Выделение герпеса на культуре клеток

Шушакова Е.К., Рублева О.В.
Городской центр медицинских исследований, г. Москва

Нарушение репродуктивной функции мужчин является актуальной проблемой в современном обществе и, по данным различных клиник, составляет 15-45% среди обратившихся пар. Причины, влияющие на состояние мужской репродуктивной системы весьма разнообразны, однако большое значение имеют различные инфекции, как вирусные, так и бактериальные.

При уточнении этиологии мужского бесплодия, считается, что ранее перенесенные бактериальные инфекции чаще всего приводят к обтурационной аспермии, возникающей вследствие обструкции семявыносящих путей. К таким осложнениям приводят острая гонорея, хламидийная инфекция, длительно протекающие микст-инфекции в виде различных сочетаний микоплазм, уреаплазм, трихомонад, листерий, стафилококков, кишечной палочки и др. Однако при микст-инфекции роль инфекционного фактора отходит на второй план, а ведущими являются тканевые пролиферативные реакции, нейроэндокринные реакции, аутоиммунный компонент.

Кроме того, необходимо помнить о проблеме гипердиагностики бактериальных инфекций мужской половой сферы. Определить роль инфекционного фактора в структуре причин бесплодия достаточно сложно, т.к. мало статистических данных, они не всегда корректны, не каждый мужчина идет обследоваться по поводу нарушения фертильности, а результаты разных лабораторий часто несопоставимы. [1]

Сами по себе урогенитальные инфекции практически не нарушают морфогенез, однако оказывают влияние на подвижность сперматозоидов и ведут к изменению физико-химических параметров семенной плазмы, в частности ее кислотности и вязкости, в связи с наличием окислительного стресса и увеличением провоспалительных интерлейкинов [1, 7] Так же следует учитывать, что если изначальное качество эякулята было хорошим, то преходящие изменения состава и свойств семенной жидкости не оказывают, как правило, значимого влияния на фертильность.

Так как многие исследователи публикуют противоречивые данные о влиянии бактериальной инфекции, в частности, хронического бактериального простатита (ХБП) на различные параметры эякулята, группа китайских авторов провела мета-анализ с Medline, PubMed, EMBASE и двух китайских баз данных (CNKI и ВАН Fang) для выявления соответствующих исследований. Было показано, что жизнеспособность сперматозоидов, общая подвижность, а также процент сперматозоидов с прогрессивным движением у пациентов ХБП значительно ниже, чем в контрольных группах. Тем не менее, ХБП не оказал существенного влияния на объем спермы, концентрацию сперматозоидов и продолжительность разжижения семенной жидкости [13].

Роль вирусов и, особенно, вирусов семейства герпеса в развитии бесплодия как у женщин, так и у мужчин велика и часто этиологическим фактором является вирус простого герпеса (ВПГ). Широкая распространенность герпесвирусной (ГВ) инфекции общеизвестна, а наличие ее у человека принимает разнообразные формы от бессимптомного носительства до выраженных клинических проявлений.

Однако некоторые авторы считают не совсем доказанным влияние различных инфекций, передаваемых половым путем, в том числе, ВПГ на развитие бесплодия, хотя не отрицают ухудшение качества спермы при хронических инфекциях, как вирусных, так и бактериальных [8, 9]. Тем не менее, большинство ученых рассматривают вирусные инфекции как прямую и/или косвенную причину мужского фактора бесплодия. Кроме того, инфицирование половых клеток предполагает возможность вертикальной передачи вируса при оплодотворении яйцеклетки пораженной гаметой, что может стать причиной самопроизвольного аборта или внутриутробной инфекции плода [5].

