кори, включающей планшет с иммобилизованным инактивированным антигеном вируса кори, концентрат фосфатно-солевого буфера с твином (ФСБ-Т), блокирующий раствор; цитратно-фосфатный буферный раствор для субстрата с перекисью водорода (ЦФР); ортофенилендиамин (ОФД), жидкая положительная контрольная сыворотка (К+), жидкая отрицательная контрольная сыворотка (К-), антитела против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена (конъюгат) в жидкой форме, жидкий стоп-реагент, согласно изобретению в качестве иммобилизованного инактивированного антигена вируса кори тест-система содержит высокоочищенный антиген, приготовленный на основе штамма вируса кори NovO/96.

Характеристика заявляемого штамма. Штамм NovO/96 относится к семейству вирусов Paramyxoviridae. Заявляемый штамм получен в НИИ молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии “Вектор”, Министерство здравоохранения Российской Федерации, Кольцове, Новосибирская обл.

Штамм депонирован в коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под регистрационным номером №VB-04 (дата регистрации 24 апреля 2002 г., справка о депонировании штамма №0302 прилагается к заявке) и используется для производства антигена при выпуске тест-системы иммуноферментной для определения антител к вирусу кори “Анти-корь ИФА”.

На чертеже приведена карта сравнения аминокислотных последовательностей:

Из выше изложенного следует, что заявляемый штамм отличается генетически от известных штаммов вируса кори.

Генотип штамма. Генотип A [S.Santibanez. A.Agafonov et al. // J. of Med. Virol. 1999, V.58, №3, P.313-320].

Использование полученного из штамма NovO/96 антигена - 0,2-0,4 мкг/лунку позволяет выявлять противокоревые антитела в сыворотках вакцинированных и больных корью людей методом ИФА.

Антигенные свойства. Выявляет антитела к вирусу кори в сыворотках больных и вакцинированных людей (см. табл. 1). Выделенный штамм по серологическим свойствам близок к референс-штамму Эдмонстон и к вакцинному штамму Л-16.

Для длительного хранения штамм лиофилизируют с использованием в качестве защитной среды раствор желатина и сахарозы.

Для размножения штамма используют следующие питательные среды: Игла МЭМ, Игла МЭМ x 2АВК, ДМЭМ, содержащие 2-5% фетальной сыворотки КРС.

Изучение серологических свойств полученного штамма (NovO/96) выявило существенное сходство с референс-штаммом (прототип) вируса кори и со штаммом Л-16. Полученные от иммунизированных мышей линии BALB/c антисыворотки к штамму Эдмонстон и к заявляемому штамму, выделенному от больного, были исследованы в реакции иммуноферментного анализа. Результаты изучения перекреста между полученными сыворотками показаны в табл. 1. Как видно из результатов табл. 1, сыворотка от всех мышей, иммунизированных вирусом кори штамм Эдмонстон, реагировала как с вирусами кори штамм Эдмонстон и Л-16, так и со штаммом NovO/96, выделенным при вспышке. С другой стороны, сыворотки от всех мышей, иммунизированных заявляемым штаммом, выделенном при вспышке кори 1996 года, реагировали как с самим вирусом, так и с вирусами кори штамм Эдмонстон и Л-16. Исходя из полученных результатов можно заключить, что заявляемый штамм по серологическим свойствам близок к референс-штамму Эдмонстон и к вакцинному штамму Л-16.

Пример 1. Способ получения антигена вируса кори.

Очищенный и инактивированный антиген вируса кори используют для постановки реакции иммуноферментного анализа.

Проведение ультрафильтрации. Концентрирование и очистку вируса кори из КВЖ проводят на мембранах "Владипор" типа УАМ-100 (Россия) или РТНК 0005 (ф. “Millipore”, США). Линейная скорость подачи КВЖ на ячейку должна быть равна 0,6 л/мин. Давление на выходе должно быть не более 2,5 кг/см 2 , давление на входе не должно превышать давление на выходе более, чем на 0,4 кг/см 2 . Конечный продукт представляет собой КВЖ, сконцентрированную в 20 раз, освобожденную от низкомолекулярных соединений и клеточного детрита. Титр вируса кори в концентрате не менее 10 9 ТЦПД₅₀/мл.

