Определение бактерий группы кишечных палочек в молоке и молочных продуктах

Санитарно-бактериологическое исследование молока и молочных продуктов Ф. К. Черкес, Н. А. Бельская

Молоко и молочные продукты являются благоприятной средой для размножения микроорганизмов.

При изготовлении некоторых молочных продуктов: творога, кефира, простокваши, ряженки и других используют специальную микрофлору, например молочнокислые стрептококки, молочно-кислые ацидофильные палочки и др. Микрофлора, используемая для приготовления этих продуктов, является для них специфичной и не учитывается.

Неспецифической микрофлорой, встречающейся в молоке и молочных продуктах, являются аэробные бактерии: БГКП, стафилококки и др.

С молоком могут передаваться возбудители туберкулеза, бруцеллеза, сальмонеллеза, сибирской язвы, вирус полиомиелита, анаэробные бациллы и т. д.

Обсеменение молока и молочных изделий неспецифической микрофлорой может произойти в момент удоя, транспортировки, хранения и т. д.

Исследование молока и молочных продуктов проводят согласно ГОСТу 9225-68.

Отбор проб. Пробы жидких и полужидких продуктов после тщательного их перемешивания отбирают в количестве 50-100 мл в стерильные колбы. Пробы сливочного масла, сыра, творога отбирают с помощью стерильного щупа из глубины продукта. Перед взятием пробы масла, творога верхний слой продукта тщательно зачищают, а поверхность сыра в месте отбора пробы прижигают раскаленным ножом. Из расфасованных продуктов берут по 2 образца в оригинальной упаковке. Взятые образцы сопровождают документом, в котором указывают:

1. Номер образца.

2. Наименование и сорт продукта.

3. Дату изготовления.

4. Дату и час отбора пробы.

5. Объем необходимых исследований.

6. Должность и подпись лица, отобравшего пробу.

Микробиологическое исследование продукта должно производиться не позднее чем через 4 ч с момента отбора пробы. При транспортировке температура не должна превышать 6° С.

ГОСТ для молока и молочных изделий предусматривает определение общего числа бактерий в 1 г (мл) и определение титра цитратотрицательных (цитратнегативных) разновидностей БГКП (коли-титр).

Подготовка образцов для исследования. Из молока и других молочных продуктов готовят десятикратные разведения (по общепринятой методике). Количество разведений для каждого вида продукта готовят с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения (табл. 56).

Таблица 56. Разведение молока и молочных продуктов

Примечание. Для определения общего количества бактерий следует выбирать те разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 50 и не более 300 колоний.

Посев. По 1 мл каждого разведения вносят в 2-3 стерильные чашки Петри и заливают 12-15 мл растопленного и остуженного до 45° С питательного агара. Предварительно чашки маркируют. Сразу после заливки содержимое чашки перемешивают (путем легкого вращательного покачивания) для равномерного распределения посеянного материала. Посевы ставят в термостат при 37° С на 48 ч.

По истечении срока инкубации чашки вынимают и подсчитывают число колоний при помощи счетчика. Число колоний, выросших на каждой чашке, умножают на соответствующее разведение. Полученные результаты по отдельным чашкам складывают, делят на количество чашек и получают среднее арифметическое, которое является показателем общего числа бактерий в 1 г (мл).

Соответствующие ГОСТы регламентируют качество продуктов, что устанавливают по допустимым показателям: общему числу микробов и коли-титру. Пример для двух видов продуктов представлен в табл. 57.

Таблица 57. Показатели общего числа бактерий и коли-титра в молоке

Примечание. Для других молочных продуктов также имеется ГОСТ обусловливающий допустимое количество микробов в 1 мл (г) продукта. Буквы А и Б обозначают категорию продукта.

В кисломолочных продуктах (кефир, простокваша, творог, сметана и др.), содержащих обильную специфическую микрофлору, общее количество бактерий не определяют, а контролируют состав микрофлоры. Для этого из кисломолочных продуктов готовят препараты и красят метиленовым синим. В поле зрения препарата должны находиться только специфические для данного продукта микроорганизмы. Например, для простокваши - молочно-кислые стрептококки и палочки; для кефира - молочно-кислые стрептококки и палочки, единичные дрожжи. Микроскопия позволяет выявить микроорганизмы порчи (плесени и большое количество дрожжей).

Обсемененность молока и молочных продуктов бактериями группы кишечной палочки определяют бродильным методом. Бродильный титр - это то наименьшее количество продуктов, выраженное в граммах или миллилитрах, в котором присутствует кишечная палочка. Согласно ГОСТу 9225-68 учитываются только цитратнегативные разновидности кишечной палочки (рис. 57).

Рис. 57. Определение коли-титра молока

Посев молока и молочно-кислых продуктов производят в 6 пробирок с 5 мл среды Кесслер. В 3 пробирки засевают по 1 мл цельного продукта, в другие 3 пробирки по 1 мл из разведения 1:10 (0,1 мл). Посевы инкубируют в термостате при 43° С 18-24 ч.