По данным, Amirjannati N., распространенность ВПГ в эякуляте мужчин, с нарушением фертильности и не имеющих клинических проявлений вирусной инфекции, составляет 12% при диагностике методом ПЦР. Как правило, других причин, объясняющих бесплодие, нет. При серологическом обследовании этих же пациентов (исследователи выявляли IgM к ВПГ) получено всего лишь 3,2% положительных проб [6]. В исследовании Monavari S.H. у пациентов с бесплодием и бессимптомным течением герпесвирусной инфекции выявление в эякуляте ДНК ВПГ-1 составило 22,9%, а ВПГ-2 – 14,3%. У обследованных ВПГ инфекция не была связана с подвижность и наличием морфологических дефектов сперматозоидов, но коррелировала с более низким количеством сперматозоидов в семенной жидкости. [10]

D. Kotronias с соавторами так же установили связь между наличием ВПГ в эякуляте и снижением количества и подвижности сперматозоидов, [11, 12], а наличие цитомегаловируса (ЦМВ) и Эпштейна-Барр вируса (ЭБВ), в эякуляте не влияло ни на количество, ни на подвижность мужских половых клеток [11]. Отрицательное влияние герпесвирусов, в частности ВПГ 2, на сперматогенез отметили и китайские исследователи. В образцах эякулята пациентов, инфицированных этим штаммом вируса, зарегистрировано снижение количества сперматозоидов, наличие незрелых форм и различные признаки апоптоза [14]

Частота выявления ДНК ВПГ в эякуляте у мужчин с нарушением фертильности в разных странах следующая 3,2-3,7% в Германии, в Китае – 4,8%, в Греции – 2,1-49,5%, 24% в Японии [4].

По данным российских исследователей, у мужчин с первичным бесплодием в браке по сравнению с практически здоровыми ВПГ достоверно чаще встречается как в цельном эякуляте (31% против 17%; p = 0,049), так и во фракции активно-подвижных сперматозоидов (30% против 8%; p = 0,016). Показано, что обнаружение ВПГ в эякуляте прямо коррелирует со снижением количества активно-подвижных сперматозоидов (p = 0,0001) и уменьшением доли морфологически нормальных форм половых клеток (p = 0,002).

Частота выявления вирусов герпеса имеет большой разброс, что, соответственно, связано с чувствительностью и специфичностью метода детекции, тем не менее, максимальные и минимальные значения совпадают. Есть данные о сезонности выявления ГВ в эякуляте, с преобладанием в зимнее время с декабря по февраль, соответственно для ВПГ 34% против 24,5% (р=0,019) в остальные месяцы. Эти данные имеют большое клиническое значение для профилактики горизонтальной и вертикальной передачи ВПГ при планировании беременности. [4, 5]

Вирус герпеса размножается во многих различных тканевых культуральных системах, в монослоях эпителиальных клеток почек кролика, обезьяны, амниона человека, куриного эмбриона. Он также размножается в клетках Hela и фибробластах куриного эмбриона и человека. Могут быть использованы и культуры роговицы кролика. Бляшки развиваются в монослоях куриного эмбриона, амниона человека и клеток Hela.

Цитопатогенное действие может проявляться на 2-3 день, но в зависимости от дозы вирус может обнаруживаться и после заражения через 8 ч, когда отдельные клетки начинают округляться и появляются гигантские клетки, содержащие 100 ядрышек. В этот период можно видеть внутриядерные включения. Мы отмечаем три основных проявления ЦПД: пролиферацию и увеличение клеток, округление клеток без пролиферации и формирование гигантских клеток. Нами описан штамм вируса герпеса, который образовывал гигантские клетки.

В первичной культуре почки кролика ЦПД наступает после 12 ч заражения в 30-50% клеток монослоя и полностью через 2 дня.

В первичной эмбриональной культуре клеток куриного эмбриона вирус герпеса генитального происхождения образует бляшки. Визуально бляшки наблюдаются после 2-го дня и имеют размер от 2 до 3 мм. Для того чтобы они были лучше видны и подсчитаны, их можно покрасить нейтральным красным.

Считают, что самое раннее проявление вируса герпеса на клетку заключается в задержке митозов, которая наступает после заражения; через 6 ч наблюдается увеличение ДНК в ядрах. Фаза эклипса, в течение которой отсутствует инфекционность, длится около 12 часов, и вирус выделяется в среду через 15 часов.