Ультрацентрифугирование вируссодержащего материала. Осаждение вируса. Антиген для ИФА получают из двух источников:

1 - из концентрата КВЖ;

2 - из лизата клеток после размораживания.

Выход пригодного для ИФА антигена с 3 л КВЖ и лизата клеток составляет 4-6 мг по белку.

Пример 2. Состав тест-системы.

Состав компонентов тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусу кори (Анти-корь ИФА), которая представляет собой набор реагентов:

- контрольная положительная сыворотка (К+) - сыворотка крови человека, содержащая антитела к вирусу кори, инактивированная прогреванием, и краситель феноловый красный по ТУ 6-09-3070-84;

- контрольная отрицательная сыворотка (К-) - сыворотка крови здоровых доноров, не содержащая антител к вирусу кори;

- антитела против иммуноглобулинов класса G человека, меченые пероксидазой хрена по ТУ 6-09-10-1408-79 (конъюгат);

- субстрат пероксидазы ортофенилендиамин (ОФД) по ТУ 6-09-08-1127-76 или ВФС 42-76ВС-88;

- концентрат фосфатно-солевого буферного раствора двадцатипятикратный (ФСБТ-25Х) (состав ФСБ-Т (25Х) - натрий фосфорно-кислый двузамещенный 12-водный ГОСТ 4172-76 90,0 г; натрий фосфорно-кислый однозамещенный 2-водный по ГОСТ 245-76 4,75 г; натрий хлористый ГОСТ 245-76 22,0 г; твин-20 "Сигма", США 12,5 мл);

- стоп-реагент серная кислота по ГОСТ 4204-77 с концентрацией 2 моль/л;

Иммуносорбент - планшет 96-луночный для иммунологических реакций по ТУ 64-2-375-86 или планшет разборный со стрипами типа "Nunc", Дания или аналогичные с иммобилизованным очищенным антигеном вируса кори.

Консервант - мертиолят натрия "Сигма" (США) содержится в К+, К-, конъюгате, блокирующем растворе в концентрации 0,01%; К+ и К-содержат антибиотик-гентамицина сульфат по ВФС 42-2626-89 в концентрации 1мг/мл.

Набор рассчитан на проведение 96 анализов (включая контрольные).

Пример 3. Состав и методика применения коммерческой тест-системы "Анти-корь ИФА"

1. Состав набора

1. Планшет с иммобилизованным антигеном вируса кори - 1 планшет (разборный).

2. Концентрат фосфатно-солевого буфера с твином (ФСБ-Т) - 3 флакона объемом по 10мл.

3. Блокирующий раствор -1 флакон объемом 10 мл.

4. Цитратно-фосфатный буферный раствор для субстрата с перекисью водорода (ЦФР) - 3 флакона объемом 10 мл.

5. Ортофенилендиамин (ОФД) - 1 флакон, 3 таблетки.

6. Положительная контрольная сыворотка (К+), жидкая, красного цвета - 1 флакон объемом 0,5 мл.

7. Отрицательная контрольная сыворотка (К-), жидкая, желтоватого цвета - 1 флакон объемом 0,5 мл.

8. Антитела против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена (конъюгат), жидкие, синего цвета - 1 флакон объемом 0,5 мл.

9. Стоп-реагент, прозрачная бесцветная жидкость - 1 флакон объемом 5 мл.

2. Проведение иммуноферментного анализа

3. Учет результатов

Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре. Оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 492 нм. Результаты учитывают только в том случае, если среднее значение ОП в лунках с контролем конъюгата (ОП_кк) не превышает 0,15, в лунках с К - среднее значение ОП(ОП_к-) не более 0,2, а в лунках с К+ среднее значение ОП(ОП_к+) не менее 0,5.

Результаты теста считаются положительными, если ОП анализируемой сыворотки больше Оп_крит. При количественном определении титра антител к вирусу кори в сыворотке титром следует считать последнее разведение исследуемой сыворотки, значение ОП в которой превышает значение ОП_крит. ОП_крит рассчитывают по формуле: ОП_крит.=ОП_к-+0,2.

Тест-систему "Анти-корь ИФА" выпускают в виде набора, упакованного в полистироловую или картонную коробку. Один набор рассчитан на проведение 96 анализов, включая контрольные.

Пример 4. Использование тест-системы "Анти-корь ИФА" в клинической практике.

