Питательные среды для микоза

27 апреля 2017, 11:38 Эксперт статьи: Блинова Дарья Дмитриевна 0 5,260

При поражении организма грибками крайне сложно вовремя обнаружить заболевание и выявить возбудителя. Довольно проблематична диагностика микозов, по той причине, что заболевание не проявляется никакими признаками либо имеет очень разнообразную симптоматику. В зависимости от того какой участок заражен паразитами для диагностики берут волосы, зараженные ногти, часть кожи, мокроту, кровь, небольшую часть внутреннего органа или лимфоузлов. Микоз — довольно серьезное поражение паразитами кожных покровов и внутренних органов, которое способно значительно навредить здоровью человека. Крайне важно своевременно провести качественную диагностику, которая заключается в лабораторных исследованиях.

Важность своевременной диагностики микоза

Микоз — достаточно серьезное поражение паразитами кожных покровов и внутренних органов. Заболевание способно нанести непоправимый вред здоровью, а порой и привести к летальному исходу. Поэтому крайне важно своевременно выявить патологию и предупредить развитие осложнений. В противном случае на коже возникают пятна, которые имеют свойство загнаиваться и лопаться с последующим вытеканием гноя. Возникает неприятный запах, который сложно устранить. С помощью ранних диагностических процедур у больных можно провести своевременное противогрибковое лечение с применением антифунгальных средств широкого спектра действия. Такая терапия позволит предотвратить распространение микоза по всему организму.

Первый прием

При подозрении на микоз кожи или внутренних органов следует незамедлительно обратиться к дерматологу, а если есть возможность, к микологу. Эти специалисты в первую очередь проводят опрос больного, чтобы выяснить возможные пути инфицирования. Врач уточняет, не работал ли больной последнее время с животными или птицами, которые переносят паразитов. Крайне важно выяснить, в каких жилищных условиях обитает человек, не был ли он в неблагоприятных регионах. Затем проводится осмотр, в результате которого выявляются поврежденные кожные покровы, и определяется масштабность поражения. В процессе осмотра врач обращается внимание на иммунодефицитные состояния больного. Для диагностики микозов производится забор материала, который затем отправляют на лабораторное исследование.

Лабораторная диагностика

Самыми эффективными методами диагностирования микозов кожи являются различные лабораторные исследования, которые способны выявить возбудителя и помочь в подборе схемы терапии. Для выявления возбудителя микоза назначают такие лабораторные исследования:

гистологический анализ;
бактериологический посев;
иммунологическое исследование;
ПЦР-диагностирование;
культуральное обследование;
микробиологические исследования.

Вернуться к оглавлению

Микробиологическая диагностика является наиболее распространенным и самым простым методом выявления микоза в крови и на коже. Для выявления точного диагноза, следует знать, как правильно собирать материал, который необходим при исследовании. Пораженные волосы следует собирать при помощи пинцета. Если инфицирована кожа, то для микроскопии следует соскоблить с поврежденного участка кожный покров. Весь забранный материал помещают в 30% раствор гидроксида калия, а затем на предметное стекло. Микробиологическая диагностика способна выявить, где именно расположен грибок (внутри или снаружи волоса, кожи) и его размеры.

Чтобы предотвратить ошибочный диагноз микоза, следует правильно и грамотно забирать материал для микробиологического обследования.

В медицине существуют такие методы микробиологической диагностики:

Микроскопия с применением нативных или неокрашенных препаратов. Для этого материал осветляют с помощью 10—30% растворов гидроксида калия или натрия. Затем обработанный материал кладут на лабораторное стеклышко, куда предварительно накапали немного глицерины. Сверху прикрывают стеклянной пластинкой и проводят анализ.
Микроскопию окрашенных препаратов проводят несколькими способами, которые идентифицируют бактерии, дифференцируют различные бактерии и выявляют разные грибы.

Вернуться к оглавлению

Сбор бактериологического посева на питательную среду является точным способом диагностики микоза. Учитывая внешний вид и характеристики выросшей колонии грибка, дерматолог устанавливает тип возбудителя, вызвавшего микоз. Единственный минус обследования в том, что требуется много времени, чтобы вырастить колонию. В среднем необходимо около 3-х недель, чтобы выяснить штамм возбудителя. В некоторых случаях метод не приносит ожидаемых результатов.