Нами был использован МФА в клетках Hela, зараженных вирусом простого герпеса. Мы обнаружили флюоресцирующие образования различной локализации (большие и малые гранулы в ядре, грануляция и диффузная флюоресценция в цитоплазме или около ядерной мембраны). Специфический вирусный антиген обнаруживался МФА, если титр инфекционного вируса в клетках достигал 102'5 1О3'°ТСД5О/О, мл. Было изучено образование инфекционного вируса и вирусного антигена на протяжении 6-15 пассажей в клетках Hela, хронически инфицированных вирусом герпеса. Хроническая инфекция поддерживалась культивированием инфицированных клеток в среде, содержащей 40% человеческой сыворотки со специфическими антигенами. Методом флюоресцирующих антител доказано наличие внутриклеточного вируса и вирусного антигена в инфицированных клетках. Внеклеточный вирус в культуральной жидкости не обнаруживался.

В противоположность активной вирусной инфекции вирусный антиген обнаруживался в хронически инфицированных клетках даже при очень низких титрах внутриклеточного вируса.

P. Sandra и соавторы была показана различная адсорбционная способность клонированных штаммов вируса герпеса, размножающихся (ch+) и не размножающихся (ch ) в клетках куриного эмбриона (КЭ). При одинаковой множественности заражения (100 БОЕ) через 15 мин адсорбировалось 36% ch+ вируса и 50% ch , через 2ч - соответственно 67 и 90%.

Образование вирусных антигенов обоих вирусов было одинаковым в клетках почки кролика, однако в клетках КЭ ch+ вирус образовывал антигены в 8 раз больше. Различий в локализации антигенов, по данным иммунофлюоресценции, не обнаружено.

Многими авторами была изучена чувствительность клеток WI-38, первичных эмбриональных фибробластов, почки эмбриона человека, а также Нер-2 к вирусу герпеса. После однократного заражения культуры поддерживали в течение длительного срока. Через 3 недели только в клетках WI-38 наблюдался ЦПД. Чувствительность этих клеток к вирусу увеличивалась после их обработки диэтиламино-этилдекстраном. В инфицированных клетках обнаруживался комплементсвязывающий антиген.

Кроме того, заражали вирусом простого герпеса ретиналь-ные культуры новорожденных кроликов. Как показали исследования, этот вирус вызывает характерные ядерные изменения в ретинальных культурах и деструкцию нейронов, что может быть использовано при селекции клеточной чувствительности и характеристики биологической особенности вируса герпеса.

Некоторые штаммы вируса герпеса вызывают острую лити-ческую инфекцию культур ткани, а другие размножаются на тех же культурах ткани, формируя синцитий. С понижением окружающей температуры с 37°С до 33°С удается трансформировать острую герпетическую инфекцию в хронический процесс.

Культивирование вируса герпеса можно проводить также на куриных эмбрионах, заражая их в амниотическую полость, желточный мешок, на хорионаллантоисную оболочку или непосредственно в сам эмбрион.

При заражении на хорионаллантоисную оболочку можно наблюдать микроскопические изменения, представляющие собой очаги пролиферации с центральными некротическими участками.

Для куриных эмбрионов первые пассажи вируса герпеса чаще всего не вызывают специфической гибели, а последующие являются летальными для куриного зародыша через 3-5 дней после заражения.

Специфические внутриядерные вирусные включения можно обнаружить во всех органах инфицированных куриных эмбрионов, что считается патогномоничным для этой инфекции.

J. Parker и соавторы, А.Ф. Пухнер наблюдали, что штаммы вируса герпеса генитального происхождения, изолированные от больных с герпетическими поражениями гениталий, продуцировали на хорионаллантоисной оболочке развивающихся куриных эмбрионов большие атипичные некротические поражения. Штаммы вируса герпеса, изолированные ими от пациентов с герпетическими поражениями экстрагенитальной локализации, продуцировали через 24 ч на хорионаллантоисной оболочке куриных эмбрионов классические мелкие (1-2 мм) некротические участки поражения. Это может быть использовано для дифференциации штаммов вируса герпеса генитального и экстрагенитального происхождения, так как по морфологическим изменениям в культуре ткани и по ЦПД это сделать не удается .