А. Во время вспышки инфекционного заболевания в г. Новосибирске в 2000-2001 г.г. тест-система "Анти-корь ИФА" была использована для серологического подтверждения клинического диагноза “корь” у 8 больных. Больные с клиническим диагнозом “корь” поступали в Новосибирский областной центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями. На 2-3 сутки и через 2-2,5 недели после поступления у больных проводили забор парных сывороток для серологического подтверждения диагноза “корь”. Нарастание титров специфических антител изучали в реакции РТГА (по стандартной методике с использованием эритроцитов обезьяны Масаса mulatta) и методом ИФА (с помощью экспериментальных серий тест-системы "Анти-корь ИФА", основным компонентом которой является очищенный антиген вируса кори штамм NovO/96). Окончательный диагноз “корь” был поставлен после проведения ПЦР со специфическими праймерами на С-концевую часть гена, кодирующего NP белок вируса кори. У всех 8 больных было отмечено как минимум 4-х кратное нарастание специфических антител, определенное методом РТГА. У всех 8 больных в забранных образцах методом ПЦР был обнаружен генетический материал, специфичный для вируса кори. С помощью тест-системы "Анти-корь ИФА" также было зарегистрировано у всех 8 больных как минимум 4-х кратное нарастание антител к вирусу кори. Таким образом, тест-система "Анти-корь ИФА" может быть использована для определения специфических антител в парных сыворотках, полученных от больных, и таким образом для определения, снятия или подтверждения диагноза при протекании заболевания с клиническими проявлениями, характерными для кори.

Б. В период с 1996 по 1998 годы в п.Кольцово Новосибирской области проводились работы по изучению титра специфических антител к вирусу кори в сыворотках крови детей возраста 6 лет перед проведением второй вакцинации против кори. Титры специфических антител изучали в реакции РПГА (с помощью "Диагностикума эритроцитарного коревого антигенного для РПГА", производства “Предприятия по производству бакпрепаратов Ленинградского НИИЭМ им. Пастера”), РТГА (по стандартной методике с использованием эритроцитов обезьяны Macaca, mulatta) и методом ИФА (с помощью заявляемой тест-системы "Анти-корь ИФА", основным компонентом которой является очищенный антиген вируса кори штамм NovO/96).

Результаты сравнения двух методов определения противокоревых антител в сыворотке крови детей показывают, что с помощью метода иммуноферментного анализа специфические антитела определяются в 177 сыворотках из общего количества сывороток (187 сывороток), в которых были найдены противокоревые антитела и с помощью метода ИФА, и с помощью метода РТГА. В то же время методом РТГА антитела к вирусу кори определялись в 165 сыворотках. Таким образом, наибольший процент выявляемость положительных сывороток (95,5%) был получен в реакции ИФА. В реакции РТГА процент положительных реакций был ниже и составлял 89,2%. Средние арифметические величины титров антител в ИФА также были выше, чем в РТГА (1:245,5 и 1:28,4 соответственно).

Сопоставление результатов, полученных при использовании методов ИФА и РТГА, показало, что антитела к вирусу кори обоими методами выявляются в 155 сыворотках.

Таким образом, тест-система "Анти-корь ИФА" может быть использована для определения напряженности индивидуального иммунитета к заболеванию “корь”.

1. Штамм вируса кори NovO/96 для получения антигена - компонента иммуноферментной тест-системы для диагностики антител к вирусу кори, депонированный в коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии “Вектор” под регистрационным номером №VB-04.

2. Иммуноферментная тест-система для диагностики антител к вирусу кори, включающая планшет с иммобилизованным инактивированным антигеном вируса кори, концентрат фосфатно-солевого буфера с твином (ФСБ-Т), блокирующий раствор; цитратно-фосфатный буферный раствор для субстрата с перекисью водорода (ЦФР); ортофенилендиамин (ОФД), жидкую положительную контрольную сыворотку (К+), жидкую отрицательную контрольную сыворотку (К-), антитела против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена (конъюгат) в жидкой форме, жидкий стоп-реагент, отличающаяся тем, что в качестве иммобилизованного инактивированного антигена вируса кори тест-система содержит высокоочищенный антиген, приготовленный на основе штамма вируса кори NovO/96 (регистрационный номер №VB-04).

PD4A Изменение наименования, фамилии, имени, отчества патентообладателя