Из каждой забродившей пробирки производят посев на сектор среды Эндо и инкубируют при 37° С 18-24 ч.

При отсутствии типичных для БГКП колоний продукт считают незагрязненным кишечной палочкой.

При наличии типичных для БГКП колоний делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При обнаружении грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу и производят посев на среду с глюкозой и среду Козера.

Производят учет результатов. Наличие кислоты и газа на среде с глюкозой и отсутствие роста на среде Козера свидетельствует о наличии цитратнегативных разновидностей кишечной палочки. Коли-титр вычисляют по табл. 58.

Таблица 58. Вычисление коли-титра в пастеризованном молоке, сливках, кефире, простокваше, ацидофильном молоке

Примечание. Вычисление коли-титра для масла, сыра, творожных изделий, мороженого и молочных консервов проводят по другим таблицам, указанным в ГОСТе.

Присутствие патогенных микроорганизмов в молоке и молочных продуктах недопустимо.

1. Как определяют в молоке и молочных продуктах общее число микробов?

2. Как определяют коли-титр?

3. Какие микроорганизмы могут встречаться в молоке и молочных продуктах?

Среда Кесслер. См. с. 484.

Среда Козера. К 1 л дистиллированной воды добавляют 1,0 г фосфата однозамещенного калия, 0,2 г сульфата магния, 2,5-3,0 г цитрата натрия. Раствор стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 15 мин, добавляют 10 мл 0,5% спиртового раствора бромтимолового синего и разливают в стерильные пробирки.

Среда глюкозой. См. главу 7.

Желточно-солевая среда. См. главу 14.

Группа компаний "Униконс"

Продвижение и реализация пищевых добавок, антисептиков и другой продукции НПО Альтернатива.

"Бесплатные образцы"

Комплексные пищевые добавки "Униконс".

Для всех отраслей пищевой промышленности!

"Петритест"

Микробиологические экспресс-тесты. Первые результаты уже через 4 часа.

• Вы здесь:
• Библиотека технолога
  
• Молочная промышленность
  
• Микробиология молока и молочных продуктов

5.3. БАКТЕРИИ ГРУППЫ КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК (БГКП) КАК ОСНОВНЫЕ САНИТАРНО-ПОКАЗАТЕЛЬНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

В группу БГКП входят представители нескольких родов семейства Enterobacteriaceae, в том числе Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia. Эти микроорганизмы обладают многими общими морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.

Бактерии группы кишечных палочек - короткие (длина 1-3 мкм, ширина 0,5-0,8 мкм) полиморфные подвижные и неподвижные грамотрицательные палочки, не образующие спор. Бактерии этой группы хорошо растут на простых питательных средах: мясопептонном бульоне (МПБ), мясопептонном агаре (МПА). На МПБ дают обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легкоразбивающийся. Образуют пристеночное кольцо, пленка на поверхности бульона обычно отсутствует. На МПА колонии прозрачные с серовато-голубым отливом, легко сливающиеся между собой. На среде Эндо образуют плоские красные колонии средней величины. Красные колонии могут быть с темным металлическим блеском (Е. coli) или без блеска (Е. aerogenes). Для лактозоотрицательных вариантов кишечной палочки (В. paracoli) характерны бесцветные колонии. Им свойственна широкая приспособительная изменчивость, в результате которой возникают разнообразные варианты, что усложняет их классификацию.

Большинство бактерий группы кишечных палочек (БГКП) не разжижают желатина, свертывают молоко, расщепляют пептоны с образованием аминов, аммиака, сероводорода, обладают высокой ферментативной активностью в отношении лактозы, глюкозы и других Сахаров, а также спиртов. Не обладают оксидазной активностью. По способности расщеплять лактозу при температуре 37°С БГКП делят на лактозоотрицательные и лактозоположительные кишечные палочки (ЛКП), или колиформные, которые нормируются по международным стандартам. Из группы ЛКП выделяются фекальные кишечные палочки (ФКП), способные ферментировать лактозу при температуре 44,5°С. К ним относится Е. coli, не растущая на цитратной среде.

На этих свойствах основано определение БГКП в молочных продуктах в средах Кесслер (в соответствии с 32901-2014 по образованию газа) или Кода (по изменению цвета индикатора) после термостатирования при температуре 37±1°С в течение 24 ч, а для мороженого - 48 ч. Дифференциально- диагностическая - среда Эндо, на которой Е. coli образует красные колонии с металлическим блеском. Образование полупрозрачных бесцветных или бледно-розовых колоний говорит о принадлежности микроорганизмов к лакгозоотри- цательным, в том числе патогенным энтеробактериям.

Санитарно-показательное значение родов неодинаково: наличие эшери хий свидетельствуют о свежем фекальном загрязнении, цитробактер и энтеробактер (иногда их считают измененными эшерихиями под влиянием пребывания во внешней среде) - показатели давнего или нефекального загрязнения.

В молоке БГКП хорошо размножаются, доводя его кислотность до 50- 80°Т и образуя в нем неровный ноздреватый сгусток. Молочнокислые микроорганизмы замедляют развитие БГКП. При режимах пастеризации, принятых в молочной промышленности, БГКП гибнут. Обычные дезинфицирующие средства полностью обеззараживают оборудование, инвентарь, руки от БГКП.

Дифференциацию БГКП можно проводить с помощью специальных тестов (комплекс признаков ТИМАЦ + Л):

Т - температурный тест (тест Эйкмана, выявляет способность эшери- хий ферментировать глюкозу, лактозу, маннит с образованием газа при 44- 45°С, другие не обладают такой способностью);

И- индолообразование (способность эшерихий расщеплять аминокислоту триптофан с выделением индола);

М - реакция с метиловым красным, заключается в определении кислотообразования при ферментации глюкозы: если индикатор изменяет светло-желтый цвет на красный, это свидетельствует о снижении рН до 5 и о наличии эшерихий и цитробактер, энтеробактер не изменяет цвет индикатора;

А- реакция на ацетилметилкарбинол (ацетоин), выявляет способность микроорганизмов образовывать это вещество в среде с глюкозой; проводится качественная реакция с гидроксидом калия и креатином, дающая розовый цвет, такой способностью обладают только представители рода цитробактер;

Ц - цитратный тест (способность микроорганизмов усваивать в качестве единственного источника углерода лимонную кислоту или ее соли, используют среду Козера с цитратами, цитробактер и энтеробактер растут на таких средах, называются цитратположительными бактериями, эшерихии - нет);

Л - лактозный тест (способность ферментировать лактозу).

Основные (наиболее стабильные) тесты - температурный и цитратный.

При воздействии факторов внешней среды (например, в присутствии антибиотиков) свойства БГКП могут меняться. Для дифференциации видов дополнительно определяют уреазную активность, рост на средах с цианистым калием, ферментацию различных углеводов, используют специальные таблицы.

Критерии санитарной оценки молочных продуктов и других объектов по присутствию СПМ предусмотрены действующими ГОСТ и СанПиН. Использовавшийся ранее показатель бродильного титра заменен показателем отсутствия БГКП в определенной массе продукта. Так, например, в пастеризованном молоке БГКП должны отсутствовать в 0,01 см, в ультрапастеризованном молоке - в 10 см 3 , ряженке - в 1 г, в кефирной закваске - в 3 мл, в твороге - в 0,001 г.

БГКП. К бактериям группы кишечных палочек (колиформных) относят роды Escherichia (типичный представитель E. coli), Citrobacter (типичный представитель C. colicitrovorum), Enterobacter (типичный представитель E. aerogenes), которые объединены в одно семейство Enterobacteriaceae благодаря общности свойств.

Общая хар-ка БГКП: - палочки грамм-отрицательные, короткие; - не спорообразующие; - на среде Энда дают красные колонии с металлическим блеском - E.coli, красные – энтеробактерии, розовые – цитробактерии, б/цв – лактозо – отрицательные.Биохимические свойства. Большинство бактерий группы кишечных палочек (БГКП) не разжижают желатина, свертывают молоко, расщепляют пептоны с образованием аминов, аммиака, сероводорода, обладают высокой ферментативной активностью в отношении лактозы, глюкозы и других сахаров, а также спиртов. Не обладают оксидазной активностью. Устойчивость. Бактерии группы кишечных палочек обезвреживаются обычными методами пастеризации (65-75°С). При 60°С кишечная палочка погибает через 15 минут. 1% раствор фенола вызывает гибель микроба через 5-15 минут.Санитарно-показательное значение. Бактерии рода Escherichia– постоян. обитатели кишечника чел и животн, и обнаружение их в воде и ПП свидетельств о свежем фекальном загрязнении. Бактерии родов Citrobacter и Enterobacter могут находиться повсюду: в почве, на растениях, реже в кишечнике. Считают, что они предст собой результат изменен ишерихий после пребывания их во внешней среде и поэтому являются показателями более давнего фекального загрязнения. Значение БГКП:

- в сыром молоке указывает - на на эпидемиологическую опасность

- через несколько часов при 8-10 о С - о нарушении условий хранения и реализации, транспортиров.

- появл. БГКП после пастеризации расценивают как 2-ое загрязнение

- наличие БГКП в готовой продукции указывает на - плохую мойку и дезинфекцию оборудования.

Род Salmonella. Сальмонеллезы относятся к числу наиболее распространенных токсикоинфекций. Обнаруж сальмонелл всегда свидетельствует о фекальном загрязнении. Сальмонеллы устойчивы к высоким концентрациям поваренной соли (особенно в средах, содержащих белок) и высушиванию. Сохраняют свою жизнеспособность в комнатной пыли, в различных почвах (97 мес.), в воде открытых водоемов (до 45 дн). Находясь в ПП, особенно в мясных, сальмонеллы очень устойчивы к тепловой обработке. Соление и копчение мяса оказывают слабое воздействие на сальмонелл. При размножении сальмонелл в молоке его внешний вид и вкус не изменяются, пастеризация молока в течение 30 мин при 85ºС в производственных условиях способствует полному уничтожению этих бактерий. Человек заражается сальмонеллами в результ употребл мяса и мясопродуктов. Молоко и молочные продукты гораздо реже явл причиной пищевых отравлений. Инфицирование молока главным образом происходит через загрязненную посуду, доильные аппараты, руки доильщиц и др. Возбудители сальмонеллезов могут попасть в ПП, изготовленные из растительного сырья (салаты и соусы столовые) не только в процессе производства, но и с пищевыми ингредиентами, в частности с сухими овощными приправами и специями.

Микробиол-й пок-ль	Санитарно-гигиенич-е значение	Колич-й критерий,	Характеристика
БГКП	Для хар-ки санитарно-эпидем. состояния пищевых продуктов и условий их изготовления	Более 10 3 КОЕ/г(см 3 ) Наличие E. coli	Низкое санит. состояние пищ-го прод-та и усл-й его изгот. Свежее фекальное загрязнение
Сальмонеллы	-//-и для хар-ки безопасности для потребителя	обнаружение в 25г продукта	Низкое санит. состояние пищ-го прод-та и усл-й его изгот., опасность продуктадля чел

Идентификация БГКП:

● Посев на среду обогащения - Кесслер, одновременная идентификация по газообразов.: есть газообразование - возможно БКГП, нет газообразования - нет БГКП

● Идентификация БГКП на среде Эндо: Из газ(+) пробирок отбирают по 1 мл и сеют на тв.среду Эндо, идентифицируют колонии БГКП по цвету, проводят дифференциацию по родам в зависимости от цвета колоний: Если есть красные, розовые и бледно-розовые культуры - значит присутствуют БГКП, если нет колоний – нет БГКП. Если есть колонии, но бесцветные - подозрение на патогены. Далее по цвету идентифицируют роды БГКП: 1) красные - с металлич. оттенк. – эшерихия 2) розовые – энтеробактер 3) бледно-розовые - со слизью – клебсиела 4) бледно-розовые - цитробактер, церрации 5) бесцветные (лактозо (-)) - протей 6) прозрачные мелкие – патогенны

● Идентификация на среде Козера: выращивание на среде с глюкозой/лимонной кислотой, Т=43°С,24ч. М/о цитрат(+) меняют цвет красителя с зеленого на васильковый. М/о цитрат(-) не меняют цвет.

Определяют по количеству положительных проб в 3 пробирках.

Сальмонеллы – патогенны, анализируют в 25 г продукта, их там не должно быть. Служат индикатором патогенов.

Выявление сальмонелл проводится в 4 этапа

1) первичный (прямой) посев - Посев на среду Энда и Плоскирава на сутки и Т=37 0 С. На ср. Энда – прозрачные колонии,

2) обогащение (посев на жидкие селективные среды, термостатирование)

3) посев со среды обогащения осущ после обогащения на плотные диагностические среды, термостатирование - на ср. Плоскирава- прозрачные,но более мелкие чем на среде Эндо

4) подтверждение путем установления ферментативных и серологических свойств сальмонелл

Исследование молока и молочных продуктов проводится согласно НТД:

Пробы молочных продуктов для анализа отбирают в стерильную посуду, посев проводится не позднее 4х'часов с момента отбора. Пробы должны храниться и транспортироваться при температуре не выше 6 градусов, не допуская подмораживания. Поверхность упаковки перед посевом обрабатывается 70 градусным спиртом и вскрывается у спиртовки. Продукт тщательно перемешиваем. Кисломолочные продукты и закваски нейтрализуем 10% раствором гидрокарбоната натрия! Перед посевом готовим Юкратные разведение продукта в стерильном изотоническом растворе хлористого натрия. Для этого из проб молока, сливок, сметаны, кисломолочных напитков, мороженого, масла отбираем Юкуб.см. и вносим в 90куб.см. раствора хлористого натрия и получаем разведение 1:10, для масла и мороженого раствор хлористого натрия берем подогретый до 40-45градусов. Из проб творога, творожных изделий, сыра делаем навеску Юграмм и добавляем к 90куб.см. хлористого натрия, получая разведение 1:10. Дальнейшие разведения готовим из исходных. Для приготовления каждого разведения пользуемся новой стерильной пипеткой. В молочных продуктах определяем:

Патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы;

Количество плесневых и дрожжевых грибов;

Для определения количества МАФАнМ выбираем те разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. Посев делаем на 2 стерильные чашки Петри из соответствующих разведений в количестве 1куб.см. Чашки заливаем расплавленным и охлажденным до 45 градусов слабо-щелочным агаром, содержимое чашек тщательно перемешиваем. После застывания чашки переворачиваем и инкубируем в термостате при ЗО градусах в течение 72 часов.

Для определения БГКП пользуемся средой Кесслер. Метод основан на способности бактерий группы кишечной палочки сбраживать в среде Кесслер лактозу, в следствие чего - образуются кислота и газ. Посев проводится по 1куб.см. из соответствующих разведений в 5куб.см. среды Кесслер. Посевы растут при Т 37градусов 18-20часов. Посевы просматриваем и при отсутствии газообразования в пробирках продукт считают не загрязненным БГКП. При наличии газа в засеянном объеме делаем высев на среду Эндо, далее отвиваем на среду с глюкозой.

Для определения наличия патогенных м/о проводим посев 25граммов продукта в магневую среду, посевы выдерживаем в термостате при Т 37градусов в течение 18-24 часов, после инкубации делаем высев на среды Плоскирева, висмут-сульфитный агар, среду Левина. После инкубации чашки просматриваются и отбираются характерные для патогенных колоний. Проводим дальнейшую идентификацию.

Для определения количества стафилококка делаем посев продукта или его разведений в солевой бульон. Соотношение засеваемого продукта и питательной среды 1:10. Выращивание при 37 градусах 24 часа. Для подтверждения выросших на бульоне м/о делаем высев петлей на чашке Петри подсушенного желточно-солевого агара и инкубируем при 37 градусах 24-48 часов. Из характерных колоний делаем препараты, окрашиваем по Граму и микроскопируем. Стафилококки -грамположительны, имеют шарообразную форму и располагаются скоплениями, чаще в виде виноградной грозди. Для подтверждения принадлежности к золотистому стафилококку ставим реакцию плазмокоагуляции. В пробирку с 0.5мл разведенной кроличьей плазмы вносим петлю суточной агаровой культуры, пробирку ставим в термостат и выдерживаем при 37 градусах в течение 3-6 часов. Если через 6 часов не произошло коагуляции плазмы, то оставляем до следующего дня. Если плазма не свернулась через 24 часа, то культуру относят к коагулазоотрицательным.

Наличие плесневых и дрожжевых грибов определяем при посеве продукта и их разведений на среде Сабуро. Посевы выращиваем при комнатной температуре в течение 120 часов. Подсчитываем количество характерных выросших колоний.

Определение количества бифидобактерий в кисломолочных продуктах проводим после нейтрализации. Берем разведение от 4 до 8 и засеваем пробирки с бифидоагаром, разлитую высоким столбиком не менее Юкуб.см. После тщательного перемешивания посевы .помещаем в термостат при 37 градусах на 72 часа предварительный учет допускается через 48 часов. Подтверждению наличия бифидобактерий проводим методом микроскопирования. Мазки грамположительной палочки, слегка изогнутые с бифуркацией на концах или без нее, расположенные группами в виде римских пятерок, могут образовывать короткие цепочки. На мазке может присутствовать и другая флора (молочнокислые стептококки и палочки или единичные клетки дрожжей).

Определение молочнокислых микроорганизмов распространяется на кисломолочные продукты и закваски. Метод основан на высеве определенного количества продукта или его разведений в жидкие или агаризованные селективные питательные среды, культивировании посевов при оптимальных условиях и при необходимости определении морфологических и биохимических свойств обнаруженных м/о. Посевы делаем в стерильное обезжиренное молоко, термостатируем при 32 градусах в течение 72 часов. При развитии молочнокислых бактерий молоко свертывается. При необходимости проводим микроскопирование препаратов.

Метод основан на способности БГКП (микроорганизмы семейства энтеробактерий родов эшерихия, цитробактер, энтеробактер, клебсиелла, серрация; бесспоровые, грамотрицательные, аэробные и факультативно-анаэробные палочки) сбраживать в питательной среде лактозу с образованием газа и кислоты при температуре 37 ± 1 °С в течение 24 ч. Признак роста БГКП на жидкой среде Кесслер - визуально наблюдаемое накопление газа в поплавке. Посев продуктов или их разведений в жидкую среду Кесслер, проводили в количествах, указанных в таблице 2.2.

Таблица 2.2 - Объем или масса засеваемого продукта при определении БГКП на среде Кесслер

Засеваемые объем или масса продукта

Сырые молоко и сливки, см3

от 0,1 до 0,00001

Пахта для промышленной переработки, молочная сыворотка для производства напитков, см3

Молочная сыворотка для производства других пищевых продуктов, см3

Отобранные после пастеризации молоко и сливки, ультрапастеризованное молоко (без асептического розлива), см3

Пастеризованные молоко и сливки, молоко с компонентами, кисломолочные продукты и напитки с компонентами и без компонентов, см3

По 1 см 3 соответствующих разведений продукта засевали в пробирки с 5 см 3 среды Кесслер. Посев 10 см 3 пастеризованного молока, отобранного после пастеризатора, производили в колбочки с 40-50 см 3 среды Кесслер.

Пробирки или колбы с посевами помещали в термостат при 37±1 °С на 18-24 ч. Окончательный результат снимали через 24 ч для всех продуктов.

При снятии результатов пробирки или колбы с посевами просматривали и визуально определяли наличие или отсутствие газа в поплавках.

При наличии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов считается, что БГКП обнаружены в данном объеме продукта. При отсутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов давали заключение об отсутствии БГКП в нем.

Метод основан на высеве продукта или гомогената продукта и их разведений в питательные среды, определении принадлежности выделенных микроорганизмов к плесневым грибам и дрожжам по характерному росту на питательных средах и по морфологии клеток.

Из подготовленной пробы продукта и (или) его разведения отбирали навеску объемом 1±0,1 см 3 .

Продукт и (или) его разведения высевали по ГОСТ 26670 параллельно в две чашки Петри. Посевы заливали расплавленной и охлажденной до температуры 45±1 °С средой . Параллельно с этим заливали чашку А Петри 15-20 см 3 среды для проверки ее стерильности.

Допускается при установлении промышленной стерильности консервов и при выявлении возбудителей порчи в продуктах по 2,0 см 3 исследуемого материала высевать параллельно в две пробирки с 5 см 3 жидкого солодового сусла.

Посевы термостатировали при температуре 24±1 °С в течение 5 суток, посевы на чашках Петри термостатировали дном вверх.

Через 3 суток термостатирования проводили предварительный учет типичных колоний или появления характерных признаков роста на жидких питательных средах.

Если в посевах на агаризованных средах присутствуют мукоровые, очень быстро растущие грибы, то снятие предварительных результатов проводили очень осторожно, не допуская того, чтобы споры этих грибов осыпались и дали рост вторичных колоний. Через 5 суток проводили окончательный учет результатов термостатирования посевов. Колонии дрожжей и плесневых грибов разделяли визуально.

Рост дрожжей на агаризованных средах сопровождается образованием крупных, выпуклых, блестящих, серовато-белых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем. Развитие дрожжей в жидкой среде сопровождается появлением мути, запаха брожения и газа.

Развитие плесневых грибов на питательных средах сопровождается появлением мицелия различной окраски.

Для количественного подсчета отбирали чашки, на которых выросло от 15 до 150 колоний дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов.

При необходимости для разделения колоний дрожжей и плесневых грибов проводили микроскопические исследования. Для этого из отдельных колоний или из посевов на жидкую среду готовили препараты методом раздавленной капли. На предметное стекло наносили каплю стерильной водопроводной воды. Затем в эту каплю прокаленной иглой вносили часть колонии или петлей наносили каплю культуральной жидкости. Полученную суспензию покрывали покровным стеклом.

Результаты оценивали по каждой пробе отдельно.

Если при испытании продукта на питательных средах обнаружен рост дрожжей и плесневых грибов и их присутствие подтверждено микроскопированием, то давали заключение о присутствии этих микроорганизмов в продукте.

Результаты обрабатывали и пересчитывали отдельно для дрожжей и плесневых грибов.

Количество дрожжей и плесневых грибов в 1 г или в 1 см 3 продукта (X) вычисляли по формуле (2.2):

где ?C - сумма всех подсчитанных колоний на чашках Петри в двух последовательных десятикратных разведениях при условии, что на каждой чашке число колоний отвечает требованиям; n₁- количество чашек Петри, подсчитанное для меньшего разведения, то есть для более концентрированного разведения продукта; n₂ - количество чашек Петри, подсчитанное для большего разведения; n- степень разведения продукта (для меньшего разведения). Результаты испытания записывали в соответствии с требованиями ГОСТ 26670.

Молоко и молочные продукты могут содержать различные микроорганизмы. При изготовлении кисломолочных продуктов в молоко после пастеризации добавляют закваску, которая характеризует специфическую микрофлору данного продукта. Неспецифическую микрофлору молока составляют гнилостные микробы, аэробные и анаэробные бациллы, плесени и многие другие. Обсеменение молока микробами происходит уже в процессе дойки, и интенсивность его зависит от соблюдения санитарно-гигиенических условий при получении молока. Плохие условия хранения молока способствуют нарастанию в нем микрофлоры. Патогенные микроорганизмы могут попадать в молоко в процессе его получения и транспортировки из окружающей среды или могут содержаться в молоке больных животных (стафилококки, бруцеллы, микобактерии туберкулеза). Через молоко и молочные продукты могут передаваться возбудители различных заболеваний.

При санитарно-микробиологическом исследовании молока и других молочных продуктов производят определение:

1) общего количества бактерий (КМАФАнМ);

2) количества БГКП;

4) патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы;

5) для некоторых видов молочных продуктов - L. monocytogenes, плесневые грибы и дрожжи;

6) по эпидемическим показаниям проводят бактериологическое исследование для выявления возбудителя заболевания, возникновение которого связывают с употреблением данного продукта.

Качество молока и молочных продуктов определяется в соответствии с показателями СанПиН 2.3.2.1078-01 (табл. 13).

Таблица 13. Санитарно-микробиологические нормативы для молока и некоторых видов молочной продукции.

Группа продуктов	КМАФАнМ, КОЕ/см 3 (г), не более	Масса продукта (г, см 3 ), в которой не допускаются
БГКП	Патоген-ные, в том числе сальмонел-лы	S. aureus	L. monocytogenes
Молоко сырое: высший сорт первый сорт второй сорт	3 х 10 5 5 х 10 5 4 х 10 6
Молоко, сыворотка молочная, пахта пастеризованные (в потребительской таре)	1 х 10 5	0,01
Сливки пастеризованные: (в потребительской таре)	1 х 10 5	0,01
Жидкие кисломолочные продукты, в т.ч. йогурт, со сроками годности не более 72 час.	0,01	1,0
Молоко сгущенное с сахаром (в потребительской таре)	2 х 10 4	1,0
Молоко коровье сухое цельное	5 х 10 4	0,1	1,0
Сыры (твердые, полутвердые, рассольные, мягкие)	0,001	не более 500 КОЕ/г
Мороженое закаленное	1 х 10 5	0,01	1,0

Отбор проб. Перед вскрытием тары с продукцией крышки фляг, бочек, банок и т. д. очищают от загрязнений, промывают и протирают. В первую очередь проводят отбор проб для микробиологических анализов.

Отбор точечных проб жидких, вязких и сгущенных продуктов проводят кружкой или черпаком вместимостью 0,1; 0,25; 0,5 дм 3 (л) с жесткой ручкой длиной от 50 до 100 см. Отбор точечных проб полутвердых, твердых и сыпучих продуктов проводят шпателями, ножами или специальными шупами. При составлении объединенной пробы молока и молочных продуктов число точечных проб от каждой единицы тары с продукцией, включенной в выборку, должно быть одинаковым.

Пробы отбирают в стерильную посуду, закрывают ее корковыми, пластмассовыми или обернутыми фольгой резиновыми пробками или крышками. Допускается отбирать пробы масла, сыра, сухих молочных продуктов в пергамент.

Пробы молока и молочных продуктов должны доставляться в лаборатории сразу после их отбора. До начала анализа пробы молока и молочных продуктов следует хранить при температуре от 2 до 8ºС. пробы мороженого — при температуре не выше -2ºС. Анализ проб продуктов проводят сразу после доставки их в лабораторию, но не позднее, чем через 4 ч после их отбора.

Подготовка проб к исследованию.

Подготовку проб к анализу в зависимости от вида молочной продукции проводят согласно ГОСТ 9225-84.

Перед посевом готовят десятикратные разведения продукта. Из проб молока, сливок, сметаны, кисломолочных продуктов, мороженого, масла отбирают стерильной пипеткой 10 см 3 и вносят в 90 см 3 стерильных растворов хлористого натрия или фосфатного буфера. Масло и мороженое вносят в растворы, подогретые до 40-45ºС. К приготовленным навескам по 10 г творога, творожных изделий; сгущенных молочных консервов и сухих молочных продуктов добавляют 90 см 3 стерильных растворов хлористого натрия или фосфатного буфера, подогретых до 40—45ºС и взбалтывают в течение 3—5 мин до возможно более полного эмульгирования. К навеске сыра 10 г постепенно добавляют 90 см 3 стерильных растворов хлористого натрия или лимонно-кислого натрия или фосфатного буфера, подогретых до 40—45ºС, и тщательно перемешивают до полного эмульгирования. Получают разведение 1:10. Из первого разведения 1:10 готовят последующие 1:100 и т. д.

При посеве на чашки Петри посевной материал вносят от большего разведения к меньшему. В этом случае пользуются одной пипеткой.

Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАМ)

Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения в соответствии с табл. 14.

Таблица 14. Количество продукта, используемого для посева на питательные среды.

Наименование продукта	Засеваемые объемы или масса, см 3 или г
Молоко и сливки сырые Масло Молоко и сливки пастеризованные Молоко или сливки сгущенные с сахаром Молоко сухое Мороженое Плавленый сыр Лактоза	0.0001 0,01 0,1 0.1 0,01 0,1 0,1 0.1	0.00001 0,001 0.01 0.01 0,001 0.01 0.01 0,01	0.000001 0,0001 0,001 0,001 0,001

Из каждой пробы делают посев на две-три чашки из разведений, указанных в табл. 10. Каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1 см 3 в одну чашку Петри с расплавленным и охлажденной до температуры 40—45ºС питательным агаром. Допускается посев исследуемого продукта на чашки Петри из одного и того же разведения в количестве 1 и 0,1 см 3 . Сразу после посева содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала. После застывания агара чашки Петри инкубируют при температуре 30ºС 72 часа.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке.

КМАФАМ в 1 см 3 или 1 г продукта в единицах вычисляют по формуле:

где n — количество колоний, подсчитанных на чашке Петри;

m — число десятикратных разведений.

За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое, полученное по всем чашкам.

Определение БГКП

В среду Кесслер производят посев в количествах, указанных в табл. 15.

Таблица 15. Количество продукта, необходимого для определения БГКП.

Наименование продукта	Засеваемые объемы или масса, см 3 или г	Количество пробирок или колбочек со средой, засеваемых из каждого разведения
Молоко и сливки сырые Масло Молоко и сливки пастеризованные Молоко или сливки сгущенные с сахаром Молоко сухое Мороженое Сыр зрелый	От 0,1 до 0,00001 1; 0,1; 0,01 1; 0,1; 0,01 1 или 0,1 0,1 0,1 От 0,1 до 0,001

По 1 см 3 соответствующих разведений продукта засевают в пробирки с 5 см 3 среды Кесслер. Пробирки с посевами помешают в термостат при 37ºС на 18—24 ч. При исследовании мороженого пробирки с посевом выдерживают в термостате в течение 48 ч.

При отсутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов после инкубации дают заключение об отсутствии в нем БГКП. При наличии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов считается, что БГКП обнаружены в нем.

Определение специфической микрофлоры кисломолочных продуктов.

Так как кисломолочные продукты готовят с использованием микробных заквасок, то они должны содержать определенный набор микроорганизмов. Для определения микрофлоры используют метод микроскопирования. Метод основан на просмотре под микроскопом препаратов, окрашенных метиленовым голубым, для ориентировочной характеристики микрофлоры кисломолочных продуктов.

Для приготовления препарата на чистое предметное стекло наносят петлей небольшую каплю исследуемого материала и распределяют на площади около 1 см 2 . При исследовании творога и творожных изделий на стекло наносят каплю воды, вводят в нее петлей продукт, тщательно перемешивают и растирают на плошали 1 см 2 . Препарат высушивают, фиксируют на пламени горелки, окрашивают метиленовым голубым и микроскопируют.

Список литературы.

3. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для мед. вузов. – СПб.: СпецЛит, 2002. – 591 с.

4. Поздеев О.К. Медицинская микробиология / под ред. В.И. Покровского. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 768 с.

5. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / Под ред. В.В. Теца. – М.: Медицина, 2002. – 352 с.

6. ГОСТ 17.1.5.02-80 Охрана природы. Гидросфера. Гигиенические требования к зонам рекреации водных объектов

7. ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа

8. ГОСТ 18963-73 Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа

9. ГОСТ 25102-90 Молоко и молочные продукты. Методы определения содержания спор мезофильных анаэробных бактерий

10. ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

11. ГОСТ Р 51921-2002 Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes

12. ГОСТ Р 53415-2009 Вода. Отбор проб для микробиологического анализа

13. ГОСТ Р 54004-2010 Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний.

14. Инструкция по бактериологическому контролю комплекса санитарно-гигиенических мероприятий в лечебно-профилактических учреждениях (отделениях хирургического профиля, в палатах и отделениях реанимации и интенсивной терапии)

15. Методические указания по контролю работы паровых и воздушных стерилизаторов №15/6-5 от 28.02.91.

16. МУ 2.1.5.800-99 Организация госсанэпиднадзора за обеззараживанием сточных вод

17. МУК 4.2.1035-01 Контроль дезинфекционных камер

18. МУК 4.2.1018-01 Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды

19. ПРИКАЗ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 12 апреля 2011 г. N 302н (в ред. Приказа Минздрава России от 15.05.2013 N 296н) Об утверждении перечней вредных и (или) опасных производственных факторов и работ, при выполнении которых проводятся обязательные предварительные и периодические медицинские осмотры (обследования), и порядка проведения обязательных предварительных и периодических медицинских осмотров (обследований) работников, занятых на тяжелых работах и на работах с вредными и (или) опасными условиями труда.

20. СанПиН 2.1.2.1188-03 Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества

21. СанПиН 2.1.4.1074-01. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества

22. СанПиН 2.1.4.1175-02 Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников

23. СанПиН 2.1.5.980-00 Гигиенические требования к охране поверхностных вод

24. СанПиН 2.3.2.1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов

25. СанПиН 2.1.5.980-00 Гигиенические требования к охране поверхностных вод

26. СанПиН 2.1.3.2630-10 “Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность”