Реферат лабораторная диагностика кандидозов

… грибы рода Candida размножаются на любом биологическом субстрате.

В связи с тем, что для заболевания кандидозом характерен полиморфизм клинических проявлений лабораторному исследованию подлежит разнообразный патологический материала. В зависимости от характера и локализации поражения, для лабораторного анализа берут:
• мокроту;
• соскобы с кожи или слизистых оболочек;
• ногтевые чешуйки;
• кровь, ликвор, мочу, желчь, фекалии;
• пунктаты из закрытых полостей, отделяемое свищей;
• биопсированный и секционный материал.

Вначале производят исследование нативного материала (за исключением крови); при этом ликвор, мочу и желчь подвергают (!) предварительному центрифугированию (1500 - 2000 об/мин, 10 - 15 мин). Препараты готовят в 10 - 20% растворе щелочи при слабом нагревании.

Обнаружение нитчатой фазы возбудителя (мицелия или псевдомицелия) является важным свидетельством наличия кандидоза. Количество дрожжевых клеток в каждом поле зрения служит ориентиром при подготовке серийных разведений для количественного посева на плотные питательные среды: единичные клетки в поле зрения при большом увеличении микроскопа (х400) свидетельствуют об их содержании порядка десятков тысяч в 1 мл исследуемого материала.

Разведения патологического материала, содержащего нормальную микрофлору (мокрота, фекалии, моча, желчь и т.д.), готовят в жидкой питательной среде (обычно жидкое сусло или жидкая среда Сабуро) и затем высевают определенное количество материала (0,1 - 0,2 мл) на аналогичные плотные среды. Для подавления роста контаминирующих бактерий в среды добавляют антибактериальные антибиотики (чаще всего применяют пенициллин и стрептомицин: по 50 - 100 ед/мл среды или 0,05% хлорамфеникола).

Если вместо соскобов использованы смывы, то тампоны предварительно встряхивают в течение нескольких минут в 5 - 7 мл жидкой питательной среды, а затем производят посев на плотные среды определенного объема соответствующего разведения исходной взвеси. Соскобы с кожи и ногтевых пластинок помещают на скошенные питательные среды. Посев крови и ликвора производят в 10-кратный объем жидкой среды Сабуро или МПБ с 2% глюкозы без добавления антибиотиков, так как кандидозная фунгемия иногда сочетается с бактериальным сепсисом. Наиболее высокую эффективность выделения грибов из крови удалось обеспечить при использовании комбинированной сердечно-мозговой среды. Посев крови делают 3-4-кратно, осуществляя забор из разных вен с интервалом в несколько дней при (1) отсутствии парентерального питания или (2) капельного введения лекарственных веществ. При наличии у больного фунгемии рост грибов появляется через 24-48 ч, максимальная инкубация осуществляется до 30 суток при периодических пересевах на плотную питательную среду.

Биопсированный и секционный материал используют для приготовления гистологических препаратов (окраска PAS-методом), а остатки материала высевают (методом отпечатков или после предварительного измельчения) на плотные и в жидкие питательные среды. Инкубацию предпочтительнее проводить при 25 - 30оС, хотя патогенные для человека виды грибов хорошо растут и при 37оС. Достаточных размеров колонии формируются через 48 ч культивирования, хотя точечный рост можно обнаружить уже на следующий день после первичного посева. При отсутствии роста на агаровых средах делают высев с жидких питательных сред на сектора для получения изолированных колоний.

При исследовании мочи наряду с культуральным методом рекомендуется дополнительное исследование, имеющее целью (!) выявление иммуноглобулинов человека на поверхности бластоспор. Для этого около 5 мл второй порции мочи центрифугируют в течение 5-10 мин при 1500 об/мин и из осадка готовят (1) нативные препараты и мазки, окрашенные по Граму, а также (2) препараты для иммунолюминесцентного исследования при котором фиксацию осуществляют метанолом, а после высушивания мазка наносят антисыворотку против глобулинов человека, меченную изотиоцианатом флюоресцеина.

В осадке мочи больных мочекаменной болезнью нередко (около 7% проб) присутствуют клетки золотистого стафилококка (В.Г. Кубась и соавт.), которые за счет наличия у них белка А неспецифически связывают Fc-фрагменты IgG, что может привести к получению ложноположительных результатов реакции иммунолюминесценции. При выявлении грамположительных кокков для блокировки белка А рекомендовано (В.Г. Кубась и соавт.) к осадку мочи добавлять равный объем кроличьего глобулина с концентрацией белка 1,0 мг/мл. После (1) инкубации смеси при 37оС в течение 30 мин и (2) 3-кратного промывания осадка фосфатным буферным раствором (3) готовят мазки и (4) фиксируют их метанолом. Предварительная обработка кроличьим глобулином взвесей золотистых стафилококков (100-500 млн/мл) подавляла их неспецифическую флюоресценцию.

Выявление светящихся дрожжевых клеток при параллельном обнаружении дрожжей в нативном и окрашенном по Граму препаратах свидетельствует о том, что они несут на своей поверхности специфические глобулины, то есть о наличии у пациента тканевых поражений. Положительный антиглобулиновый тест свидетельствует о кандидозном поражении мочевыводящих путей. Контролем для исключения аутофлюоресценции дрожжевых клеток является исследование неокрашенного препарата.

(!) Видовое определение выделенных культур является важным критерием диагностики и имеет комплексный характер, включающий (1) изучение внешнего вида колонии, (2) ферментативной активности и (3) ассимиляционной способности штамма, (4) типа филаментации, а также (5) характера роста в жидкой питательной среде (наличие поверхностной пленки, поднимающееся по стенке пробирки над поверхностью среды кольцо и т.д.). Большинство патогенных для человека видов грибов рода Candida может быть идентифицировано без постановки ассимиляционного теста.

Из-за резкого преобладания C. albicans у больных и миконосителей, у выросшей культуры прежде всего выявляют наличие характерного морфологического признака этого вида - хламидоспоры. С этой целью производят прерывистый штриховой посев на рисовый агар, часть посева покрывают фламбированным покровным стеклом. Посевы инкубируют при 37оС или при 22оС. Подавляющее большинство штаммов C. albicans образуют хламидоспоры через 12-24 ч, реже - через 48 ч. Выявление хламидоспор позволяет идентифицировать культуру как C. albicans и не проводить дальнейших исследований. Культуры, у которых хламидоспоры выявить не удалось, исследуют по комплексу признаков.

При постановке ассимиляционного теста в стерильную чашку Петри вносят 1-2 мл взвеси культуры, которую заливают 18-20 мл базовой среды с добавлением дрожжевого аутолизата, охлажденной до 43-45°. После застывания агара его подсушивают и на поверхность наносят стерильные диски фильтровальной бумаги, пропитанной 20% или насыщенным раствором изучаемого источника питания. Можно также на поверхность агара наносить небольшие количества нерастворенного источника питания. Чашки инкубируют в перевернутом виде при 25-28оС; в положительных случаях в течение 2-4 дней вокруг источника питания обнаруживается рост культуры гриба.

В последнее десятилетие разработан ряд автоматизированных систем для видовой идентификации грибов рода Candida, в основу которых положено определение ассимиляционной способности изучаемых культур. Каждая лунка содержит определенный источник питания, посевы инкубируются при 30оС в течение 24 ч. Помутнение среды свидетельствует об ассимиляции данного источника питания, регистрация результатов производится фотометрически. При помощи компьютера по нумерационно-кодовому принципу осуществляют видовое определение штамма.

Серологическая диагностика. Высокую диагностическую значимость имеет реакция непрямой иммунолюминесценции. У большинства здоровых лиц ее интенсивность составляет 1:10 - 1:20, диагностическим считается титр 1 и более. Для реакции агглютинации частиц латекса, сенсибилизированных соматическими антигенами, диагностическим считают титр 1:8; у больных с выраженной иммуносупрессией диагностическое значение имеет 4-кратное увеличение титра в процессе заболевания. Для поиска антигенов гриба используют частицы латекса, сенсибилизированные антителами, но во избежание ложноположительных результатов, в сыворотке должен отсутствовать ревматоидный фактор.

При использовании встречного иммуноэлектрофореза выявление 2 и более дуг преципитации имеет диагностическую ценность. У здоровых лиц, а также у больных поверхностным кандидозом дуги преципитации, как правило, отсутствуют. При перекрестном иммуноэлектрофорезе у больных висцеральным кандидозом выявляется в среднем 10 дуг преципитации (пределы колебаний - 5-20), при кандидозном эндокардите - около 8 (1-11), а в контрольной группе - 2 (0-5). Специфичность метода увеличивается при использовании промежуточного геля с конкавалином А, который связывает маннан, содержащийся в виде примеси в препаратах соматических антигенов.

Большую ценность, чем титрование антител, имеет определение в сыворотке циркулирующих антигенов гриба, особенно цитоплазматических. Определение антигенов осложняется формированием в сыворотке иммунных комплексов. Полисахаридные антигены высвобождаются из этих комплексов кипячением, для белковых антигенов методы выделения не разработаны. При диссеминированном кандидозе маннан выявляют у 50-70% больных при его отсутствии у здоровых лиц, что придает находке диагностическую значимость. Методом газо-жидкостной хроматографии в сыворотке определяют метаболиты гриба - маннозу и арабинитол. Определение сывороточного содержания арабинитола основывается на способности некоторых видов (C. albicans, C. tropicalis, C. pseudotropicalis, C. parapsilosis) синтезировать это вещество. При почечной недостаточности рекомендуется одновременное определение концентрации арабинитола и креатинина, так как скорость выделения этих веществ одинакова.

Диагностика системного кандидоза. Своевременный диагноз системного кандидоза представляет значительные трудности, поскольку клиническая симптоматика неспецифична. В диагностике кандидоза основная роль принадлежит лабораторным методам исследования: микроскопическим, культуральным, газохроматофическим и молекулярным.

Выявление кандидемии считается наиболее значимым диагностическим маркером гематогенного кандидоза и служит абсолютным показанием к проведению противогрибковой терапии. Следует иметь в виду, что системный кандидоз может не сопровождаться кандидемией. Наиболее важным признаком диссеминированного кандидоза является грибковый эндофтальмит (экссудативные изменения желто-белого цвета сосудистой оболочки глаза). Поэтому офтальмологическое обследование считается весьма значимым в комплексе диагностики и мониторинга больных, имеющих факторы риска диссеминированной кандидозной инфекции. Однако кандидозный эндофтальмит не является начальным признаком генерализации грибковой инфекции, даже у больных с кандидемией поражение сетчатой оболочки выявляют лишь в 9-15% случаев. Другие проявления диссеминированного кандидоза (в частности, поражения кожи и артрит) отмечаются крайне редко у больных в ОИТ. После операций, не затрагивающих почки, мочевой пузырь, а также в тех случаях, когда не было длительной катетеризации мочевого пузыря, кандидурия с выделением большого числа КОЕ является весьма подозрительным симптомом гематогенного поражения почек.

Серологические методы включают определение антител к Candida spp. с помощью различных методов: (1) агглютинации, (2) иммуноэлектрофореза и (3) иммунодилюции. К сожалению, интерпретация получаемых данных часто затруднительна, поскольку антитела обнаруживаются и у здоровых людей, и в случаях обычной колонизации. Более того, эти методы дают отрицательный результат при грибковой инфекции у больных с иммунодефицитными состояниями и в начальной стадии системного кандидоза. Большей информативностью обладают серологические методы определения антигенов Candida spp., однако они также обладают лишь умеренной чувствительностью в случаях системного кандидоза.

Перспективным методом диагностики является хроматографическое определение метаболитов грибов - D-арабинитола в различных биологических жидкостях и тканях инфицированных больных. Большинство патогенных Candida spp. (кроме С. crusei и C. glabrata) продуцируют значительное количество D-изомера арабинитола, и в сыворотке больных при инвазивном кандидозе определяется его повышенное содержание, а также повышение отношения D-арабинитол/креатинин. В проспективных клинических исследованиях подтверждена значимость серийных определений D-арабинитола для диагностики кандидоза у онкологических больных с нейтропенией. Однако инвазивный кандидоз во многих случаях протекает без кандидемии, что не может не отражаться на содержании D-арабинитола в крови и снижает диагностическую ценность метода.

Уточнение дифференциально-диагностических признаков кандидоза у пациентов стоматологического профиля. Изучение клинической эффективности фунгицидов, активных в отношении потенциальных возбудителей кандидоза. Разработка алгоритма этиотропной терапии.

Рубрика	Медицина
Вид	автореферат
Язык	русский
Дата добавления	29.11.2017
Размер файла	165,9 K

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

На правах рукописи

УДК 616.311-002.72-07-085

на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Совершенствование методов лабораторной диагностики и обоснование терапии кандидоза слизистой оболочки полости рта

Cуркова Светлана Александровна

14.01.14 - Стоматология (мед. науки)

03.02.03 - Микробиология (мед. науки)

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Ушаков Рафаэль Васильевич; доктор медицинских наук, профессор Царёв Виктор Николаевич

Защита состоится на заседании диссертационного совета Д 208.041.07, созданного на базе ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России по адресу: Москва, ул. Делегатская, д.20, стр.1.

Почтовый адрес: 127473, Москва, ул. Делегатская д. 20 стр.1.

Автореферат разослан: 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент О.П. Дашкова

Общая характеристика работы

В настоящее время проблема воспалительных заболеваний слизистой оболочки полости рта и тканей пародонта занимает одно из ведущих мест в современной стоматологии. (Максимовский Ю.М., 1997; Иванов В.С., 2001; Барер Г.М., 2006). Однако, эффективность методов лечения (терапевтического, пародонтологического, хирургического), существенно снижается при развитии воспалительных процессов, ассоцированных с дрожжевыми грибами рода кандида (Олейник И.И., 1991, 2000; Тимирбаев М.А., 1999, 2009; Плахтий Л.Я., 2004; Царёв В.Н., 2006, 2009).

Торпидные (устойчивые) к лечению формы заболеваний СОПР и пародонта в последние годы встречаются всё чаще, что по данным современной литературы, может быть связано с активизацией грибковой микрофлоры (Дмитриева Л.А., Чернышова С.В., 2000; Царёв В.Н., 2006, 2009). В зарубежной литературе, а в последние годы, также и у отечественных авторов появился термин - кандида-ассоциированный пародонтит (J.Vinkelhoff, 1996; Waltimo T.M. e.a., 2000). Как отмечает в своих исследованиях Носик А.С. (2004), микотическое воспаление тканей пародонта отличается от хронического пародонтита бактериальной этиологии проникновением псевдомицелия в десневой эпителий и более глубокие ткани пародонта.

Слизистая оболочка полости рта и ткани пародонта подвергаются специфической грибковой патологии в связи с неправильным выбором антибактериальной терапии, что ведет в свою очередь к развитию дисбиоза и иммуноспецифическим ситуациям различного генеза. Как оказалось, многие химиопрепараты и антибиотики, эффективные в отношении пародонтопатогенных видов бактерий, действуют негативно на механизмы иммунной защиты и, тем самым, приводят к прогрессированию микотического процесса в организме (Бажанов Н.Н., Тер-Асатуров Г.П., 2000; Хмельницкий О.К., 2002; Ахмедов Г.Д. с соавт., 2010; Караулов А.В. с соавт., 2012).

Углубленное изучение основных причин возникновения и механизмов развития кандидо-ассоциированных процессов в современной отечественной медицинской литературе мы не обнаружили. Новые дальнейшие исследования в области современных микологических и молекулярных методов открывают перспективы совершенствования не только диагностики, но и лечения, в частности, разработки алгоритмов применения новых химиопрепаратов фунгицидного (противогрибкового) действия.

К сожалению, местное применение антимикотиков в виде инстилляций, наложения повязок или применения гелевых форм, не даёт стойкого лечебного эффекта, поэтому, приоритетными являются сегодня работы по внедрению новых антимикотиков - из группы триазоловых производных (итраконазол, флюконазол, вориконазол) и производных тербинафина (ламизил). Как свидетельствуют данные литературы, последние при кандидозе менее эффективны.

Комплексного исследования по обоснованию применения или по оценке сравнительной эффективности перечисленных фунгицидных химиопрепаратов при кандидозе СОПР с применением современных микологических, иммунологических и молекулярно-биологических методов не проводилось. Исследования именного такого рода могут существенно продвинуть вперёд решение проблемы борьбы с микотическими процессами, которые крайне актуальны для современной стоматологии, особенно, в современных условиях высокой частоты иммунодефицитных ситуаций.

Учитывая это, цель нашей работы - совершенствование комплексной диагностики кандидозных процессов полости рта и персонификация выбора фунгицидных и иммуномодулирующих химиопрепаратов для лечения пациентов на основании анализа результатов клинико-лабораторного, микологического (культурального), иммунологического и молекулярно-биологического методов исследования.

1. Дать комплексную характеристику клинико-лабораторных данных и уточнить дифференциально-диагностические признаки кандидоза у пациентов стоматологического профиля.

2. Испытать новые хромогенные питательные среды для ускоренной диагностики кандидоза, дифференциации и видовой идентификации дрожжевых грибов, встречающихся при воспалительных процессах рта.

3. Провести анализ чувствительности и резистентности возбудителей кандидоза in vitro к антимикотикам и обосновать их применение для лечения кандидоза.

4. Провести сравнительную оценку чувствительности и специфичности отечественного набора реактивов для мультиплексной молекулярной диагностики кандидоза по сравнению с культуральным микологическим методом.

5. Провести выбор методов оценки иммунитета у больных кандида-ассоциированными воспалительными процессами полости рта и сопоставить их с данными молекулярного и культурального микологического исследования.

6. Изучить клиническую эффективность современных фунгицидных препаратов, активных в отношении потенциальных возбудителей кандидоза, разработать параметры оценки эффективности их применения и алгоритм проведения этиотропной терапии.

Уточнена видовая принадлежность дрожжевых грибов рода кандида, встречающихся при кандидозе СОПР - впервые при данной патологии у стоматологических пациентов выделены и идентифицированы представители видов C. tropicalis, C. glabrata.

Впервые установлена высокая специфичность и чувствительность набора реактивов отечественного производства для молекулярной диагностики кандида-ассоциированных воспалительных процессов с помощью мультиплексной ПЦР.

Получены новые данные о чувствительности и резистентности дрожжевых грибов кандида к новым, ранее не применявшимся для лечения кандидоза химиопрепаратам, включая новую лекарственную форму флюконазола - препарат Хайконазол (Himedia, Индия).

Обосновано применение иммуноферментного анализа для выявления различных форм кандидоза слизистой оболочки полости рта (кандидозного стоматита и пародонтита).

Разработан алгоритм применения фунгицидных и иммуномодулирующих препаратов в комплексном лечении кандида-ассоциированных воспалительных процессов полости рта.

Проведена клиническая и микробиологическая (микологическая) оценка эффективности химиотерапии кандида-ассоциированного стоматита с использованием сочетания флюконазола и иммуномодулирующего препарата ликопида.

Уточнены клинико-лабораторные патогномоничные признаки кандида-ассоциированных воспалительных процессов полости рта.

Апробированы новые дифференциально-диагностические хромогенные среды для ускоренной видовой идентификации возбудителей кандидоза.

Обоснована эффективность новой диагностической тест-системы (набора реактивов) для быстрой и эффективной индикации возбудителей кандидоза с помощью ПЦР.

Изучена возможность применения ИФА для диагностики кандида-ассоциированных воспалительных процессов полости рта.

Внедрён алгоритм диагностики и показания для комбинированного лечения кандидоза, включающей использование фунгицидных и иммуномодулирующих препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Комплексная диагностика кандидоза базируется на результатах клинических исследований с учётом данных анамнеза, лабораторного обследования, включая иммуноферментное определение АТ к кандида (скрининговый экспресс-метод) и выявлении возбудителя количественными методами - культуральным микологическим или молекулярным (ПЦР-диагностика) при постановке окончательного диагноза.

2. Различные штаммы грибов рода кандида различаются по своей чувствительности к фунгицидным препаратам, что нередко связано с видовой принадлежностью грибов. Наибольшая частота штаммов устойчивых к воздействию фунгицидных препаратов выявляется среди штаммов, относящихся к видам C. krusei и C. glabrata.

3. Прединвазивный и инвазивный кандидоз СОПР у стоматологических пациентов в зависимости от комплекса сочетания причинных и патогенетических факторов может иметь различные проявления, которые соответствуют клинической картине атрофического или гипертрофического кандидоза, включая возможность инвазивного поражения тканей пародонта, с острым или хроническим течением.

4. Фунгицидные препараты группы производных триазола в сочетании с иммуномодулирующим препаратом ликопидом являются эффективным средством комплексного лечения кандидидоза СОПР и пародонта.

Личный вклад автора заключается в самостоятельном обследовании 211 пациентов и лечении, организации специальных исследований и дополнительных консультаций. Автор принимала участие в инструментально-лабораторной диагностике, лично проводила взятие материала и подготовку препаратов для микробиологических, молекулярно-биологических и иммунологических исследований. Автор самостоятельно анализировала материал и проводила статистическую обработку полученных данных.

Публикации .

5 печатных работ по теме диссертации, в том числе, 2 статьи - в журналах рецензируемых РИНЦ в соответствии с рекомендациями ВАК Минобрнауки Российской Федерации.

Внедрение результатов исследования.

Объём и структура диссертации.

Диссертация изложена на 142 страницах компьютерного машинописного текста, иллюстрации - 17 таблиц, 30 рисунок.

Материалы и методы исследования.

Контингент обследованных включал пациентов, обратившихся к врачу-стоматологу КДЦ или стоматологической клиники ФПДО МГМСУ за период с 2009 по 2012 гг. Всего было обследовано 211 пациентов с заболеваниями СОПР и пародонта, из которых 81 пациенту по данным проведённой клинико-лабораторной диагностики был поставлен диагноз: кандидоз слизистой оболочки полости рта (СОПР). Возраст пациентов был от 23 до 69 лет, в том числе, 45 женщин и 36 мужчин.

В соответствии с задачами исследования сформированы 2 группы сравнения:

1 группа включала 60 пациентов с типичными клиническими проявлениями (в том числе, 31 женщина и 29 мужчин), которым был поставлен диагноз кандидоз СОПР. Данная группа характеризовалась отсутствием связи с протезированием.

Таким образом, всего было обследован и пролечен 81 пациент в возрасте от 32 до 87 лет с разными формами кандидоза СОПР и пародонта (табл. 1).

Для подтверждения диагноза кандидоза использовали клинические и лабораторные методы - микроскопический, культуральный (микологический), иммуноферментный и молекулярно-биологический (Мороз, 2009; Царёв, 2009).

Таблица 1. Частота основных нозологических форм кандидоза СОПР

Название нозологической формы

Количество пациентов с диагнозом

Частота в % (на 81 пациент)

Острый псевдомембранозный кандидозный стоматит

Острый эритематозный кандидозный стоматит

Хронический псевдомембранозный кандидозный стоматит

Хронический атрофический кандидозный стоматит

Клиническое стоматологическое обследования включало: оценку состояния пародонта (индекс гигиены OHI-s; кровоточивости десневых сосочков по Muhlemann; пародонтальный индекс по Rassell; определяли степень потери прикрепления десны и резорбцию альвеолярной кости рентгенологически на ортопантомографе (рис. 1)).

Рис.1 Ортопантомограмма пациентки К…, 56 лет.

Диагноз: кандида-ассоциированный пародонтит тяжелой степени

Для количественного определения дрожжевых грибов выполняли посев на агаризованную среду Сабуро и дифференциально-диагностические среды ХайХром Кандида-агар М1297А и М1297AR.

Микологическое исследование выполняли по традиционному алгоритму медицинской микологии (А.И. Сергеев, 2000). Результаты количественной оценки выделения грибов регистрировали в lg КОЕ на 1 мл.

Культуральная оценка образования псевдомицелия грибов или тип филаментации, а также формирование ростовых трубок и хламидоспор (Candida, Mycocandida, Mycotorula и др.) проводили на специальных средах (рисовый агар, сыворотка крови). Для идентификации по биохимическим свойствам использовали, тест систему API C, среды с углеводами и индикатором бромтимоловый синий. Полученные данные идентификации сравнивали с результатами идентификации в первичном посеве на хромогенные селективные и дифференциально-диагностические среды ХайХром Кандида-агар М1297А и М1297AR .

Всего выделено, идентифицировано и проанализировано 105 штаммов грибов рода Candida.

Оценку чувствительности выделенных штаммов к фунгицидным препаратам проводили традиционным диско-диффузионным методом и кассетным микрометодом разведения в агаризованной среде Сабуро (для оценки минимальной подавляющей концентрации - МПК). Изучали чувствительность производных азола (флюконазол, итраконазол, кетоконазол, вориконазол) и полиенового антибиотика (нистатин) в диапазоне концентраций от 0,5 до 256 мкг/мл.

Методы статистической обработки результатов. Использовали методики параметрической (средняя величина, ошибка средней величины M+m, коэффициент Стьюдента, вероятность различий Р) и непараметрической обработки результатов. Для относительных величин (частота случаев, отношение числа выделенных штаммов к общему числу и т.п.) определяли частоту (%). В подгруппах с малой выборкой использовали критерий х 2 . При статистической обработке результатов использовали компьютерную программу Excel для Microsoft.

Полученные данные комплексного клинико-лабораторного обследования пациентов позволили разделить всех пациентов на несколько группы сравнения с учётом выявления грибов в исследуемом материале и их количества, выраженного в колониеобразующих единицах (КОЕ).

Для выявления этиологического фактора следует проводить специальные исследования. Для подтверждения диагноза кандидоза проводили микроскопическое исследование (с окраской по Граму), при котором в материале пародонтального кармана, взятого при кюретаже, обнаружены фрагменты псевдомицелия. Аналогичная картина отмечена нами при исследовании мазка-соскоба со слизистой у пациентов с перечисленными клиническими формами кандидозного стоматита.

Для определения видового состава дрожжеподобных грибов, выделенных со СОПР и из пародонтального кармана пациентов использовали новые питательные среды из класса хромогенных - ХайХром Кандида-агар M1297A и ХайХром Кандида-агар M1297AR, позволяющие выделить в первичном посеве и одновременно идентифицировать 4 и 5 видов Candida соответственно. Несоответствие результатов традиционной идентификации с идентификацией на новых хромогенных средах выявлено в единичных случаях.

По результатам исследования и идентификации выделенных штаммов у 67 пациентов с кандидозом СОПР или пародонта, установлено преобладание вида C . albicans (свыше 82 % пациентов), причём у некоторых пациентов (около 10 %) он выделялся в ассоциациях: C. Krusei - у 4-х, C. tropicalis - у 3-х и C. glabrata - у 2-х пациентов.

Таким образом, вид C. albicans доминировал по частоте выделения у больных кандидозом СОПР и хроническим пародонтитом в стадии обострения (кандида - ассоциированным пародонтитом).

Второе место занимал вид C. Krusei (11 пациентов, что составило около 13 %), причём, у 4-х больных - только вместе с C. albicans (в ассоциации).

Единичные находки отмечены для представителей видов, некоторые из них ранее не были идентифицированы при заболеваниях СОПР и пародонта: C. tropicalis, C. glabrata и C. brumptii, а также C. guilliermondii и C.parapsilosis, выявленные только в ассоциациях с C.albicans (рис. 2).

кандидоз стоматологический фунгицид этиотропный

Всего выделено 105 штаммов дрожжевых грибов данного рода, в том числе: 80 штаммов C. albicans, 11 - C. Krusei, 6 - C. glabrata, 2 - C. tropicalis, по одному штамму - C. brumptii, C.parapsilosis и C. guilliermondii, что составило 76,2 %, 10,5 %, 5,7 %, 1,9 % и по 0,95 % соответственно.

Из 121 пациента (включая 81 - с подтверждённым диагнозом кандидоза СОПР и пародонта), которым проводили ПЦР-диагностику, у 96 в исследуемом материале (соскобе со СОПР или содержимом пародонтального кармана) выявлена искомая ДНК, что составило 93,8 % от общего числа пациентов с подтверждённым диагнозом (81 чел.), обследованных данным методом. ПЦР была положительна у 76 человек из группы с подтверждённым диагнозом (81 чел.), но также ещё у 20 человек с отрицательным (по данным культурального исследования).

Совпадение положительных результатов детектируемых обоими методами из расчёта на 81 пациент, наблюдалось в 93,8% случаев (табл. 2).

Таблица 2. Частота совпадения результатов культурального микологического и молекулярного исследования (121 пациент)