После первичных цитологических находок в соскобах клеток, взятых у лиц с герпесом, вирус может быть изолирован в 43% случаев, при повторных цитологических находках - в 18% случаев, т.е. как в первые 10 дней после начальных цитологических изменений, так и после 20 дней заболевания герпесом.

W. Ashe и соавторы сообщили об изоляции вируса герпеса симплекс из слюнной железы людей.

У куриных эмбрионов, зараженных на хорионаллантоисную оболочку вирусом герпеса, вирусемия наблюдается в первые сутки после заражения и держится на высоком уровне вплоть до гибели куриного зародыша. Было показано, что при острой герпетической инфекции у куриных эмбрионов во время вирусе-мии вирус связан с эритроцитами с разной интенсивностью.

По данным P.M. Бикбулатова (1986), наибольшей цитомор-фологической чувствительностью к заражению ВПГ обладали из первичных культур ФЭЧ, ПЭЧ, из перевиваемых Vero, СОЦ.

Это может иметь определенное значение и для цитодиагностики ВПГ с использованием клеточных культур.

Им установлено, что ВПГ-инфекция клеточных культур сопровождается выраженными изменениями метаболизма клеток: активизацией окислительно-восстановительных митохондриаль-ных ферментов, увеличением энзимов белкового и углеводного обменов, выходом из клеток лизосомальных гидролитических ферментов и индукцией патологических митозов. Это позволяет думать, что с самых ранних этапов ВПГ-инфекции митохон-дриальный аппарат клетки активно реагирует на воздействие вируса и обеспечивает его энергией для проникновения и последующего биосинтеза.

В.Я. Кицаком (1984) приведено исследование этиологической и патогенетической роли ВПГ-2 в канцерогенезе. Показана трансформирующая активность вируса в культуре клеток, си-нергическое влияние персистентной герпетической инфекции на химический канцерогенез у мышей, усиление коканцероген-ного эффекта ВПГ-инфекции на химический бластогенез в условиях интоксикации организма животных, а также этиопатоге-нетическая связь герпеса гениталий с раком шейки матки человека. Им также установлена способность ВПГ-2 индуцировать трансформацию клеток хомячка, которая фенотипически проявляется в изменении совокупности функциональных морфологических свойств. Этот автор показал, что неопластическая трансформация клеток под влиянием ВПГ-2 является многоэтапным процессом и что молекулярно-генетический механизм индукции трансформации клеток связан с прямым онкогенным действием ВПГ-2.

Изоляция вируса герпеса производится на кроликах, мышах-сосунках, в культурах тканей и в куриных эмбрионах. Кроликов заражают интрацеребрально или в роговицу глаза. Мышей-сосунков заражают интрацеребральным путем, а куриные эмбрионы - в хорионаллантоисную оболочку. Наряду с этим производят инокуляцию вируса герпеса в культуры ткани, чувствительные к этой инфекции, включая ткань роговицы и клетки почки кролика, амнион человека или клетки Hela. Вирус герпеса вызывает в них цитопатические изменения - появление гигантских клеток с внутриядерными включениями. В противоположность этому вирусы герпеса Zoster и ветрянки не способны вызывать инфекционный процесс у белых мышей-сосунков, кроликов, на хорионаллантоисной оболочке куриного эмбриона и в клетках роговицы кролика.

Частота выделения вируса герпеса из гениталий больных зависит в определенной степени от использования различных методов изоляции вируса и колебалась, по нашим данным, от 70 до 95,4% случаев.

Для идентификации вируса герпеса применяется ряд серологических реакций. Наиболее широко используются реакции нейтрализации и реакция связывания комплемента (РСК). Кровь берут от пациентов в первые дни заболевания, дают свернуться и отделяют сыворотку. Повторно кровь для получения сыворотки берут через 2-3 нед, т.е. в период выздоровления. Если нельзя сразу исследовать сыворотку, то ее хранят в холодильнике при температуре -20°С.