Метод ПЦР-диагностирования предполагает выявление возбудителя микоза с применением полимеразной цепной реакции. При обследовании увеличивается чувствительность гибридизации, что повышает содержимое вирусного ДНК в исследуемом материале. Этот метод обследования является новым и требует нескольких анализов от пациента. Считается, что такой вид диагностики достаточно затратный, но дает точные результаты.

Культуральные диагностические мероприятия рекомендуются на финальном этапе постановки диагноза. Метод заключается в получении культуры грибка, которая потом отправляется на обследование с помощью микроскопа. Полученный материал кладут на искусственно созданную питательную среду и выявляют род возбудителя, внешний вид, размеры. После чего показано специальное лечение, которое направлено на борьбу с конкретным видом возбудителя микоза.

Иммунологический анализ часто применяется при подозрении на микозы крови. Этот метод предполагает обследование крови, спинномозговой жидкости или урины на наличие возбудителя. При иммунологической диагностике используют коммерческие тест-системы, которые выявляют специфические антигены в биоматериале. С помощью этих методов можно выявить специфичные антитела в сыворотке крови.

Гистологический анализ способен выявить грибки в тканях, волосах, ногтях. При обследовании применяются гистологические окрасы. Чаще всего применяют периодическую кислотную реакцию, поскольку она является максимально информативной. При диагностике грибы проявляются в незначительном количестве и имеют вид спор или нитей мицелия.

Дифференциальный анализ

В связи с тем, что при разных видах микоза проявляются различные симптомы. Это затрудняет постановку точного диагноза. В таком случае медики прибегают к методу дифференциальной диагностики и сравнивают микоз с другими дерматологическими болезнями. Нередко симптомы псориаза путают с микозом, но важно знать, что при микозе соскабливаемые чешуйки не будут кровоточить, в отличие от псориатических бляшек.

Часто микоз путают с парапсориазом, который имеет похожую симптоматику, но не отмечается шелушением кожи.

Важно дифференцировать микоз от нуммулярной экземы. Такое заболевание является особым видом экземы, но выявить это можно лишь при лабораторной диагностике. Часто признаки микоза принимают за проявления полиморфного фотодерматоза, который свойствен только для взрослых. Он никогда не диагностируется у детей.

Проведение лабораторной и дифференциальной диагностики — важная мера при постановке точного диагноза и назначения необходимого лечения. Чтобы устранить до конца признаки микоза, требуется достоверно выявить возбудителя. При несвоевременном проведении диагностических процедур, патология прогрессирует и поражает все большую часть кожи и внутренних органов, вызывая осложнения.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в диагностических целях для выделения и идентификации возбудителей микозов у животных. Способ предусматривает смешивание ферментативного пептона, глюкозы, янтарной кислоты, агара и дистиллированной воды в заданном соотношении компонентов с получением питательной среды. Полученную питательную среду нагревают до кипения. После нагревания и расплавления агара среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Вновь доводят до кипения и охлаждают до 45-50°С. Изобретение позволяет сократить сроки приготовления питательной среды и повысить ее селективность. 2 ил., 1 табл.

Рисунки к патенту РФ 2407783

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в диагностических целях для выделения и изучения свойств возбудителей микозов у животных.

Возбудителями микозов у животных могут быть различные совершенные грибы из класса фикомицетов - плесневые грибы, дрожжеподобные грибы, а также дерматомицеты (Ветеринарная микробиология и иммунология. / Под ред. Н.А.Радчука. - М.: Агропромиздат, 1991. - С.341).

По своим физиологическим свойствам они не требовательны к питательным средам, поэтому могут расти на простых искусственных средах, широко используемые в микробиологии - мясо-пептонном бульоне и мясо-пептонном агаре. Однако интенсивность их развития из споровой до вегетативной формы составляет несколько дней, поэтому при посеве патологического материала (пораженные волосы и чешуйки кожи) раньше вырастают различные сапротрофные бактерии (т.к. период деления многих из них составляет 15-30 мин), которые являются конкурентами и антагонистами грибов. Данное обстоятельство побуждает микробиологов использовать специальные среды.

Одной из наиболее близких сред к заявляемому способу (прототип) для выделения и выращивания возбудителей микозов человека и животных является среда Сабуро (Н.И.Розанов Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных / М.: Государственное из-во сельскохозяйственной литературы, 1952. - С.106;

Достоинством известной среды является то, что за счет высокого содержания углевода в ней, а следовательно, высокой осмотичности, сдерживается рост бактериальной микрофлоры, в отличие от грибной, которая хорошо развивается.

Между тем среда Сабуро имеет недостатки, которые заключаются в следующем:

1. Приготовление среды связано со значительными временными затратами, поскольку смешанные ингредиенты сначала кипятятся до расплавления агара, затем среда фильтруется, разливается по флаконам (колбам) и автоклавируется. Весь цикл приготовления среды занимает 3-4 ч.

2. Поскольку среда не содержит специальных селективных добавок, а ее рН находится в пределах 6,5-7,5, то на ней все же через 18-24 ч развиваются бактерии, чаще всего это представители рода Bacillus, характеризующиеся малым временем генерации и образованием колоний большого размера, часто слизистых, быстро заполняющих поверхность агаровой пластинки и тем самым препятствующих росту грибов, активная вегетация которых начинается только на 3-4 сутки, а спороношение, по которому идентифицируются большинство микроскопических грибов, только на 5-7 сутки. В связи с этим известно, что для диагностики грибных болезней (Диагностика грибных болезней животных / Под ред. А.Х.Саркисова. - М.: Колос, 1971. - С.13) перед посевом пораженных волос или кожных корочек их предварительно обрабатывают в течение нескольких минут в 60° этиловом спирте, после чего промывают стерильной водой и подсушивают. Но для выделения дрожжеподобных грибов этот метод не годится, т.к. они чувствительны к спирту.

Техническим решением задачи является обеспечение сокращения времени приготовления среды, повышение ее селективных свойств и экономичности.

Поставленная задача достигается тем, что в способе приготовления питательной среды для выделения возбудителей микозов у животных, включающем смешивание ферментативного пептона, глюкозы, агара, их растворение в дистиллированной воде, нагрев смеси до кипения, согласно изобретению добавляют янтарную кислоту при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Классы МПК:	C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них
Автор(ы):	Терехов Владимир Иванович (RU) , Сердюченко Ирина Владимировна (RU) , Терехова Ольга Борисовна (RU) , Караев Ян Михайлович (RU)
Патентообладатель(и):	Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный аграрный университет" (RU)
Приоритеты:

ферментативный пептон	9-11
глюкоза	10-20
янтарная кислота	1-2
агар	14-16
дистиллированная вода	остальное,

затем полученную среду фильтруют через фильтр, вновь доводят до кипения, охлаждают и фасуют.

Новизна заявляемого предложения состоит в том, что разработана специальная питательная среда для выделения из патологического материала возбудителей микозов животных. Предварительной обработки патматериала спиртом не требуется, т.к. селективность в отношении микроскопических грибов обеспечивается за счет ввода янтарной кислоты, которая подавляет рост сопутствующей бактериальной флоры (бациллы, стафилококки, энтеробактерии, псевдомонады и др.). Бактерии на данной среде не растут в связи с тем, что рН среды находится в пределах 3,8-4,0, что не приемлемо для них, но для грибов кислая среда даже предпочтительней. Кроме того, янтарная кислота обеспечивает не только селективность за счет снижения рН среды, но и является активным стимулятором роста для грибов, поскольку относится к эрготропным веществам, участвующим в энергетическом обмене (цикле Кребса) эукариотических клеток. Приготовление среды исключает автоклавирование, т.к. кипячение обеспечивает полностью стерильность среды, что сокращает не только время получения среды, но и энергозатраты, а следовательно, является экономически более целесообразной.

Сущность изобретения поясняется фото, где на фото 1 представлен рост грибов на заявляемой питательной среде, где выросли только Aspergillus niger и Trichophyton rubrum; на фото 2 - рост грибов на среде Сабуро: помимо гриба Microsporum на среде выросли колонии бацилл (белого цвета) и микрококков (желтого цвета).

Способ приготовления питательной среды для выделения возбудителей микозов у животных осуществляется следующим образом.

Сухие ингредиенты среды растворяют в теплой воде и доводят до кипения, после расплавления агара среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, повторно доводят до кипения, а затем охлаждают до 45-50°С и разливают в стерильные чашки Петри. Готовая среда прозрачна, светло-желтого цвета.

На данной среде хорошо растут грибы из рода Candida, Microsporum, Trichophyton, Aspergilus, Mucor, Penicillum, Altemaria и др. Результаты сравнительного анализа заявляемого изобретения и аналога представлены в таблице, из которой видно, что заявляемая среда более выгодно отличается от аналога, т.к. на ней микроскопические грибы дают видимый рост и спорообразование в более ранние сроки, на ней полностью подавляется развитие сапротрофных бактерий, время приготовления среды в 5 раз короче, чем аналога. Кроме того, следует отметить, что в предлагаемой среде содержание глюкозы в 2 раза меньше, а следовательно, это также уменьшает стоимость среды. Данные обстоятельства позволяют считать заявляемую питательную среду как патентоспособную.

Таблица.
Качественные характеристики сред для выделения грибов
Показатель	Заявляемая среда	Среда Сабуро (аналог)
Время приготовления 1 л среды, включая розлив в чашки Петри	1 ч	5 ч
Образование видимого роста плесневых грибов и дерматомицетов	Через 24-36 ч	Через 48-72 ч
Образование конидий (спороношение)	Через 68-80 ч	Через 96-168 ч
Наличие сопутствующего роста сапротрофных бактерий	Отсутствует	Имеется
Требуется внесение в среду антибиотиков или обработка патматериала спиртом	Не требуется	Требуется

Количественное значение ввода в среду глюкозы и янтарной кислоты было подобрано экспериментально. При вводе янтарной кислоты в количестве 0,5-0,8 г на среде вырастали не только грибы, но и появлялись колонии бактерий. При увеличении ввода янтарной кислоты в количестве 2,2-2,5 г задерживался рост самих грибов. При уменьшении количества глюкозы до 5-8 г рост грибов замедлялся, а при увеличении ввода до 3-4 г - никак не сказывалось на ростовых характеристиках среды. Готовая для употребления (разлитая в чашки Петри) среда может храниться без изменения своих свойств в условиях холодильника в течение 10-15 дней, а разлитая в стерильные флаконы - до 6 месяцев.

Удовлетворительного результата добиваемся за счет оптимизации количественного ввода в среду янтарной кислоты. На полученной среде плесневые грибы и дерматомицеты дают видимый рост уже через 24-36 ч инкубации при комнатной температуре, а дрожжеподобные грибы через 12-20 ч при температуре 37°С. Окончательную оценку выросших колоний и идентификацию плесневых грибов и дерматомицетов можно осуществлять через 68-80 ч.

Общая характеристика некоторых возбудителей микозов

Возбудитель

Характеристика заболевания

Морфология

Культивирование

M. pusillus,
M. racemosus

Мукормикоз - хроническое заразное заболевание животных и человека, характеризующееся поражением органов дыхания и лимфатических узлов

Состоит из нерасчлененного мицелия в виде сильно развет-вленной клетки, от которой под-нимаются плодоносящие гифы с шаровидными спорангиями на конце в виде головки. В патматериале обнаруживаются крупные, ветвящиеся, несептиро-ванные гифы мукоровых грибов

Аспергиллез - острая или хроническая заразная болезнь домашних и диких птиц, реже других видов животных, характеризующаяся поражением органов дыхания.

Mucor

Среда Сабуро, 25-30 o С

Aspergillus

А. fumigatus, A. flavus, А. niger

P. notatum, P. crustaceum, P. glaucum, P. citrinum

Пенициллез - заразная болезнь человека и животных, сопровождающаяся поражением кожи, когтей, уха, верхних дыхательных путей и легких. Возможна генерализация процесса.

Кандидамикоз - заразная болезнь человека и животных, сопровож-дающаяся поражением слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта и других органов с образо-ванием беловатых пленок, а так-же гранулематозных образований во внутренних органах

Эпизоотический лимфангоит - хроническая микозная болезнь цельнокопытных животных, характеризующаяся воспалением лимфатических сосудов кожи и подкожной клетчатки с образованием гнойных фокусов и язв

Кокцидиоидомикоз - контагиозная заразная болезнь многих видов животных, характеризующаяся гранулематозным поражением дыхательных органов и их лимфатических узлов

Толстостенный, дрожжеподобный микроорганизм в тканях и экссудатах имеющий сферическую форму (сферулы). Размеры сферул 20-200 мкм, содержат в себе эндоспоры диаметром 2-5 мкм

Аэроб, 20-37 o С. На обычных питательных средах рост в виде пушистого мицелия. На агаре Литмана образует белые хлопковидные колонии с неправильными краями. На агаре Сабуро при 20 o С рост на 3-4 день, при 37 o С - в течение суток

При составлении питательных сред для микроорганизмов необходимо учитывать их потребность в элементах питания. По составу питательные среды подразделяются на две группы: естественные (натуральные) и синтетические.

Естественными обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный неопределенный химический состав.

На естественных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в этих средах имеются, обычно, все компоненты, необходимые для роста и развития. Однако среды с неопределенным составом малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку они не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды, а с другой стороны, выяснить, какие вещества образуются по ходу развития микроорганизмов. Это связано с тем, что состав естественных сред очень сложен; кроме того, он не является постоянным, так как существенно колеблется в зависимости от сырья и способа приготовления сред. Это заметно влияет на рост микроорганизмов. Естественные среды неопределенного состава используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и для диагностических целей.

Для грибов, наиболее широко используют полноценные среды, приготовленные на основе солодового сусла. В состав сусла входят глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, мальтотриоза, небольшое количество пентоз – арабиноза, ксилоза, рибоза. Эти вещества и являются основными источниками углерода и энергии для грибов. В сусле имеются также аминокислоты, витамины и минеральные вещества. Для культивирования грибов в питательных средах обычно устанавливают рН 5–6, поскольку грибы в большинстве своем являются ацидофильными микроорганизмами.

Синтетические среды − это такие среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды следует готовить на дистиллированной воде. Для разработки синтетических сред, обеспечивающих нормальный рост изучаемого микроорганизма или максимальный биосинтез какого-либо продукта его жизнедеятельности, необходимо знать особенности обмена веществ данного организма и его потребности в источниках питания. В настоящее время в распоряжении микробиологов имеется достаточное количество синтетических сред, не уступающих по своим качествам сложным средам неизвестного состава. Синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, но могут быть и довольно простыми по составу. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена.

Для курсового проекта были использованы следующие питательные среды:

- сусло-агар (СА). Поскольку основой служит сусло-бульон с кислой среды, для получения плотных агаризованных сред берут небольшой избыток агар-агар в расчете на то, что в процессе стерилизации часть его подвергнется температурно-кислотному гидролизу. Во флаконы с сусло-бульоном вносят агар-агар до концентрации 2–2,5% для плотной среды и 1,0-1,5% для полужидкой. Стерилизуют при 0,5 ати 30 мин.

- питательный агар для грибов (агар Чапека)

Для приготовления агара Чапека берут 20−30 г агар-агара, заливают его 1000 мл дистиллированной воды и вымачивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Воду сливают и измеряют ее объем для определения количества воды, впитавшейся агаром. Затем агар промывают 2−3 раза дистиллированной водой.

Взвешивают остальные компоненты среды (сахароза − 30,0 г, азотнокислый натрий −3,0 г, фосфорнокислый однозамещенный калий −1,0 г, сернокислый магний − 0,5 г, хлористый калий − 0,5 г, сернокислое закисное железо−0,01 г) и растворяют в дистиллированной воде, которую берут в объеме, равном количеству воды, слитой при вымачивании агара. К раствору добавляют отмытый агар, после чего среду варят в автоклаве текучим паром в течение часа.

Полученную среду фильтруют, разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют в автоклаве при температуре 110−112°С (под давлением 0,05 МПа по показанию манометра) в течение 20 мин.

Для ее приготовлении к 100 см 3 дистиллированной воды добавляют 1,8 г агара и оставляют на 30 мин для его набухания, затем добавляют 4 г мальтозы или глюкозы и 1 г пептона, нагревают до полного растворения (при наличии осадка фильтруют). Стерилизуют среду при температуре 115 0 С в течение 15 минут.

Для повышения селективности, т.е. подавления развития посторонних микроорганизмов, в среду Сабуро добавляют растворы антибиотиков – пенициллина (50 ЕД/см 3 ), левомицетина (10 мкг/см 3 ). [6]

Кроме того, в курсовом проекте был использован физиологический раствор (ФР). Для его приготовления 8,5 г хлористого натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды. Стерилизуют при 0,15 МПа в течение 20 минут [19].

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Микроскопия – это один из основных методов в лабораторной диагностике микозов. Проводить это исследование необходимо с того дня, когда на питательной среде появляются первые колонии. Перед микроскопическим исследованием необходимо знать является гриб дрожжевым или плесневым – по внешнему виду колоний, результатам проростковой пробы.

При микроскопии плесневых грибов учитывают структуру мицеллия (т.е. особенности строения гиф, их цвет, септированность; особенности строения конидиев и спор, включая размер, форму, цвет конидиев; строение их клеточной стенки, септированность и т.д.)

Для проведения микроскопии готовят нативные и окрашенные препараты. Для приготовления окрашенных препаратов материал обрабатывают различными способами:

1. Окраска PAS-методом. Использование РAS-метода позволяет выявить нейтральные полисахариды в стенках микроорганизмов. Нейтральные полисахариды – это глюкан-маннановый комплекс, находящийся в клеточной стенке большинства эумицетов, за счет него и происходит окрашивание.

PAS-реакции – один из методов микроскопической диагностики тканевых форм грибковой инфекции. В практических лабораториях для микроскопической диагностики используются различные модификации этого метода: окисление хромовой кислоты – реакция Бауэра; окраска по Гридли.

2. Окраска по методу Грама (модификация по Грам-Вайгерту) для выявления сопутствующих микроорганизмов.

3. Окраска по Циль-Нильсону для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов. Если исследуемый материал жидкий, то из него готовят неокрашенный мазок для микроскопии в просветляющих жидкостях: смесь спирта с глицерином в соотношении 1:1.

Следующий этап это микологическое исследование – выделение и идентификация грибов. Рассмотрим особенности этого этапа в зависимости от исследуемого материала.

Культуральное исследование. Культуральное исследование основано на выделение возбудителя из исследуемого материала. Сроки культивирования различны для разных видов грибов (от 2-4 дней до 4 недель), при подозрении на диморфные грибы культуру выделяют до 8 недель. Основными средами для культивирования в микологической лаборатории является среда Сабуро: декстрозный агар Сабуро (плотная среда), бульон Сабуро (жидкая среда). Для подавления роста бактериальной флоры в среду Сабуро добавляют антибиотики (хлорамфеникол, гентамицин, реже стрептомицин, пенициллин). Для подавления роста сапрофитных грибов в среду добавляют циклогексимид, хлорамфеникол. Существуют готовые среды с циклогексимидом (Mycobiotic Mycosel).

Оптимальным режимом культивирования для большинства патогенных грибов является 30 0 С, 20-25 0 С, реже 37 0 С – при подозрении на диморфные грибы. Длительность инкубации для большинства грибов составляет до 6 недель; если по прошествию этого времени роста не наблюдается, то дают отрицательный ответ. В случае подозрения на диморфный микоз при отсутствии роста в течение 6 недель, культуру выдерживают 8 недель и только после этого дают отрицательный результат.

При культуральном исследовании диагностически значимымявляются:

- выделение плесневого или дрожжевого гриба, при исследовании стерильного в норме материала;

- выделение диморфного гриба.

Алгоритм микологического исследования

1. Определение грибковой этиологии возбудителя (микроскопия).

2. Определяют дрожжевой гриб или плесневый:

- микроскопия клинического материала (наличия мицеллия);

- характер колоний на питательной среде, скорость роста (дрожжевые грибы растут 48 часов, плесневые грибы растут медленно).

3. Окончательную идентификацию гриба до уровня вида (внутривидовая) проводят с использованием биохимических тестов и иммунологических методов. При исследовании биохимических свойств изучают способность выделенной культуры к ассимиляции (ауксанограмма) и ферментации (зигограмма). Возможно использование автоматизированных систем идентификации (тест-системы для идентификации грибов).

Критерии этиологической значимости выделения условно-патогенных грибов

1.Если в нативном препарате видны только бластоспоры (сапрофитная вегетация) то это расценивается как носительство.

2.Если в нативном препарате преобладают бластоспоры и появляются единичные нити псевдомицелия, то это сигнал о переходе гриба к паразитизму.

3.Если бластоспоры единичные и преобладает псевдомицелий, то это признак глубоких органных поражений.

4.Активное почкование бластоспор – свидетельство острого процесса.

5.Количественную оценку результатов – выделение гриба из разведений

-10 -фекалии , моча;

6.Повторность высеваемости одного и тогоже вида гриба

7. Наличие антител к выделенному штамму.

Микологическое исследование отделяемого слизистых

1. Подготовка материала. После забора материала со слизистых тампон помещают в 2 мл жидкой среды Сабуро или сусло-агара, или МПБ, разлитого в стерильные пробирки. Их тщательно встряхивают в течение 5 минут, стараясь не замочить пробку. Из полученной взвеси готовят ряд разведений 1:10 и 1:100 и т.д.

2. Культуральное исследование.

Из каждого разведения высевают по 0,1мл на 2 чашки сусло-агара, агара Сабуро или МПА. Посевы на плотных средах и пробирку с жидкой средой с тампоном для обогащения инкубируют при +37 0 С в течение 48 часов:

- после пройденного времени посевы просматривают и подсчитывают число колоний и ориентировочно определяют количество дрожжевых колоний. Их количество умножают на 20 и на разведение, из которого сделан высев;

- если на чашках с посевом, сделанным из разведений роста нет, то делают повторный посев из среды обогащения в чашку с сусло-агаром.

Микологическое исследование крови

1. Подготовка материала. После забора крови ее разводят 1:10, для того, чтобы бактерицидные свойства крови не ингибировали рост грибов.

2. Культуральное исследование.

- 5-10мл крови засевают в 50-100 мл жидкой среды Сабуро с 2% глюкозой. При температуре 37 0 С их инкубируют в течение недели;

- через 5 дней делают контрольный высев. Для этого стерильной пипеткой забирают осадок 3-4 капли из пипетки засевают на сусло-агар и растирают стерильной бактериологической петлей;

- засеянные чашки в течение 2-5 дней держат в термостате при 37 0 С;

- если обнаружен рост, то выдают предварительный ответ о фунгемии, а дальнейшую идентификацию гриба проводят в ходе исследования.

Микологическое исследование биоптатов

1.Для забора материала используют метод отпечатков.

2. Культуральное исследование:

- делают отпечаток исследуемым кусочком ткани на поверхность плотной питательной среды Сабуро;

- этот же кусочек ткани помещают в 50мл жидкой питательной среды (сусло или Сабуро);

- посевы инкубируют при 37 0 С в течение 5 дней.

Читайте также:

Penicillium

Среда Сабуро, 25-28 o С

Candida

C. albicans, C. krunsi, C. tropicalis

Дрожжеподобные грибы, одноклеточные микроорганизмы, продуцируют псевдомицелий, мицелий, бластоспоры, вертициллы, гломерулы, псевдоконидии

Аэробы, 21-27 o С. На сусло-агаре через 1-5 сут C. albicans формирует круглые, блестящие, плоские или выпуклые, с ровными краями колонии. На жидкой среде - помутнение.

Cryptococcus

Lymphangoitis epizootica

В патологическом материале криптококки округлые, овальные, яйцевидные, почкующиеся с заостренными концами и двухконтурной оболочкой. Размеры 2,5-4 х 2-3 мкм. В чистой культуре имеет септированный мицелий шириной 4 мкм

Пептоно-печеночный агар, МПА с 2% глюкозы и 2,5% глицерина, агар Сабуро, растительные среды 28-30 o С, рост медленный

Coccioides

C. immitis