Мясо пептонный агар для кишечной палочки

Естественные среды представляют собой природные субстраты (молоко, кровь, желчь, сыворотка, картофель). Искусственные содержат смесь природных органических веществ и продуктов их кислотного или ферментативного распада. Синтетические среды состоят из буферной солевой основы и растворов аминокислот, углеводов, пуринов, пиримидинов, нуклеотидов, нуклеозидов, жирных кислот, витаминов в точно установленных дозировках. В качестве источников азота в них используются аминокислоты. Достоинство этих сред в том, что они имеют постоянный состав, по ним можно определить потребности микробов в тех или иных питательных веществах.

Плотные питательные среды готовят из жидких с добавлением уплотнителя. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар. Агар-агар – продукт, получаемый из морских водорослей, представляет собой желтоватый порошок или пластинки, содержит высокомолекулярные полисахариды, не расщепляется большинством микроорганизмов, не разрушается при автоклавировании, питательную ценность сред не изменяет, не подавляет рост микробов. Для иммунологических и бактериологических полей используется вымороженный, осветленный агар, который при кипячении или автоклавировании смеси порошка с водой расплавляется при температуре 85–100°С, а при охлаждении до 45–48°С образует гель.

Для приготовления, плотных питательных сред агар-агар добавляют в концентрации от 1,5 до 3%.

Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред.

Существует несколько способов приготовления МПБ:

а) на мясной воде с добавлением готового пептона – это так называемый мясо-пептонный бульон;

б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трипсина – бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена).

Мясо-пептонный агар (МПА) – получают путей добавления к МПБ arap-arapa (1,5–3%). Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона – это скошенный агар. Для его получения пробирки для засты­вания среды оставляют в наклонном положении. Если среда распределе­на в пробирке вертикально высотой 5–7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде пластинки – пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2–3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.

Специальные питательные среды – среды, на которых создаются условия для выращивания тех бактерий, которые не растут на простых средах.

Кровяной агар или кровяной бульон – получают путем добавле­ния к питательной среде 5–10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности.

Сывороточный бульон или сывороточный агар получают путем добавления к простым средам 15–20% лошадиной или бычьей сыворотки. Среда применяется для выделения пневмококков, менингококков.

Желчный бульон или желчный агар получают путем добавления к питательной среде медицинской желчи без консерванта, или свежеполученной от крупного рогатого скота. Среда применяется для выделения брюшнотифозных, паратифозных и дизенте­рийных палочек.

Специальные среды для культивирования анаэробных бактерий: среда Китта-Тароцци состоит из питательного бульона, глю­козы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода.

Желатин – животный белок, продукт частичного гидролиза коллагена. Имеет вид бесцветных или светло-желтых пластинок без запаха и вкуса. В холодной воде набухает, сильно поглощая воду. При темпера­туре 30°С растворяется, при охлаждении до 20–22°С превращается в гель (студень). Используется в микробиологии для изучения протеолитических ферментов.

Дифференциально-диагностические среды позволяют различить один вид микроба от другого. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на разной биохимической активности бактерий. В состав дифференциально-диагностических сред входит основная пи­тательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, определенный химический субстрат, различное отношение к которому является диагнос­тическим признаком, индикатор, изменение цвета которого свидетельству­ет о разложении субстрата и образовании кислых продуктов.

Агар Эндо – плотная среда, применяется для выделения и первичной идентификации энтеробактерий. В состав ее входят, кроме питательной основы, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом и фосфатом натрия. Правильно приготовленная среда бесцветна или имеет слегка розовый оттенок. Колонии бактерий (кишечная палочка), ферментирующие лактозу, окрашиваются на ней в красный цвет; бактерии, не ферментирующие лактозу (сальмонеллы), остаются бесцветными.

Среда Левина (лактозоэозинметиленовый агар) – среда для выделения энтеробактерий. Колонии лактозоферментирующих бактерий окрашены в темно-синий или черный цвет, колонии лактозоотрицательных бактерий вырастают под цвет среды (светло-фиолетового цвета).

Среды Гисса – набор определенных углеводов для изучения ферментативной активности бактерий и их дифференциации по этим признакам.

Элективные питательные среды содержат дополнительные вещества, задерживающие рост грамположительных бактерий. Селективные питательные среды стимулируют рост одних микробов и угнетают рост других. Селективные условия получают путем добавления в сре­ду химических веществ. Так как в этих средах патогенные бактерии размножаются и накапливаются, их называют также средами обогащения.

Среда Плоскирева – плотная питательная среда, содержащая со­ли желчных кислот, бриллиантовый зеленый, лактозу и индикатор. Эта среда является не только селективной, так как подавляет рост многих микробов и способствует лучшему росту возбудителей брюшного тифа, паратифов, дизентерии, но и дифференциально-диагностической, так как лактозоотрицательные бактерии (шигеллы) образуют на ней бесцветные колонии, а лактозоположительные – кирпично-красные.

Селенитовая среда - является лучшей средой обогащения для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.

Среда Мюллера служит для накопления сальмонелл. К питатель­ной среде добавляют мел, раствор Люголя и гипосульфит натрия. При взаимодействии этих веществ образуется тетратионат натрия, который угнетает рост кишечных палочек, но создает благоприятные условия для размножения сальмонелл.

Висмут-сульфит агар (среда Вильсона-Блера) – содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний чернота цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.

Теллуритовые среды (сывороточно-теллуритовый агар, кровяно-теллуритовый агар) – селективные среды для выделения дифтерийных бактерий, содержат теллурит калия. Бесцветная соль теллура, содержащаяся в питательной среде, восстанавливается дифтерийными бактерия­ми до металла, окрашивающего колонии в черный цвет.

Щелочной агар элективен для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов.

Консервирующие среды – среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Консервирующие среды применяются, когда нет возможности быстрого посева на питательные среды.

Для бактерий наиболее употребительны консерванты:

а) глицериновая смесь, состоящая из 0,5 л химически чистого глицерина и 1,0 л физиологического раствора;

б) боратная смесь;

в) фосфатно-буферная смесь.

Для длительного сохранения свежевыделенных и производствен­ных культур применяют полужидкий голодный агар, в этой среде при пониженной жизнедеятельности микробов продукты обмена накапливаются незначительно, что способствует хорошему сохранению культур.

В бактериологии широко применяются сухие питательные среды промышленного производства, которые представляют собой гигроскопические порошки, содержащие все компоненты среды, кроме воды. Для их приготовления используются триптические перевары дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин).

Они удобны при транспортировке, могут длительно храниться, избавляют лаборатории от громадного процесса приготовления сред, приближают к разрешению вопроса о стандартизации сред. Медицинская промышлен­ность производит сухие среды Эндо, Левина, Плоскирева, висмутсульфит агар, питательный агар, углеводы с индикатором ВР и другие.

Термостаты

Для культивирования микроорганизмов используют термостаты.

Термостат – это аппарат, в котором поддерживают постоянную температуру. Прибор состоит из нагревателя, камеры, двойных стенок, между которыми циркулирует воздух или вода. Температура регулируется тер­морегулятором. Оптимальная температура для размножения большинства микроорганизмов 37°С.

Методика приготовления пластинчатого агара

МПА расплавляют на водяной бане, затем остужают до 50-55°С. Горлышко флакона обжигают в пламени спиртовки, открывают чашки Петри так, чтобы вошло горлышко флаконы, не прикасаясь к краям чашки, выливают 10–15 мл МПА, закрыв крышку, покачивают чашку, чтобы среда равномерно распределилась, оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. После подсушивания чашки с пластинчатым агаром хранят на холоде.

Посев петлей

Стерильной остуженной петлей берут каплю материала, левой рукой приоткрывают один край чашки, вносят петлю внутрь и у противоположного края делают петлей несколько штрихов на одном месте, затем петлю отрывают и засевают материал параллельными штрихами от одного края чашки к другому с интервалом 5–6 мм. В начале посева, когда микробов на петле будет много, они дадут сливной рост, но с каждым штрихом микробов на петле остается все меньше, и они будут оставаться одиночными и давать изолированные колонии.

Посев по методу Дригальского

Этот метод используется при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой (гной, испражнения, мокрота). Для посева по методу Дригальского берут шпатель и несколько чашек (3–4). Шпатель – это инструмент, изготовленный из металлической проволоки или стеклянного дрота, загнутого в виде треугольника или Г-образно. Материал петлей или пипеткой вносят в первую чашку и равномерно распределяют шпателем по поверхности среды, этим же шпателем, не прожигая его, втирают материал в питательную среду во второй чашке, а затем – в третьей. При таком посеве в первой чашке будет сливной рост, а в последующих чашках вырастают изолированные колонии.

Выделение чистой культуры по Щукевичу

В результате самостоятельной работы студент должен знать:

1. Классификацию, морфологию грибов, их методы изучения.

2. Классификацию и морфологию актиномицетов.

3. Правила противоэпидемических режимов и техники безопасности.

Уметь:

1. Дифференцировать микроорганизмы при микроскопии.

2. Микроскопировать окрашенные препараты.

3. Обеззараживать материал, обрабатывать руки дезинфирующими препаратами.

4. Приготавливать препараты из чистых культур.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления мясо-пептонных сред используют мясной бульон, который получают следующим образом: 500 г мелко изрубленного свежего мяса без костей, жира и сухожилий заливают в эмалированной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50°С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 50—55°С. Мясо отжимают, экстракт процеживают через марлю со слоем ваты, кипятят 30 мин для свертывания коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз через марлю с ватой, второй — через бумажный фильтр). Фильтрат доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин (пробки колб закрывают сверху колпачками из бумаги). Ватные пробки должны быть плотными, так как они служат фильтром, препятствующим проникновению бактерий из воздуха после стерилизации.

Мясной бульон может быть использован в любое время для приготовления соответствующих сред. Если их готовят сразу, то предварительная стерилизация мясного бульона не требуется.

Нередко в лабораторных условиях мясной настой кипятят вместе с мясом, затем мясо отжимают. При этом бульон получается хорошего качества. При потребности в мясном бульоне особо высокой питательности во время настаивания мяса с водой добавляют немного пепсина и подкисляют бульон соляной кислотой. Пепсин способствует дополнительной гидролизации белковых соединений мяса, и в результате количество доступных бактериям питательных веществ возрастает. Мясо можно заменить мясным экстрактом (5 г на 1 л среды).

Для приготовления МПБ к 1 л мясного бульона добавляют 5—10 г пептона (первый продукт гидролиза белка) для повышения калорийности среды и 5 г поваренной соли для создания осмотической активности. Среду нагревают до растворения пептона, постоянно помешивая.

Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, приливая 20%-ный раствор Na₂CO₃ до посинения влажной красной лакмусовой бумажки. Дли проверки рН среды удобно использовать индикатор бромтимолблау: 1—2 капли его смешивают в фарфоровой чашке с каплей бульона. В нейтральной среде бромтимолблау — бутылочно-зеленый, в кислой — желтый, в щелочной — синий.

После установления рН среду снова кипятят 5—10 мин, и белки, свернувшиеся при изменении реакции среды, отфильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульона или осветлив его белком. Для этого свежий яичный белок взбивают с двойным по объему количеством воды и смешивают с охлажденным до 50 °С бульоном. Смесь кипятят, помешивая, на слабом огне 10 мин, затем фильтруют. Прозрачный мясо-пептонный бульон разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин.

Мясо-пептонный агар (МПА). К 1 л МПБ добавляют 15— 20 г агара. Среду нагревают до растворения агара (температура его плавления — 100 °С, затвердевания — 40 °С), устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na₂CO₃ и через воронку разливают в пробирки (приблизительно по 10 мл агара столбиком для последующего разлива по чашкам Петри и по 5 мл для получения скошенного агара — косяков).

При разливе агара необходимо следить за тем, чтобы края пробирок оставались сухими, иначе пробки прилипнут к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120 °С 20 мин.

Мясо-пептонная желатина (МПЖ).В 1 л МПБ помешают 100—150 г желатины. Температура плавления желатины зависит от ее содержания в среде: в случае 10%-ной концентрации в среде она плавится при 24 °С; в случае 15%-ной — при 25 °С. В летнее время среды готовят, добавляя 15% желатины.

После растворения желатины при осторожном нагревании устанавливают слабощелочную реакцию среды (как для МПБ и МПА), кипятят 5 мин, затем охлаждают до 40—50 °С. Взбитый, с небольшим количеством воды яичный белок вливают в охлажденную желатиновую среду, хорошо взбалтывают и снова нагревают. Среда после выпадения белков в осадок становится прозрачной. Ее фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр, разливают в пробирки и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром, прогревая среду 3 раза по 30 мин каждые 24 ч.

Картофельный агар. Нарезают ломтиками 200 г очищенного и промытого водой картофеля, заливают 1 л водопроводной воды, варят 30 мин. Отвар фильтруют через вату и добавляют воду до первоначального объема. К полученной жидкости прибавляют 2% агара, кипятят до его расплавления и устанавливают нейтральную реакцию среды (рН = 7). Среду стерилизуют 20 мин при 1 атм 1 .

Пивное сусло и сусло-агар. Зерна ячменя замачивают в холодной воде и проращивают при 35 °С. После того как ростки станут вдвое длиннее зерен, последние высушивают до воздушно-сухого состояния (можно при слабом подогревании), получая солод. Для приготовления сусла солод крупно размалывают и смешивают с водой (250 г солода на 1 л воды). Для лучшего выделения фермента амилазы смесь подогревают при 57 °С до исчезновения реакции на крахмал (синего окрашивания с иодом). Пробы на осахаривание крахмала проводят в фарфоровой чашке в капле жидкости.

Сусло процеживают через вату, затем фильтруют через бумажный фильтр. Такое сусло содержит 10—20% сахара. Точное его содержание определяют по плотности раствора при помощи сахариметра. Сусло разбавляют водой до концентрации сахара 6—8% и стерилизуют 30 мин при 115 °С и давлении 0,5 атм. Готовое сусло можно получить на пивоваренном заводе.

Для приготовления сусло-агара к пивному суслу добавляют 2,5—3% агара, кипятят до расплавления, фильтруют через вату и стерилизуют при тех же условиях, как и пивное сусло.

Обезжиренное молоко. Для приготовления питательных сред используют снятое молоко, так называемый обрат, так как жир в молоке неблагоприятно влияет на рост некоторых микроорганизмов. Обрат получают сепарированием молока, нагретого до 34 °С. Можно удалять жир и при отстаивании молока.

При стерилизации следует помнить о том, что молоко нельзя длительное время выдерживать в автоклаве, так как лактоза (молочный сахар), содержащаяся в молоке, может карамелизоваться.

Обезжиренное молоко разливают в стерильные пробирки и выдерживают при 115 °С (давление 0,5 атм) 10 мин. Перед стерилизацией кислотность обрата не должна превышать 22° Тернера, иначе молоко свернется. После стерилизации его выдерживают 3 сут в термостате при 30°С. чтобы спровоцировать развитие спорообразующих и других стойких к нагреванию форм. Через 3 сут пробирки с молоком просматривают и те, в которых развились микроорганизмы, выбраковывают.

При стерилизации в автоклаве иногда возможно побурение молока вследствие карамелизации молочного сахара и пептонизании казеина. При длительной стерилизации на дно пробирки выпадает осадок казеина, который может частично пептонизироваться. Перегретoe побуревшее молоко в качестве среды использовать нельзя.

Дрожжевые среды. Дрожжевая вода. 50—100 г сухих дрожжей разводят в 1 л воды, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение 3 дней ежедневно.

Дрожжевой автолизат. 200 г прессованных дрожжей разводят в 1 л воды; добавляют 2 г Na₂HPO₄, каплями I н. раствор NaOH (до рH 6,1) и 5 мл хлороформа, выдерживают при 37 °С 2 сут, доводят раствором NaOH до рН 7,4, кипятят 30 мин. фильтруют через бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют при 115 °С 30 мин.

Дрожжевой экстракт. 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 л воды, смесь кипятят 1 ч, трижды отфильтровывают через бумажный фильтр и стерилизуют при 115 °С 30 мин.

Бобовый отвар. 50 г фасоли (лучше белой) заливают 1 л водопроводной воды и варят до готовности так, чтобы бобы не разварились. Полученный отвар фильтруют через вату, добавляют к нему 10 г сахара и доводят до первоначального объема. Устанавливают слабощелочную реакцию среды, разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве 30 мин при давлении пара 1,5 атм.

1 По системе СИ давление принято выражать в паскалях (Па): 1 атм = 1,01325 х 10 5 Па = 0,1 МПа.

|	следующая лекция ==>
Разнообразие питательных сред	|	Стерилизация текучим паром

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

План ответа макропрепарата.

1. Название
2. Ингредиенты
3. Назначение
4. Наблюдаемый результат

1. Рост кишечных палочек на среде Эндо.

Среда Эндо – дифференциально-диагностическая среда. В составе среды: лактоза и индикатор кислотности - фуксин. Среда предназначена для выделения (преимущественно из кала и мочи) и дифференциации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae. Лактозопозитивные кишечные палочки, входящие в состав нормальной микрофлоры кишечника растут колониями малиново-красного цвета с металлическим блеском, так как расщепляют лактозу и изменяют рН среды. Лактозоотрицательные микроорганизмы (некоторые патогенные кишечные палочки, шигеллы, сальмонеллы) растут колониями белого или светло-розового цвета.

1. Рост кишечных палочек и дизентерийных палочек на среде Плоскирева.

Среда Плоскирева – дифференциально-диагностическая среда. Это селективная среда для выделения шигелл и сальмонелл. Готовая среда прозрачна, имеет розовато-желтоватый цвет. Среда Плоскирева относится к плотным средам для выделения чистых культур. В состав среды Плоскирева входят ингибирующие вещества (желчные соли, бриллиантовый зеленый, йод), вследствие чего она должна полностью подавлять рост грамположительной флоры, значительно задерживать (первые 24 ч) рост эшерихий и другой сопутствующей микрофлоры, подавлять роение протея. Дифференцирующие свойства агара Плоскирева основаны на изменении рН в кислую сторону при росте лактозоферментирующих бактерий, которые образуют колонии брусничного цвета (индикатор нейтральный красный). Лактозоотрицательные бактерии вырастают в виде бесцветных или слабоокрашенных колоний.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА).

Эта реакция относится к серологическим реакциям иммунитета между антигенами (АГ) и антителами (АТ). Детерминанта АГ связывается с активным центром АТ. Соединение АГ и АТ осуществляется посредством водородных и гидрофобных связей, взаимодействия ионов, кулоновских и ван-дер-вальсовых сил. Прочность соединения АГ с АТ обеспечивается не только силами связывания, но и оптимальной стерической адаптацией активного центра АТ к АГ-детерминанте.

Серологические реакции протекают в две фазы. Первая – специфическая невидимая, - заключается во взаимодействии АГ с АТ. Вторая фаза – видимая, - проявляется в зависимости от типа реакции, который определяется свойствами АГ, АТ и другими ингридиентами реакций.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА; син. реакция пассивной гемагглютинации) - метод обнаружения и идентификации антигенов или антител, основанный на возникающем в их присутствии феномене агглютинации эритроцитов, на поверхности которых были предварительно адсорбированы соответствующие специфические антитела или антигены.

Серологический метод. Сыворотка крови обследуемого пациента (содержит неизвестные (искомые) АТ). Эритроцитарный диагностикум – содержит известный антиген, адсорбированный на поверхности эритроцита. Образование комплекса АГ-АТ влечет за собой и склеивание эритроцитов, что легко учитывать. Таким образом, эритроциты не участвуют непосредственно в образовании комплекса АГ-АТ, служат для укрупнения корпускула и соответственно являются индикаторами наличия комплекса АГ-АТ. РНГА более чувствительна, чем РА.

РНГА может использоваться как экспресс-метод, например при диагностике чумы или газовой гангрены. Ингредиенты: исследуемый материал – неизвестный АГ, диагностикум эритроцитарный антительный (содержит известные АТ адсорбированные на поверхности эритроцита). Образование комплекса АГ-АТ влечет за собой и склеивание эритроцитов, что легко учитывать.

Определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом индикаторных дисков.

Важное значение в лечении и профилактике инфекционных заболеваний принадлежит химиотерапии и химиопрофилактике, эффективность которых в значительной степени зависит от чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Среди химиотерапевтических средств, используемых для лечения больных с гнойно-септическими инфекциями, ведущее место занимают антибиотики.

Для определения чувствительности выделенных микроорганизмов к антибиотикам широко используется диско-диффузионный метод. Исследуемую культуру суспензируют в стерильном физиологическом растворе приготовляя 1-миллиардную взвесь по стандарту мутности. Бактериальную взвесь (1 мл) стерильной пипеткой наливают на поверхность плотной питательной среды в чашку Петри и равномерно распределяют шпателем. Избыток жидкости удаляют пипеткой. Шпатель и пипетки помещают в стакан с дезраствором. На засеянную поверхность стерильным пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга и отступя 2 см от края чашки бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37°С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам. Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундируюшим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин).

Персистентные свойства микроорганизмов – антилизоцимная активность (АЛА).

АЛА – секреторный фактор персистенции. Изучают АЛА по методике О.В. Бухарина с соавт. (1984). Для этого к 1,5% питательному агару добавляют различные дозы яичного лизоцима (от 1 до 5 мкг) и разливают в чашки Петри. После застывания среды на подсушенную поверхность наносят каплю 1 млрд. взвеси суточной агаровой культуры изучаемого микроорганизма. Чашки инкубируют в термостате при 37 0 С 24 часа, после этого выросшие колонии подвергаются обработке парами хлороформа в течение 20 минут, затем наслаивается слой 0,7% питательного агара с 0,1 мл 1 млрд. взвеси суточной агаровой культуры Micrococcus luteus (lysodeikticus) АТСС 15307 (ГИСК им. Тарасевича) чувствительной к литическому действия лизоцима. Учет результатов проводится через 24 часа инкубации в термостате по наличию зоны роста микрококка вокруг тех штаммов, которые нейтрализуют внесенный в слой агара яичный лизоцим. Антилизоцимную активность выражают в мкг инактивированного в среде лизоцима.

На данной чашке видны колонии АЛА+ и АЛА- штаммов микроорганизмов. Над колониями АЛА+ штаммов есть рост микрококка в виде мелких желтых колоний.

Лизоцимная активность.

Лизоцим –термостабильный белок, фермент, разрушает клеточную стенку преимущественно грамположительных бактерий, разрывая β-гликозидные связи между аминосахарами пептидогликана, что способствует образованию протопластов с последующим их лизисом. Содержится во всех тканевых жидкостях, в лейкоцитах, макрофагах и других фагоцитирующих клетках. Продуцируется лизоцим преимущественно клетками моноцитарно/макрофагального ряда. Лизоцим усиливает антибактериальную активность комплекса антиген (микроб)-антитело-комплемент, способствуя лизису пептидогликана клеточной стенки бактерий. Помимо животного раличают растительный и микробный лизоцим.

Микробный лизоцимявляется одним из факторов колонизации. Лизоцимная активность (ЛА) определяется путем посева исследуемой культуры микроорганизма на питательную среду, содержащую 1 млрд. суспензию суточной агаровой культуры Micrococcus luteus (lysodeikticus) АТСС 15307 (ГИСК им. Тарасевича). Результат оценивается после инкубации при 37 0 С в течение суток по зоне лизиса в толще среды индикаторного штамма микрококка вокруг изучаемых колоний.

Иммуноферментный метод

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс.

Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результате реакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически.

Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.

Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой: [AT]+[АГ]↔[АТАГ]

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

Принципальная схема иммуноферментного анализа для выявления АТ является следующей. Известный АГ (вирус, белок) – диагностикум фиксируется на твердой фазе. К нему добавляют сыворотку обследуемого с неизвестными АТ. После инкубации и промывки на антигене остаются специфичные к нему АТ, если таковые имелись в сыворотке обследуемого. Для обнаружения комплекса АГ-АТ, к нему добавляют кроличью антиглобулиновую сыворотку меченую ферментом (АГС-Ф). Для получения данной сыворотки иммунизируют кролика глобулинами человека. Полученную от кролика сыворотку метят каким-либо ферментом, например, пероксидазой хрена. Если в обследуемой сыворотке есть АТ к АГ (диагностикум), то они будут служить антигеном для антиглобулиновой сыворотки. После второй промывки образовавшийся комплекс АГ+АТ+АГС-Ф можно обнаружить, добавив субстрат на фермент (перекись водорода) и индикатор на продукты расщепления субстрата (хромоген на активные формы кислорода). Изменение цвета индикатора свидетельствует о наличии искомых АТ в сыворотке обследуемого.

Среда Китта-Тароцци.

Питательный бульон с глюкозой и кусочками свежих органов животных. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Сверху среду заливают слоем стерильного масла, которые не пропускает кислород из воздуха в среду. В результате создаются условия для культивирования анаэробных микроорганизмов.

План ответа макропрепарата.

1. Название
2. Ингредиенты
3. Назначение
4. Наблюдаемый результат

1. Рост кишечных палочек на среде Эндо.

Среда Эндо – дифференциально-диагностическая среда. В составе среды: лактоза и индикатор кислотности - фуксин. Среда предназначена для выделения (преимущественно из кала и мочи) и дифференциации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae. Лактозопозитивные кишечные палочки, входящие в состав нормальной микрофлоры кишечника растут колониями малиново-красного цвета с металлическим блеском, так как расщепляют лактозу и изменяют рН среды. Лактозоотрицательные микроорганизмы (некоторые патогенные кишечные палочки, шигеллы, сальмонеллы) растут колониями белого или светло-розового цвета.

1. Рост кишечных палочек и дизентерийных палочек на среде Плоскирева.

Среда Плоскирева – дифференциально-диагностическая среда. Это селективная среда для выделения шигелл и сальмонелл. Готовая среда прозрачна, имеет розовато-желтоватый цвет. Среда Плоскирева относится к плотным средам для выделения чистых культур. В состав среды Плоскирева входят ингибирующие вещества (желчные соли, бриллиантовый зеленый, йод), вследствие чего она должна полностью подавлять рост грамположительной флоры, значительно задерживать (первые 24 ч) рост эшерихий и другой сопутствующей микрофлоры, подавлять роение протея. Дифференцирующие свойства агара Плоскирева основаны на изменении рН в кислую сторону при росте лактозоферментирующих бактерий, которые образуют колонии брусничного цвета (индикатор нейтральный красный). Лактозоотрицательные бактерии вырастают в виде бесцветных или слабоокрашенных колоний.

Рост стафилококка на кровяном агаре.

Кровяной агар (КА) – сложная плотная питательная среда для культивирования прихотливых видов микроорганизмов и выявления гемолизинов (определения у МО одного из факторов вирулентности – гемолитической активности). На 100 мл расплавленный и остуженный до 45 0 С мясо-пептонный агар (МПА) добавляют 5 мл отмытых эритроцитов барана или эритроцитарной массы крови человека (I группы), аккуратно перемешивают, разливают в чашки Петри. На поверхность застывшего и подсушенного КА засевают чистую культуру исследуемых микроорганизмов, после суточной инкубации при 37 0 С определяют зоны гемолиза вокруг выросших колоний. Зоны гемолиза виды в виде полного (β-гемолиз) или частичного (α-гемолиз) просветления вокруг колоний. На данной чашке видны колонии стафилококков бело-серого цвета с зонами полного просветления вокруг, что свидетельствует о наличии у этих микроорганизмов гемолитической активности.

4. Реакция преципитации в агаре для определения токсигенности дифтерийной палочки.

Реакция преципитации относится к реакции иммунитета между антигенами (АГ) и антителами (АТ). Детерминанта АГ связывается с активным центром АТ. Соединение АГ и АТ осуществляется посредством водородных и гидрофобных связей, взаимодействия ионов, кулоновских и ван-дер-вальсовых сил. Прочность соединения АГ с АТ обеспечивается не только силами связывания, но и оптимальной стерической адаптацией активного центра АТ к АГ-детерминанте.

Серологические реакции протекают в две фазы. Первая – специфическая невидимая, - заключается во взаимодействии АГ с АТ. Вторая фаза – видимая, - проявляется в зависимости от типа реакции, который определяется свойствами АГ, АТ и другими ингридиентами реакций. В реакции преципитации (РП) участвует растворенный антиген. При контакте с антителами – преципитинами образуется осадок. Реакцию преципитации можно проводить в жидкой среде (в пробирках) и в геле (в чашках Петри).

Одной из разновидностей РП в геле является реакция определения токсигенности дифтерийной палочки. Для этого в чашку Петри на питательную среду помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Эта сыворотка содержит АТ к дифтерийному токсину, получается путем иммунизации животного (кролика) анатоксинами (токсин лишенный вирулентности-токсигенности, но сохранивший иммуногенность-антигенность). Затем на плотнуб питательну среду в чашке высевают испытуемые культуры в виде пятачков на расстоянии 0,6-0,8 см от края фильтровальной бумаги. Чашки инкубируют при 37 0 С в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации в виде дуг. Дуга – это визуальное отображение взаимодействия АТ диффундирующих из фильтровальной бумаги и АГ - экзотоксинов, выделяемых токсигенными культурами.

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.