Вирус простого герпеса (ВПГ) – ДНК–содержащий вирус Herpes simplex virus семейства Herpesviridae подсемейства Alphaherpesvirinae. Согласно статистическим данным ВОЗ, инфекции, обусловленные ВПГ, занимают второе место по распространенности среди вирусных заболеваний человека. Различают два серотипа ВПГ – ВПГ-1 и ВПГ-2. Оба типа вируса вызывают инфекционные заболевания человека различной степени тяжести от характерных везикулезных или пустулезных высыпаний на коже и слизистых до поражений ЦНС. ВПГ-1 – причина офтальмогерпеса, протекающего в форме кератита или кератоиридоциклита, реже увеита, в единичных случаях — ретинита, блефароконъюнктивита. Заболевание может привести к помутнению роговицы и вторичной глаукоме. ВПГ-1 — основная причина энцефалита у взрослого населения стран умеренного климата, при этом только у 6–10% больных отмечается одновременное поражение кожи.

В ходе проведения эпидемиологических исследований установлено наличие специфических АТ к ВПГ у 90–95% обследуемых лиц среди взрослого населения, при этом первичная инфекция манифестно протекает лишь у 20–30% инфицированных.

ВПГ характеризуется коротким циклом репродукции в клеточных культурах и оказывает сильное цитопатическое действие. Он способен к репродукции в различных типах клеток, чаще персистирует в ЦНС, преимущественно в ганглиях, поддерживая латентную инфекцию с возможностью периодической реактивации. Наиболее часто вызывает кожно-слизистые формы заболевания, а также поражение ЦНС и глаз. Геном ВПГможет интегрироваться с генами других вирусов (включая ВИЧ), вызывая их активацию, также возможен его переход в активное состояние на фоне развития иных вирусных и бактериальных инфекций.

Пути передачи ВПГ: воздушно-капельный, половой, контактно-бытовой, вертикальный, парентеральный. Факторами передачи ВПГ служат кровь, слюна, моча, везикулярный и вагинальный секрет, сперма. Входными воротами являются поврежденные слизистые оболочки и кожа. По периферическим нервам вирус доходит до ганглиев, где сохраняется пожизненно. При активации ВПГ распространяется по нерву к первоначальному очагу поражения (механизм “замкнутого цикла” – циклическая миграция вируса между ганглием и поверхностью кожи). Может происходить лимфогенная и гематогенная диссеминация возбудителя, что особенно характерно для недоношенных новорожденных и лиц с выраженным иммунодефицитом (в т. ч. при ВИЧ-инфекции). ВПГ обнаруживается на лимфоцитах, эритроцитах, тромбоцитах, при проникновении вируса в ткани и органы возможно их повреждение вследствие его цитопатического действия. Сохраняющиеся в течение всей жизни у человека вируснейтрализующие АТ (даже в высоких титрах), хотя и препятствуют распространению инфекции, но не предупреждают рецидивов.

Выделение ВПГ продолжается значительное время при первичном инфицировании (ДНК выявляется в плазме крови в течение 4–6 недель), при рецидивах – не более 10 дней. Формирование противогерпетического иммунитета происходит как при манифестном, так и при бессимптомном течении инфекции. При первом контакте АГ с клетками иммунной системы в течение 14–28 дней формируется первичный иммунный ответ, который у иммунокомпетентных лиц проявляется образованием интерферонов, выработкой специфических АТ (вначале – IgM, впоследствии – IgA и IgG), повышением активности естественных киллеров – NK-клеток и формированием мощного пула высокоспециализированных киллеров. В случае реактивации или реинфекции возникает повторный контакт клеток иммунной системы с АГ, образуются АТ и Т-киллеры. Реактивация сопровождается продукцией АТ IgM (редко даже при наличии типичных высыпаний), АТ IgА (чаще) и IgG.

ВПГ (преимущественно ВПГ-2) вызывает генитальный герпес – хроническое рецидивирующее заболевание. Клинические проявления первичного эпизода инфекции, вызванной разными типами вируса сходны, однако инфекции, вызванной ВПГ-2, в гораздо большей степени свойственен рецидивирующий характер. Передача вируса происходит при половых контактах, очаг инфекции локализуется на слизистой и коже половых органов и перигенитальной зоны. Размножение вируса в клетках эпителия приводит к образованию очага сгруппированных пузырьков (папул, везикул), в которых содержатся вирусные частицы, сопровождается покраснением, зудом. Первичный эпизод протекает острее (обычно с симптомами интоксикации), чем последующие рецидивы. Часто возникают симптомы дизурии, признаки эрозии шейки матки.

На ранних стадиях ВИЧ-инфекции течение заболеваний, вызванных ВПГ-1 или ВПГ-2, короткое и типичное. Частым признаком углубления иммуносупрессии и перехода латентной стадии ВИЧ-инфекции в стадию вторичных заболеваний служит развитие опоясывающего лишая. Наличие стойких глубоких вирусных поражений кожи, повторный или диссеминированный опоясывающий лишай, локализованная саркома Капоши — одни из клинических критериев стадии вторичных заболеваний ВИЧ-инфекции. У больных с количеством CD4+-клеток менее 50 клеток/мкл отсутствует тенденция к самостоятельному заживлению эрозивно-язвенных дефектов. Частота герпетического энцефалита среди поражений ЦНС при ВИЧ-инфекции — около 1–3%. У больных СПИДом с наличием глубокого иммунодефицита заболевание нередко протекает атипично: болезнь начинается подостро и медленно прогрессирует до тяжелейших проявлений энцефалита.

Герпетическая инфекция даже при бессимптомном течении способна вызвать целый ряд патологий у беременной и новорожденного. Наибольшую угрозу репродуктивной функции представляет генитальный герпес, который в 80% случаев обусловлен ВПГ-2 и в 20% – ВПГ-1. Бессимптомное течение чаще имеет место у женщин и более типично для ВПГ-2, чем для ВПГ-1. Первичное инфицирование или рецидивы во время беременности наиболее опасны для плода, поскольку могут привести к самопроизвольному выкидышу, гибели плода, мертворождению, порокам развития. Заражение плода и новорожденного чаще отмечается при бессимптомном течении генитального герпеса, чем при клинически выраженном типичном течении. Новорожденный может приобрести герпетическую инфекцию внутриутробно, во время родов (в 75–80% случаев), либо постнатально.

ВПГ-2 может проникать в полость матки через цервикальный канал с поражением плода в 20–30% случаев; трансплацентарное инфицирование может происходить в 5–20% случаев, инфицирование во время родов – в 40% случаев. Возможна передача вируса при выполнении медицинских процедур. При типичных клинических проявлениях диагноз герпетической инфекции трудностей не представляет, тогда как при атипичных формах верифицируется на основании результатов лабораторных исследований, при этом приоритетными должны быть исследования, направленные на выявление маркеров текущей (активной) инфекции. Активация инфекционного процесса при герпетической инфекции, даже при наличии клинических проявлений в стадии обострения, редко сопровождается выработкой АТ-ВПГ IgM (чаще – при первичной инфекции либо реинфекции), как правило, при этом отмечают появление АТ-ВПГ IgА.

Целесообразными являются диагностические исследования для обнаружения ВПГ или его маркеров при наличии в анамнезе пациента указаний на рецидивирующую инфекцию либо на дебют герпетической инфекции в период беременности.

Дифференциальная диагностика. При наличии инфекционного синдрома (длительный субфебрилитет, лимфаденопатия, гепато- или гепатоспленомегалия) – токсоплазмоз, цитомегаловирусная инфекция и инфекция, вызванная ВЭБ; контактный дерматит, инфекционные заболевания, сопровождающиеся везикулезными высыпаниями на коже и слизистых оболочках (ветряная оспа, опоясывающий герпес, пиодермия и др.); эрозивно–язвенные поражения гениталий, обусловленные Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi; болезнь Крона, синдром Бехчета, фиксированная токсикодермия, менингоэнцефалиты и менингиты неясной этиологии, увеиты и кератоконъюнктивиты неясной этиологии).

Показания к обследованию

Планирование беременности;
женщины, имеющие в анамнезе либо на момент обращения типичные герпетические высыпания любой локализации, в т. ч. рецидивирующий генитальный герпес, или наличие пузырьковых и/или эрозивных высыпаний на коже, ягодицах, бедрах, слизисто–гнойные выделения из влагалища;
наличие полового контакта с партнером, имеющим генитальный герпес;
атипичная форма заболевания: отсутствие зуда или жжения, отсутствие везикул, веррукозные узелки; обширные кожные поражения (до 10% случаев предполагаемого опоясывающего герпеса обусловлено не ВЗВ, а ВПГ);
женщины с отягощенным акушерским анамнезом (перинатальные потери, рождение ребенка с врожденными пороками развития);
беременные женщины (в первую очередь имеющие УЗИ-признаки внутриутробной инфекции, лимфоаденопатии, лихорадку, гепатит и гепатоспленомегалию неясного генеза);
дети с признаками внутриутробной инфекции, врожденными пороками развития или наличием на коже или слизистых оболочках везикул или корочек;
дети, рожденные от матерей, перенесших генитальный герпес во время беременности;
ациенты (в первую очередь новорожденные) с сепсисом, гепатитами, менингоэнцефалитом, пневмонией, поражением глаз (увеит, кератит, ретинит, ретинальный некроз), поражением ЖКТ.

Материал для исследования

Содержимое пузырьков/везикул со слизистых оболочек и кожи половых органов мужчин и женщин – микроскопические исследования, культуральные исследования, выявление АГ, выявление ДНК;
мазки (соскобы) со слизистых оболочек цервикального канала, уретры (при отсутствии видимых пузырьковых высыпаний или эрозивно-язвенных поражений) – выявление ДНК;
сыворотка крови, СМЖ (по показаниям) – выявление АТ.

Этиологическая лабораторная диагностика включает микроскопическое исследование, выделение и идентификация вируса в культуре клеток, выявление АГ или ДНК возбудителя, определение специфических АТ.

Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики (вирус простого герпеса - анализ). Среди методов лабораторной диагностики “золотым стандартом” долгое время считали выделение ВПГ в культуре клеток из крови, СМЖ, содержимого везикулезных или пустулезных высыпаний и других локусов (носоглотки, конъюнктивы, уретры, влагалища, цервикального канала). Данный метод предполагает изоляцию вируса при заражении биологическим материалом чувствительных культур клеток с его последующей идентификацией. К неоспоримым преимуществам метода относятся: возможность определения активности инфекции при наличии клинических проявлений и проведения типирования вируса, а также установления чувствительности к противовирусным препаратам. Однако длительность анализа (1–8 дней), трудоемкость, высокая стоимость и необходимость определенных условий проведения исследований затрудняет применение данного метода для рутинной лабораторной диагностики заболевания. Чувствительность достигает 70–80%, специфичность – 100%.

Материал с поверхности высыпаний может быть использован для микроскопических (окраска препаратов по Романовскому–Гимзе) или цитологических (окраска препаратов по Тцанку и Папаниколау) исследований. Названные процедуры имеют низкую диагностическую специфичность (не позволяют дифференцировать ВПГ от других герпес-вирусов) и чувствительность (не более 60%), поэтому не могут считаться надежными методами диагностики.

Выявление АГ ВПГ в крови, СМЖ, содержимом везикулезных или пустулезных высыпаний и других локусов (носоглотки, конъюнктивы, уретры, влагалища, цервикального канала) проводят методами РИФ и РНИФ с использованием моноклональных или высокоочищенных поликлональных АТ. При использовании метода ИФА чувствительность исследования возрастает до 95% и более, специфичность при манифестном герпесе варьирует от 62 до 100%. Однако большинство наборов реагентов для выявления антигена ВПГ методом ИФА не позволяют провести дифференцирование серотипов вируса.

Обнаружение ДНК ВПГ-1 и/или ВПГ-2 при использовании ПЦР в различном биологическом материале превосходит чувствительность обнаружения ВПГ при использовании вирусологического исследования. Выявление ВПГ в соскобах со слизистых оболочек полости рта, урогенитального тракта, в отделяемом пузырьковых высыпаний (везикул) и эрозивно–язвенных поражений кожи с помощью ПЦР является методом выбора. Несомненную ценность имеет определение количества ДНК ВПГ методом ПЦР в режиме реального времени, результаты исследования можно использовать как с диагностической целью, так и для оценки эффективности лечения.

Для выявления АТ к ВПГ разных классов IgА, IgG, IgM, суммарных к антигенам ВПГ обоих типов или типоспецифичных, применяют методы РНИФ или ИФА, для определения авидности АТ IgG – метод ИФА. Наибольшее диагностическое значение имеет детекция АТ IgM как показателя активности процесса, их выявление может свидетельствовать об остром заболевании, реинфекции, суперинфекции или реактивации. Однако в клинически выраженных случаях, в т. ч. при типичном течении генитального или неонатального герпеса, специфические АТ IgM выявляются редко (в 3–6% случаев). Определение авидности АТ-ВПГ IgG несет низкую информационную нагрузку: реактивация при клинически выраженных случаях сопровождалась наличием высокоавидных АТ. Тест на выявление АТ-ВПГ IgА является методом выбора наряду с определением ДНК либо АГ ВПГ при определении активности инфекционного процесса.

Показания к применению различных лабораторных исследований. Определение АТ целесообразно проводить для подтверждения первичной инфекции, а также установления диагноза у пациентов с бессимптомным и атипичным течением заболевания.

У беременных женщин (скрининг) целесообразно проведение исследований для выявления АТ-ВПГ IgМ, а также выявление АТ-ВПГ IgА. Для беременных высокого инфекционного риска дополнительно рекомендуется определение ДНК и АГ ВПГ в лейкоцитарной взвеси или в материале из предполагаемого очага.

При подозрении на внутриутробную инфекцию рекомендуется выявление ДНК вируса в пуповинной крови, у новорожденных – детекция ДНК вируса в различных биологических пробах (отделяемое пузырьковых высыпаний (везикул) эрозивно– язвенных поражений кожи и слизистых оболочек, ротоглотки, конъюнктивы; периферическая кровь, СМЖ, моча и др.), а также определение АТ-ВПГ IgМ и IgА в крови. Учитывая высокую диагностическую значимость определения ДНК вируса методом ПЦР и наличие зависимости между летальностью у новорожденных и виремией, вызванной ВПГ, некоторые исследователи рекомендуют использовать этот метод для лабораторного скрининга генерализованной герпетической инфекции детей, относящихся к группе высокого риска.

Выявление АГ-ВПГ в различных биологических пробах предлагается применять в качестве экспресс-тестов для дифференцирования типов вируса при скрининге популяций с высоким уровнем заболеваемости, а также при мониторинге заболевания.

У больных ВИЧ-инфекцией с атипичными клиническими проявлениями кожных поражений в диагностике отдается предпочтение выявлению ДНК ВПГ методом ПЦР как самому чувствительному методу лабораторной диагностики.

Особенности интерпретации результатов. Обнаружение вирусоспецифических АТ IgM может свидетельствовать о первичной инфекции, реже – о реактивации или реинфекции, выявление АТ-ВПГ IgА – об активности инфекционного процесса (затяжное течение при дебюте герпетической инфекции, реинфекции или реактивации). О врожденной инфекции (неонатальный герпес) свидетельствует присутствие АТ-ВПГ IgM и(или) IgА. Выявление АТ IgG отражает латентную инфекцию (инфицирование).

Выявление ДНК ВПГ свидетельствует о наличии активной (репликативной) стадии вирусной инфекции с учетом выраженности клинических проявлений. Выявление ДНК ВПГ-1 и/или ВПГ-2 методом ПЦР позволяет при однократном тестировании установить факт внутриутробного инфицирования плода; при проведении обследования в первые 24–48 ч после рождения лабораторно подтвердить врожденную инфекцию, вызванную ВПГ.

Диагностическое значение (специфичность и чувствительность) обнаружения ДНК ВПГ в СМЖ у больных ВИЧ-инфекцией с поражением ЦНС окончательно не установлены. Возможно, для подтверждения герпетической этиологии энцефалита необходимо определение концентрации ДНК ВПГ в СМЖ. Исследование для обнаружения ДНК ВПГ в крови малоинформативно в связи кратковременным нахождением ВПГ в сосудистом русле, следовательно, возможно получение отрицательного результата несмотря на развитие клинически выраженного заболевания.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

! Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Читайте также: