III-яя глава: Режим, применяемый к почетным консульским должностным лицам и консульским учреждениям, возглавляемым такими должностными лицами.
Биологическая обусловленность онтогенеза поведения животных
Биологическая ограниченность интеллекта животных
Биологическое загрязнение окружающей человека среды. Карантинные виды растений и животных. Нежелательные интродуценты.
БОЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
В чем сходство и различие психики животных и человека?
Вид, его признаки. Многообразие видов. Редкие и исчезающие виды растений и животных, меры их сохранения. Назовите известные вам редкие и исчезающие виды растений.
Влажность в наземно-воздушной среде. Адаптации растений и животных.
Вторая глава
Высшие формы игровой исследовательской деятельности животных
Микозы — это заболевания домашних, диких животных и птиц, которые вызываются микроскопическими грибами. От больных животных часто заражается человек, поэтому многие микозы следует отнести к зооантропонозам.
Большинство возбудителей грибковых инфекций принадлежат к условно-патогенным микроорганизмам (например, грибы канди* да, актиномицеты, нокардии). Нередко микозы осложняют основное соматическое заболевание.
Все микозы условно можно разделить на две группы: поверхностные и глубокие. При поверхностных поражаются кожа и ее придатки (волосы, когти, у птиц перья), а при глубоких— внутренние органы. Отметим, что это деление относительно, так как возбудители поверхностных заболеваний при определенных условиях, проникая во внутренние органы, вызывают болезнь.
Трихофития, микроспория и фавус.Эти болезни входят в группу поверхностных микозов. Трихофитии (стригущем лишае)
более подвержены крупный рогатый скот, особенно телята, а также овцы и лошади. На коже появляются воспалительные очаги с шелушащейся поверхностью; волосы становятся тусклыми, ломкими, обламываются, образуются участки облысения.
Микроспорией нередко болеют кошки, собаки, пушные звери, а также лошади и мышевидные грызуны. На коже морды, на шее, у основания хвоста образуются очаги облысения; нередко поражаются усы, брови; волосы обламываются.
Ф а в у с (парша) регистрируется чаще среди птиц: кур, индеек, уток. На гребне, сережках образуются скутулы. У основания перьев появляется белый чехол, под которым кожа атрофируется, сальные и потовые железы разрушаются, перья выпадают.
Лабораторная диагностика. Заключается в микроскопии патматериала и его посевах на питательные среды.
Обычно исследуют соскоб кожных чещуек из очага поражения и волосы, которые выдергивают пинцетом. Волосы ножницами режут на кусочки 1. 2 мм, чешуйки с помощью иглы помещают на 20 мин в каплю 20%-го КОН для просветления материала. Затем их переносят на предметное стекло, добавляют каплю глицерина, покрывают предметным стеклом и микроскопируют под сухой системой микроскопа (объектив х40).
Для более точной диагностики прибегают к выделению чистой культуры гриба путем посева на специальные среды. Чаще используют среду Сабуро и сусло-агар. Ввиду того что исследуемый материал обычно контаминирован посторонней флорой, перед посевом к расплавленному агару добавляют антибиотики: пенициллин, стрептомицин (200 ЕД/мл) или левомицетин. В пробирки со скошенной средой помещают маленькие кусочки волос или чешуек на поверхность скоса. Выращивание производят при 26 °С в течение 21 сут. Обычно выделение чистой культуры осуществляют в микологической лаборатории.
Для точной идентификации выделенной культуры учитывают: характер мицелия; наличие воздушного и субстратного мицелия и его окраску; наличие конидий и хламидоспор; присутствие арт-роспор.
Наиболее часто трихофитию вызывают Т. faviforme, T. equinum, Т. mentographites, микроспорию — М. canis и М. gypseum; фавус — Achorion gallinae.
Кандидоз.Кандидозом чаще поражается молодняк сельскохозяйственных животных и домашняя птица при неправильном
кормлении, авитаминозах, дисбактериозе и бессистемном длительном лечении антибиотиками, особенно широкого спектра действия.
На слизистой полости рта, языка, половых органов появляются плотные наложения молочно-белого цвета, тесно спаянные с подлежащей тканью. При попытке снять эту пленку пинцетом может возникнуть кровотечение. Дальнейшее развитие процесса приводит к поражению кишечника, легких, почек и других внутренних органов и гибели животных.
Возбудителями служат дрожжеподобные грибы кандида: крупные клетки округлой или яйцевидной формы, размножающиеся почкованием.
Лабораторная диагностика. Заключается в микроскопическом исследовании пленчатых наложений со слизистых оболочек, фекалий, мочи, а в случае гибели животных — внутренних органов.
При микроскопии обнаруживают почкующиеся округлые клетки — бластоспоры, диаметром примерно 5 мкм, а также нити псевдомицелия. Для подтверждения диагноза следует обращать внимание на количество обнаруженных клеток, так как кандида являются представителями нормальной микрофлоры и обычно присутствуют на слизистых и кожных покровах. Лишь резкое увеличение их числа в исследуемом материале от животных указывает на кандидоз. Наиболее частым возбудителем является Candida albicans, хотя другие виды также могут быть причиной заболевания (С. krusei, С. tropicalis и др.).
Точное определение вида осуществляют в микологической лаборатории на основании следующих признаков: наличие хламидоспор, тип филаментации, сахаролитические свойства.
Плесневые микозы (аспергиллез, пенициллез, мукоромикоз).В клинических проявлениях этой группы микотических заболеваний, а также в патогенезе есть много общего, поэтому их следует рассматривать вместе.
Аспергиллезом преимущественно болеет домашняя птица при аэрогенном инфицировании в результате антисанитарных условий содержания, использования заплесневелого корма, подстилки и др. Поражаются воздухоносные пути, появляется кашель, из клюва и носа выделяется серозная жидкость. При вскрытии в легочной ткани и других органах обнаруживают множество узелков серовато-желтого цвета.
Кроме птиц аспергиллезом болеет крупный и мелкий рогатый скот, обычно ослабленный в результате длительной сопутствующей инфекции, иммунодефицита.
Пенициллезом также болеют ослабленные животные с легочной патологией, но иногда могут регистрироваться и кожные проявления.
Мукоромикозом животные инфицируются нередко аэрогенно, а также в результате травматических повреждений кожных и слизистых покровов.
Лабораторная диагностика. Лабораторная диагностика плесневых микозов заключается в микроскопии патмате-риала. Чаще всего это секционный материал, так как прижизненно точный диагноз ставят редко. При микроскопии обнаруживают широкий ветвящийся мицелий (септированный или несептиро-ванный), конидиеносцы с конидиями, нередко спорангии со спорами (при мукоромикозе). Точную идентификацию грибов проводят в микологической лаборатории.
Наиболее частыми этиологическими агентами при аспергилле-зе являются A. fumigatus, A.flavus, A. niger, при пенициллезе — P. glaucum, при мукоромикозе — М. corymbifera, M. racemosus.
Актиномикоз, нокардиоз, актинобациллез.Актиномикоз, по-видимому, самый распространенный глубокий микоз сельскохозяйственных животных в РФ. Болеют основные виды сельскохозяйственных животных: крупный рогатый скот, свиньи, лошади. Актиномикоз протекает длительно, начинаясь с очагов уплотнения в области головы, нижней челюсти, шеи, которые затем размягчаются, образуя свищи с гнойным отделяемым. В гное можно обнаружить мелкие желтоватые зерна размером с просяное зерно — друзы.
Для этой болезни характерно поражение костей (крупный рогатый скот), а у свиней — миндалин и молочной железы. Часто в процесс вовлекаются легкие.
Актиномицеты, по современным воззрениям, стоят ближе к бактериям, чем к грибам, поэтому иногда болезни, которые вызывают актиномицеты, называют псевдомикозами. Возбудителями болезни животных является Actinomyces bovis, а человека — А. Israeli.
Нокардиоз — болезнь крупного и мелкого рогатого скота, при которой в первую очередь в гнойный процесс вовлекаются лимфатические узлы и сосуды, а также легкие, центральная нервная система и вымя. Лимфатические узлы различной локализации размягчаются, из них выделяется гной. Очень тяжелые формы нокардиоза — легочная (трудно отличить от туберкулеза) и менин-гиальная. Наиболее часто нокардиоз вызывает Nocardia asteroids — аэробный проактиномицет.
Актинобациллез (псевдоактиномикоз) — хроническая болезнь, для которой характерно поражение мягких тканей головы и шеи. В отличие от актиномикоза кости в процесс не вовлекаются. Болеют крупный и мелкий рогатый скот, свиньи.
При актинобациллезе образуются абсцессы в области головы, поражаются язык, подкожная ткань, молочная железа. Характерно системное воспаление лимфатических узлов. В гное истинные
друзы не встречаются, хотя иногда имеются хлопья. Возбудитель — В. ligniersi.
Actinomyces bovis — анаэроб, требовательный к питательным средам. Друзы высевают на сердечно-мозговой, кровяной или сывороточный агар. Через 10. 14сут выращивания при 37 °С в глубине столбика среды появляются белые колонии диаметром 2. 3 мм, состоящие из грамположительных тонких нитей.
Главный признак, дифференцирующий нокардиоз и актиномикоз, состоит в том, что при нокардиозе в патматериале никогда не встречаются друзы. Труднее отличить тонкий кислотоустойчивый мицелий нокардий от туберкулезной палочки, особенно когда нити мицелия распадаются на бациллярные элементы.
Нокардий образуют на среде Сабуро или МПА при 37 °С гладкие или складчатые колонии мягкой консистенции. Иногда наблюдается пигментообразование. При микроскопии патматериала в окрашенных мазках видны тонкие грамположительные нити мицелия и отдельные бациллярные элементы.
В окрашенных мазках из гноя при актинобациллезе видны грам-отрицательные палочки и нитевидные формы. Возбудитель растет при 37 °С в аэробных условиях на богатых питательных средах.
Дата добавления: 2015-02-10 ; просмотров: 36 ; Нарушение авторских прав
Лабораторная диагностика микозов и микотоксикозов
Запасы кормов сравнительно часто могут быть поражены различного рода грибами. Пораженные грибной или другой микрофлорой корма могут быть источником тяжелых и часто массовых отравлений сельскохозяйственных животных. Различными видами грибов и разнообразной бактериальной микрофлорой могут заражаться или живые растения на корню во время роста, или уже заготовленные запасы кормов при их хранении.
В зависимости от механизма воздействия грибов на организм кормовые заболевания (или микотические заболевания) животных разделяются на микозы и микотоксикозы [4].
Для микозов характерным является го, что грибы, попадающие в организм с кормом, прорастают и размножаются в их или иных органах и тканях его и оказывают как местное, так и общее действие на организм. Микотоксикозы отличаются тем, что воздействие оказывают токсины, выделяемые развивающимися на кормах грибами [2].
При оценке санитарного качества кормов зооветеринарные врачи должны учитывать следующие обстоятельства:
1) является ли отобранная проба типичной для данного вида корма. В момент возникновения микотоксикозов пробы кормов или фуража, предназначенных для анализа или опытов со скармливанием подозреваемых кормов, должны отражать все имеющиеся источники кормления. Воздействие на животных микотоксинов, содержащихся в небольших концентрациях в кормах, может быть не совсем четким и проявиться через несколько недель или даже месяцев после их скармливания. Степень поражения кормов грибами может быть различной внутри одного хранилища и даже среди зерен одного кукурузного початка, поэтому очень важна техника взятия проб;
2) отвечает ли проба взятых кормов необходимым вкусовым качествам и действительно ли корм был скормлен пораженным животным. Достаточно выраженный признак поражения корма плесневым грибом — отказ животных от его потребления и в дальнейшем снижение продуктивности;
3) необходимо учитывать технологический процесс изготовления или обработки кормов, изменяющий их токсичность. Тепло, химические вещества и солнечный свет — факторы, нарушающие первоначальную структуру и активность метаболитов плесневых грибов. Методика токсико-микологического контроля качества кормов включает следующие приемы:
• отбор проб кормов для исследований;
• органолептический анализ кормов;
• токсико-биологический анализ кормов;
• микологический анализ кормов с определением токсичности выделенных культур грибов;
• заключение и оценка кормов по результатам исследований, возможные методы обезвреживания [5].
Взятие проб кормов. Необходимо учитывать, что грибы неодинаково распределены на растениях в поле или кормах внутри хранилища. Исследованиями установлено, что наибольшее количество ошибок (до 33%) при определении токсинов в различных кормах возникает в процессе взятия проб. Учитывая это, необходимо руководствоваться следующими рекомендациями:
• пробы кормов следует брать в различных стадиях процесса их получения — из растущих культур, во время транспортировки и хранения;
• если зараженные участки смешались с нормальными недавно, нужно брать большую пробу;
• небольшие пробы берут периодически, через определенные промежутки времени, а затем соединяют, перемешивают и уже из этой смеси берут пробы для анализа [1].
Органолептический анализ — это определение запаха, цвета корма. Для усиления ощущения запаха зерна, клочка сена или соломы в стакан с образцом корма заливают горячую воду (60-70°) и, покрыв стакан стеклом, оставляют на 2-3 минуты; затем воду сливают и определяют запах корма. Для определения цвета грубые корма, зерно, жмыхи и шроты исследуют на белой бумаге при рассеянном свете. При осмотре комбинированных и мучнистых кормов (отруби и др.) определяют их сыпучесть. На грубых кормах при развитии грибов наблюдается потемнение, побурение, слежавшиеся пласты, в случае зерновых кормов — зерна становятся тусклыми и часто потемневшими.
Токсико-биологический анализ кормов включает в себя определение токсичности корма путем введения экстракта в желудок белым мышам и алиментарные фобы на малоценном животном [3].
Определение токсичности выделениях культур грибов включает в себя вычленив грибов из корма, количественны учет и дифференциацию их, выделение чистых культур из первичных посевов и определение их токсичности.
2. Горина О.В. Зоогигиеническая оценка микологического пейзажа подстилочных материалов при выращивании молодняка птицы [Текст] // Известия с/х науки Тавриды. – 2014. - №160. – С. 7.
4. Зыкин, Л. Ф. Клиническая микробиология для ветеринарных врачей [Текст] : учеб. пособие для студ. вузов, обуч. по спец. "Ветеринария" / Л. Ф. Зыкин, З. Ю. Хапцев ; Международная ассоциация "Агрообразование". - М. : КолосС, 2006. - 96 с.
При поражении организма грибками крайне сложно вовремя обнаружить заболевание и выявить возбудителя. Довольно проблематична диагностика микозов, по той причине, что заболевание не проявляется никакими признаками либо имеет очень разнообразную симптоматику. В зависимости от того какой участок заражен паразитами для диагностики берут волосы, зараженные ногти, часть кожи, мокроту, кровь, небольшую часть внутреннего органа или лимфоузлов. Микоз — довольно серьезное поражение паразитами кожных покровов и внутренних органов, которое способно значительно навредить здоровью человека. Крайне важно своевременно провести качественную диагностику, которая заключается в лабораторных исследованиях.
Важность своевременной диагностики микоза
Микоз — достаточно серьезное поражение паразитами кожных покровов и внутренних органов. Заболевание способно нанести непоправимый вред здоровью, а порой и привести к летальному исходу. Поэтому крайне важно своевременно выявить патологию и предупредить развитие осложнений. В противном случае на коже возникают пятна, которые имеют свойство загнаиваться и лопаться с последующим вытеканием гноя. Возникает неприятный запах, который сложно устранить. С помощью ранних диагностических процедур у больных можно провести своевременное противогрибковое лечение с применением антифунгальных средств широкого спектра действия. Такая терапия позволит предотвратить распространение микоза по всему организму.
Первый прием
При подозрении на микоз кожи или внутренних органов следует незамедлительно обратиться к дерматологу, а если есть возможность, к микологу. Эти специалисты в первую очередь проводят опрос больного, чтобы выяснить возможные пути инфицирования. Врач уточняет, не работал ли больной последнее время с животными или птицами, которые переносят паразитов. Крайне важно выяснить, в каких жилищных условиях обитает человек, не был ли он в неблагоприятных регионах. Затем проводится осмотр, в результате которого выявляются поврежденные кожные покровы, и определяется масштабность поражения. В процессе осмотра врач обращается внимание на иммунодефицитные состояния больного. Для диагностики микозов производится забор материала, который затем отправляют на лабораторное исследование.
Лабораторная диагностика
Самыми эффективными методами диагностирования микозов кожи являются различные лабораторные исследования, которые способны выявить возбудителя и помочь в подборе схемы терапии. Для выявления возбудителя микоза назначают такие лабораторные исследования:
гистологический анализ;
бактериологический посев;
иммунологическое исследование;
ПЦР-диагностирование;
культуральное обследование;
микробиологические исследования.
Вернуться к оглавлению
Микробиологическая диагностика является наиболее распространенным и самым простым методом выявления микоза в крови и на коже. Для выявления точного диагноза, следует знать, как правильно собирать материал, который необходим при исследовании. Пораженные волосы следует собирать при помощи пинцета. Если инфицирована кожа, то для микроскопии следует соскоблить с поврежденного участка кожный покров. Весь забранный материал помещают в 30% раствор гидроксида калия, а затем на предметное стекло. Микробиологическая диагностика способна выявить, где именно расположен грибок (внутри или снаружи волоса, кожи) и его размеры.
Чтобы предотвратить ошибочный диагноз микоза, следует правильно и грамотно забирать материал для микробиологического обследования.
В медицине существуют такие методы микробиологической диагностики:
Микроскопия с применением нативных или неокрашенных препаратов. Для этого материал осветляют с помощью 10—30% растворов гидроксида калия или натрия. Затем обработанный материал кладут на лабораторное стеклышко, куда предварительно накапали немного глицерины. Сверху прикрывают стеклянной пластинкой и проводят анализ.
Микроскопию окрашенных препаратов проводят несколькими способами, которые идентифицируют бактерии, дифференцируют различные бактерии и выявляют разные грибы.
Вернуться к оглавлению
Сбор бактериологического посева на питательную среду является точным способом диагностики микоза. Учитывая внешний вид и характеристики выросшей колонии грибка, дерматолог устанавливает тип возбудителя, вызвавшего микоз. Единственный минус обследования в том, что требуется много времени, чтобы вырастить колонию. В среднем необходимо около 3-х недель, чтобы выяснить штамм возбудителя. В некоторых случаях метод не приносит ожидаемых результатов.
Метод ПЦР-диагностирования предполагает выявление возбудителя микоза с применением полимеразной цепной реакции. При обследовании увеличивается чувствительность гибридизации, что повышает содержимое вирусного ДНК в исследуемом материале. Этот метод обследования является новым и требует нескольких анализов от пациента. Считается, что такой вид диагностики достаточно затратный, но дает точные результаты.
Культуральные диагностические мероприятия рекомендуются на финальном этапе постановки диагноза. Метод заключается в получении культуры грибка, которая потом отправляется на обследование с помощью микроскопа. Полученный материал кладут на искусственно созданную питательную среду и выявляют род возбудителя, внешний вид, размеры. После чего показано специальное лечение, которое направлено на борьбу с конкретным видом возбудителя микоза.
Иммунологический анализ часто применяется при подозрении на микозы крови. Этот метод предполагает обследование крови, спинномозговой жидкости или урины на наличие возбудителя. При иммунологической диагностике используют коммерческие тест-системы, которые выявляют специфические антигены в биоматериале. С помощью этих методов можно выявить специфичные антитела в сыворотке крови.
Гистологический анализ способен выявить грибки в тканях, волосах, ногтях. При обследовании применяются гистологические окрасы. Чаще всего применяют периодическую кислотную реакцию, поскольку она является максимально информативной. При диагностике грибы проявляются в незначительном количестве и имеют вид спор или нитей мицелия.
Дифференциальный анализ
В связи с тем, что при разных видах микоза проявляются различные симптомы. Это затрудняет постановку точного диагноза. В таком случае медики прибегают к методу дифференциальной диагностики и сравнивают микоз с другими дерматологическими болезнями. Нередко симптомы псориаза путают с микозом, но важно знать, что при микозе соскабливаемые чешуйки не будут кровоточить, в отличие от псориатических бляшек.
Часто микоз путают с парапсориазом, который имеет похожую симптоматику, но не отмечается шелушением кожи.
Важно дифференцировать микоз от нуммулярной экземы. Такое заболевание является особым видом экземы, но выявить это можно лишь при лабораторной диагностике. Часто признаки микоза принимают за проявления полиморфного фотодерматоза, который свойствен только для взрослых. Он никогда не диагностируется у детей.
Проведение лабораторной и дифференциальной диагностики — важная мера при постановке точного диагноза и назначения необходимого лечения. Чтобы устранить до конца признаки микоза, требуется достоверно выявить возбудителя. При несвоевременном проведении диагностических процедур, патология прогрессирует и поражает все большую часть кожи и внутренних органов, вызывая осложнения.
Занятие 5 МИКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КОРМОВ
Цель занятия. Ознакомиться с приемами микологического анализа кормов.
Общие сведения. Для выявления наличия грибов корма сеют на питательные среды, получают чистые культуры из первичных посевов, проводят их количественный учет, изучают морфологию, определяют токсичность. Если на кормах отмечают поверхностные поражения, грибной налет, проводят микроскопические исследования для установления рода, а иногда и вида гриба.
Содержание занятия. Первичные посевы. Для первичного выделения грибов из мучнистых, зерновых кормов используют обычно агаровую среду Чапека, а для выделения грибов из грубых кормов — влажные камеры. Для дифференциации видов и разновидностей грибов в каждом отдельном случае применяют специальные методы и приемы культивирования.
Заражение зерна грибами может быть поверхностным (заспорение) и глубинным (поражение). Для выявления глубинного поражения проводят дезинфекцию зерна 3%-ным раствором формалина (за основу берут 40%-ный формальдегид) или водным раствором сулемы (1 : 1000).
Зерна (50 штук), завернутые в марлевую салфетку, помещают в стаканчик с дезинфицирующим раствором. Через 1 —2 мин их переносят в стаканчик со стерильной водой, к которой для нейтрализации формалина добавляют 2—3 капли 5%-ного раствора аммиака. Затем воду сливают и стерильным пинцетом переносят зерна на питательную среду (агар Чапека) так, чтобы они не соприкасались. Мелкие зерна (пшеница, овес, ячмень, рожь, просо и др.) раскладывают по 10 штук на чашке, крупные (кукуруза, бобы, горох) — по 5. Крупные зерна рекомендуется после дезинфекции разрезать пополам или расщепить. Число чашек при посеве мелких зерен должно быть не менее 5, а при посеве крупных — не менее 10.
Выявление поверхностной микрофлоры, необходимое для контроля зерна на зараженность патогенным грибом, проводят путем раскладывания зерен по поверхности среды без предварительной поверхностной дезинфекции. Число посеянных зерен должно быть не менее 20.
Если имеется подозрение на поражение зерна грибами целлюлозоразрушителями (Dendrodochium toxicum, Stachybotrys alternans и др.), их сеют дополнительно во влажные камеры со средой Ван-Итерсона (или стерильной водой).
Для выделения грибов Dendrodochium toxicum, Stachybotrys alternans из грубых кормов применяют влажные камеры. На дно чашки Петри кладут тонкий слой ваты и на нее помещают кружок фильтровальной бумаги (по диаметру чашки), затем чашки стерилизуют и перед посевом фильтровальную бумагу увлажняют небольшим количеством стерильной среды Ван-Итерсона (или стерильной воды).
Солому, сено нарезают кусочками длиной по 2 см и переносят стерильным пинцетом в три чашки Петри с агаризированной средой, раскладывают их по 10 кусочков в каждую чашку, а в три влажные камеры помещают не менее 90 кусочков из той же пробы (по 30 кусочков в каждую чашку).
Для выделения гриба Dendrodochium toxicum, развивающегося внутри стебля растения, стебель предварительно расщепляют или разрезают вдоль.
Нарезанный силос и измельченный жмых для выделения грибов раскладывают по 10 кусочков на поверхности агара Чапека.
Для выделения грибов из муки, отрубей, комбикорма, шротов мясо-костной муки пользуются методом разливки. Для этого образец гранулированного или брикетированного корма предварительно размалывают на лабораторной мельнице. Корм (10 г) помещают в колбу со 100 мл стерильного 0,1%-ного раствора поверхностно- активного вещества (ОП-7, ОП-10, твин-80) в дистиллированной воде. Затем пробу встряхивают на шуттель-аппарате в течение 15— 20 мин. Из полученной взвеси № 1 (1 : 10) готовят последующие разведения, используя также стерильные растворы вышеназванных поверхностно-активных веществ (ПАВ), следующим образом: 1 мл взвеси переносят стерильной градуированной пипеткой (конец пипетки следует обрезать для свободного прохождения частиц комбикорма, после чего пипетка должна быть от калибрована на 1 мл) в пробирку с 9 мл раствора ПАВ и получают взвесь № 2(1 : 100). Из полученной взвеси № 2 готовят аналогичным образом взвесь № 3 (1 : 1000) и, если необходимо, взвесь №4(1:10 000). Перед взятием очередной порции взвеси как для получения дальнейшего разведения, так и для посева необходимо тщательно перемешивать взвесь пипеткой, а также промывать пипетку во взвеси не менее 5 раз.
Посев проводят сразу после приготовления последней взвеси (№ 3 или № 4), не давая ей отстояться. При этом 1 мл взвеси равномерно распределяют по всей поверхности питательной среды.
Число чашек, необходимых для посева, зависит от разведения: при разведении 1 : 1000 требуется 5 чашек, при разведении 1 : 10 000-8.
Культивирование посевов. Чашки Петри с посевами завертывают в стерильную бумагу, помещают в термостат и выдерживают при температуре 22—25 °С в течение 7—10 сут. Рост и спороношение грибов становятся заметными уже через 3 сут. Однако для идентификация грибов необходимо большее время культивирования — 5—7 сут.
Для выявления гриба Asp. fumigatus в комбикормах пробу (10 г) взвешивают с точностью до 0,01 г и тщательно перемешивают. Корм высевают в разведении 1 : 1000.
Выявление Asp. fumigatus в зерне проводят путем посева зерен без предварительной дезинфекции, однако для количественного учета гриба необходимо предварительно измельчить зерна и провести их посев способами, изложенными выше.
Показателем степени засоренности корма грибом служит число диаспор (грибных зародышей) в 1 г исследуемого корма, которое определяют после подсчета выросших колоний с учетом количества посеянного материала и степени разведения.
Количественный учет грибов. В мучнистых кормах подсчет колоний после посева начинают на 2—3-й сутки. Для облегчения подсчета дно чашки размечают карандашом на секторы или используют счетную камеру Вольфюгеля.
Проводят 2—3 последовательных подсчета. Общее число колоний данного вида гриба определяют в пересчете на 1 г исследуемого корма.
Пример расчета. Комбикорм в разведении 1:1000 посеян в 5 чашках. Количественный и качественный учет показал, что в 5 чашках выросло 7 колоний Asp. fumigatus. Число зародышей этого вида гриба в 1 г комбикорма равно 7 ¦ 1000 : 5 = 1400.
В зернофураже определение степени глубинного поражения зерна проводят ориентировочно, выводя процентное соотношение выросших колоний каждого вида гриба к общему числу посеянных зерен.
Пример расчета. 50 зерен пшеницы посеяно в 5 чашках с агаром. Во всех 5 чашках выросло 3 колонии Fusarium sporotr., что составляет 6 % числа посеянных зерен.
Более точный учет грибов в зернофураже (а также в грубых кормах) можно провести, предварительно измельчив корм и посеяв так же, как мучнистые корма.
Выделение чистых культур грибов из первичных посевов. Родовую, а в ряде случаев и видовую принадлеж-ность грибов устанавливают в первичном посеве, однако часто вид гриба определяют после выделения его в чистую культуру. Для этого применяют два метода: метод непосредственного пересева и метод разделения. Получение чистых культур необходимо для дальнейшего изучения их токсигенности.
Метод непосредственного пересева — иглой, загнутой под тупым углом, осторожно захватывают кусочек мицелия и помещают его на поверхность питательной среды. При этом следует избегать комкания, скручивания или прочих деформаций подхваченного кусочка мицелия. В случае обильного спороношения у гриба сухой иглой переносят минимальное количество спор (метод сухой иглы).
При работе с грибами нельзя производить посевы штрихом, а тем более зигзагообразным штрихом. Допускается только легкое касание в одном месте (если посев проводится в пробирку, то посередине ее) поверхности среды иглой, несущей споры или мицелий.
Метод непосредственного пересева возможен только тогда, когда в чашке с первичными посевами имеются достаточно чистые колонии или когда необходимо возобновить чистую культуру с целью длительного поддерживания культуры гриба.
Метод разделения применяют в двух случаях.
1. Если колонии загрязнены другими грибами или бактериями. Это устанавливают обычно визуально, готовя 3—4 последовательных разведения взвеси спор гриба в стерильном 0,1%-ном растворе твина-80 в воде, и высевают из одного-двух последних разведений по 1 мл на поверхность агара в чашки Петри, распределяя взвесь шпателем или наклоняя чашку в разные стороны.
2. При наличии обильного спороношения. Разделение проводят с помощью посева — коснувшись стерильной влажной иглой (или крючком) ограниченного участка спороносящей поверхности, проводят штрихом по поверхности агаровой пластинки в чашке Петри.
Культивируют посевы при 22—25 °С. Сроки культивирования в зависимости от рода и вида гриба различны — до образования характерного спороношения.
По истечении срока культивирования гриба проводят макроскопическое изучение колоний. При этом обращают внимание на их цвет и форму, характер роста (распростертые или компактные), растущий край колонии (гладкий или извилистый), окраску субстратного мицелия, на наличие или отсутствие пигмента, выделенного в субстрат, цвет пигмента, на степень развития воздушного мицелия, наличие или отсутствие склероцитов.
Микроскопическое исследование грибов проводят прежде всего непосредственно в чашках, пользуясь только малым увеличением микроскопа (МБС-1, МБС-2). При этом выявляют наличие мицелиальных тяжей склероцитов плодовитых тел, строение и характер ветвления спорангиеносцев или конидиеносцев, форму спорангия мукоровых грибов или головки аспергиллов, расположение конидий (цепочками или одиночно) и т. д.
Затем готовят препараты для детального изучения морфологии гриба. Частицы гриба в зависимости от вида берут из различных мест колонии: в старых частях колонии из центра, в более молодых по краям.
На предметное стекло наносят каплю фиксирующей жидкости. Затем иглой осторожно берут небольшое количество мицелия гриба, стараясь не повредить его, и вносят в каплю жидкости, аккуратно снимая его другой иглой. Препарат накрывают покровным стеклом, оттянув избыток жидкости кусочком фильтровальной бумаги.
Фиксирующей жидкостью, наиболее пригодной для приготовления препаратов грибов из рода Aspergillus, Penicillium и ряда других, служит лактофенол Аммана (дистиллированная вода — 1 часть, молочная кислота — 1 часть, глицерин — 2 части, фенол — 1 часть). Прежде чем поместить материал в эту жидкость, его следует крат-ковременно обработать 70°-ным этиловым спиртом.
Для изучения грибов из рода Fusarium и некоторых других используют жидкость, состоящую из равных частей дистиллированной воды, этилового спирта и глицерина. При этом исследуемый материал не обрабатывают 70°-цым этиловым спиртом. Для улучшения видимости контуров конидий и перегородок в них к 100 мл указанной жидкости добавляют 0,5—1 мл 0,01%-ного водного или спиртового раствора метилового синего.
Оба вышеназванных фиксатора позволяют хранить препарат в течение долгого времени.
С помощью малого (х8, х10), а затем большого (х40, х90) увеличения микроскопа изучают препараты и, пользуясь специальными определителями с микроскопическими ключами, идентифицируют грибы.
