Определение жизнеспособности личинок гельминтов

Значение членистоногих как переносчиков возбудителей заболеваний человека и животных больше, чем роль их как паразитов, поскольку вред, приносимый этими болезнями человеку, огромен.
Болезни, передаваемые через переносчиков-членистоногих, называются трансмиссивными.
Специфические переносчики– в его теле возбудитель проходит определенный цикл развития и/или размножается, например, плазмодии малярии в теле комара.
Трансовариальная передача возбудителя– передача возбудителя через яйца потомству (у клещей).
Трансфазовая передача возбудителя– вобудитель сохраняется и передается от преимагинальной фазы в имаго.
Механические переносчики– возбудитель в теле переносчика не развивается и не размножается, например, тараканы, мухи.
Один и тот же переносчик может быть специфическим переносчиком одной инфекции и механическим переносчиком другой. Например, комары Anopheles являются специфическими переносчиками малярии и механическими туляремии или вирусных инфекций.

Рис. 6. Членистоногие - специфические и неспецифические переносчики возбудителей заболеваний человека и животных.

Тема 9.Паразитологические методы исследования.
Лабораторная диагностика инвазий.

Содержание:

· Лабораторные методы диагностики паразитарных болезней.

· Принципы лабораторной диагностики протозоозов .

· Принципы лабораторной диагностики гельминтозов.

· Методы сбора, учета и изучения членистоногих.

ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Паразитологическая диагностика основывается на прямом обнаружении и идентификации возбудителей. Иногда прибегают к иммунологическим исследованиям, культивированию паразитов или заражению ими лабораторных животных (метод биопроб). Использование любых методов паразитологической диагностики должно преследовать также цель выявления смешанных (двойных и более) инфекций/инвазий, что обозначается как полипаразитизм.
В материале, направляемом на исследование в лабораторию, паразит бывает представлен в тех стадиях, с помощью которых он передается (непосредственно или через переносчика) от инфицированного индивида окружающим людям (цисты простейших, яйца или личинки гельминтов, трофозоиты, гаметоциты), они являются одновременно и диагностическими.

ПРИНЦИПЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПРОТОЗООЗОВ

Рис. 1. Малярийные плазмодии в эритроцитах (препарат-мазок крови больного малярией), стрелкой указан кольцевидный трофозоит в эритроците.

Выделения мочеполовых путей исследуют для обнаружения мочеполовых трихомонад. 1-2 капли выделений сразу же помещают в каплю изотонического раствора хлорида натрия на предметном стекле, накрывают покровным стеклом и исследуют при среднем увеличении микроскопа (Х40, Х10) с сухой системой.

Рис. 2. Трихомонады.

Испражнения (кал) исследуют с целью обнаружения простейших кишечника. Движение простейших - один из самых характерных признаков, который позволяет поставить правильный диагноз. Поэтому основным правилом, которое следует строго выполнять, является исследование только свежего материала, не позже, чем через 20-30 мин после его выделения. При невозможности немедленного исследования испражнения помещают в консервант. Обязательным является исследование нативного мазка и мазка, окрашенного раствором Люголя. Цисты раствором Люголя окрашиваются в золотисто-коричневый цвет.

Рис. 3. Цисты лямблии (препарат-мазок).

ПРИНЦИПЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГОНОСТИКИ ГЕЛЬМИНТОЗОВ

Окончательный диагноз гельминтозов может быть установлен только на основании положительных данных лабораторных исследований. Основным методом лабораторной диагностики этих инвазий является обнаружение яицилиличинок гельминтов.
Материалом для исследования служат испражнения, содержимое двенадцатиперстной кишки, кровь, мокрота, биоптаты тканей и другие материалы. Сбор материала для исследования производят в чистую стеклянную или пластмассовую посуду, на которую наклеивают этикетку с указанием необходимых сведений.
Испражнения для анализов должны доставляться в лабораторию не позднее одних суток после их выделения, а при подозрении на стронгилоидоз - немедленно. При невозможности доставить фекалии в указанные сроки их следует смешивать с 2-5 кратным количеством консервирующих жидкостей и хранить до исследования в охлажденном виде.

Рис. 4. Яйца гельминтов (слева); отличительные признаки цепней бычьего и свиного (справа).

Исследование объектов окружающей среды на зараженность гельминтами.
Анализ воды, почвы, овощей, различных предметов проводят для определения их роли в передаче яиц гельминтов и заражении человека, степени загрязненности окружающей среды и выбора необходимых профилактических мероприятий.
В окружающей среде яйца гельминтов постепенно погибают, и опасность для человека представляют только жизнеспособные инвазионные яйца и личинки. Поэтому необходимо в каждом случае обнаружения яиц определить степень и процент их жизнеспособности. Это даст возможность правильно оценить роль того или иного фактора передачи, выяснить условия и сроки сохранения яиц в окружающей среде, обосновать определенные мероприятия по обезвреживанию (д е и н в а з и и) факторов окружающей среды.
Определение жизнеспособности личинок гельминтов, обнаруженных в мясе или рыбе, необходимо в случаях, когда приходится решать вопрос о степени их опасности для заражения человека или эффективности обезвреживания загрязненного продукта.
При обнаружении в мясе финн (цистицерков) бычьего или свиного цепней их осторожно извлекают, помещают в подогретую до 40°С смесь из равных частей изотонического раствора хлорида натрия и желчи скота. Затем переносят в термостат при температуре 37° С. В течение 10 мин - 1 ч головки начинают выворачиваться, причем длительно сохраняется их легкая подвижность. Погибшие финны при наблюдении в течение 2 ч не выворачиваются.

Подобными специальными методами определяют жизнеспособность личинок трихинелл, яиц цестод, личинок описторха, личинок дифиллоботриид и др.

МЕТОДЫ СБОРА, УЧЕТА И ИЗУЧЕНИЯ ЧЛЕНИСТОНОГИХ

Сбор членистоногих, опасных для здоровья человека, проводят на определенной территории с целью изучения видового состава, сезонной численности, мест выплода и т.д. Полученные данные являются основой оценки эпидемиологической роли переносчиков, прогнозирования ситуации и организации борьбы с ними.

Методы учета и сбора. В зависимости от мест обитания и вида сбор и учет численности клещей проводятся разными методами.

Иксодовых клещейв природных условиях собирают с помощью несложных приспособлений. Флажок - кусок фланели или другой светлой ткани размером 80Х40 см, прикрепленный к палке. Флажок протягивают по растительности, осматривая его через каждые 20-25 шагов.
Все виды учета проводят по маршруту на расстоянии в 1 км или в расчете на 1 ч сбора.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Виды глистов у человека

Глисты, или гельминты, — это паразитические черви, которые живут за счет животных и растений, питаются и размножаются внутри живых организмов. Мы с вами не исключение.

- По статистике, каждый третий житель Земли инфицирован червями-паразитами. Предполагается, что нет ни одного взрослого человека, за жизнь которого у него не поселилось бы в организме ни одного глиста, - говорит врач-терапевт, семейный доктор Айгуль Харисова, известная в сети как @doctor_aygul.

В быту почти всех червей-паразитов люди именуют глистами, не думая о том, сколько на самом деле видов этих неприятных созданий.

Среди всех глистов-паразитов, способных существовать в человеческом теле, выделяют три основные группы:

нематоды, относящиеся к круглым гельминтам: острица, власоглав, трихинеллы, аскариды;
ленточные, или плоские глисты, относящиеся к цестодам (различные виды цепней, лентецов и эхинококки);
паразиты-сосальщики, или трематоды, вызывающие описторхоз, фасциолез, шистосомоз, парагонимоз и другие недуги.

Собирательное название для заболеваний, вызванных глистами, - гельминтоз. Он возникает, когда в человеческий организм попадают личинки или яйца глистов. Это может произойти по следующим причинам:

причиной глистов у человека часто является привычка грызть ногти, сосать пальцы, держать во рту различные предметы: ручки, карандаши;

риск заражения глистами велик, если есть домашние животные, особенно гуляющие по улицам.

- Даже при своевременной антигельминтной терапии собаки и кошки могут распространять яйца глист, принесенные с улицы на лапах, шерсти, - уточняет врач-терапевт Айгуль Харисова.

опасно употреблять сырую воду из неизвестного источника или мыть ей пищу;

необработанные должным образом мясо и рыба – это шанс заразиться. При употреблении плохо обработанной термически говядины - бычим цепнем, свинины - свиным цепнем, в малосоленой и сырой рыбе обитает широкий лентец;

подхватить глистов можно и в доме, если в нем редко убираются, носят уличную обувь, избегают мытья полов;

глисты могут передаваться и от зараженного человека, если у вас с ним общая посуда, постельное бельё, вы долго находитесь с ним в одном помещении.

Очевидно, что большинство причин глистов у человека упирается в несоблюдение правил гигиены. Кто следит за собой, своим домом и своими питомцами, тот может никогда и не столкнуться с этими паразитами.

Лечение глистов у человека

Лечением глистов у человека занимается врач-терапевт, если пациент взрослый, или педиатр, если глисты у ребенка.

- Самолечением в случае глистов заниматься ни в коем случае не стоит: препараты, применяемые при лечении гельминтозов, довольно тяжелые для организма, - отмечает доктор Айгуль Харисова.

Обычно в лечении глистов у человека применяется комплексная терапия, цель которой не только в том, чтобы уничтожить паразитов, но и в том, чтобы ликвидировать последствия их жизнедеятельности. Поэтому одними противогельминтными лекарствами обойтись вряд ли удастся. К тому же лечить часто приходится всех членов семьи, ведь люди в узком кругу легко инфицируют друг друга.

Наряду с лекарственными средствами, может быть назначен прием витаминов и ферментов, улучшающих пищеварение. Для более эффективного лечения глистов человеку придётся соблюдать диету, ограничить углеводы: сладкое, мучное.

- Если в доме есть животные, им обязательно нужно проводить антигельминтную терапию дважды в год, иначе все усилия по лечению будут напрасны, - уточняет врач-терапевт Айгуль Харисова.

Глисты – проблема довольно деликатная, это толкает многих людей на самолечение. Реклама постоянно твердит, что те или иные таблетки способны вмиг решить проблему. Однако многие не замечают, что в любой рекламе присутствует указание, что перед применением нужно проконсультироваться с врачом. Это не простые слова, мы уже сказали, что препараты против глистов очень серьезные и могут причинить вред при бесконтрольном приеме.

В качестве лечения глистов у человека применяют:

противогельминтные препараты – они уничтожают червей;
антигистаминные препараты, которые помогут, если есть аллергия на массово гибнущих паразитов;
энтеросорбенты, которые выводят из организма вредные вещества и продукты жизнедеятельности паразитов.
препараты железа, витамин В12, фолиевую кислоту – все они помогут при анемии.
гепатопротекторы для защиты печени.
пробиотики.

Наиболее часто применяются следующие высокоактивные и в то же время малотоксичные препараты:

Левамизол,
Албендазол,
Пирантел,
Медамин,
Празиквантел,
Диэтилкарбамазин.

- Кратность приема препаратов определяет врач-инфекционист, по результатам объективного осмотра, жалоб, анализов пациента, - уточняет терапевт Екатерина Космачева.

ГОСТ Р 54378-2011

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РЫБА, НЕРЫБНЫЕ ОБЪЕКТЫ И ПРОДУКЦИЯ ИЗ НИХ

Методы определения жизнеспособности личинок гельминтов

Fish, non-fish objects and products from them. Methods for evaluation of viability of the helminth larvae

Дата введения 2013-01-01

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным унитарным предприятием "Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии" (ФГУП "ВНИРО"), Обществом с ограниченной ответственностью "Каспийский научно-исследовательский и аналитический центр рыбной промышленности" (ООО НИиАЦРП "Каспрыбтестцентр")

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 300 "Рыбные продукты, пищевые, кормовые, технические и упаковка"

4 В настоящем стандарте учтены основные нормативные положения международного стандарта Codex stan 244-2004* "Стандарт на сельдь атлантическую соленую и шпрот соленый" (Codex Stan 244-2004 "Standard for salted atlantic herring and salted sprat", NEQ) в части способа определения жизнеспособности личинок нематод, приведенного в подразделе 9.4
________________
* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

Введение

Настоящий стандарт в части определения жизнеспособности личинок нематод гармонизирован с международным стандартом Комиссии "Кодекс Алиментариус" стандарт Кодекса 244-2004 для соленой атлантической сельди и соленых шпрот (приложение 1) в той мере, в которой возможно его эффективное применение на территории Российской Федерации.

Настоящий стандарт устанавливает основные термины и соответствующие им определения, которые необходимы для понимания особенностей объекта стандартизации.

При определении жизнеспособности личинок гельминтов, опасных для здоровья человека, организация (лаборатория) самостоятельно устанавливает такой алгоритм проведения испытаний, который обеспечит получение достоверных данных об исследуемом объекте. С этой целью может быть использовано поэтапное проведение определения жизнеспособности личинок гельминтов несколькими методами, приведенными в настоящем стандарте.

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на рыбу, нерыбные объекты и продукцию из них (далее - продукция) и устанавливает методы определения жизнеспособности личинок гельминтов (далее - методы).

Примечание - Методы могут быть применимы для земноводных, пресмыкающихся и продукции из них.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 50380-2005 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Термины и определения

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 3309-84 Часы настольные и настенные балансовые механические. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4025-95 Мясорубки бытовые. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 20469-95 Электромясорубки бытовые. Технические условия

ГОСТ 21240-89 Скальпели и ножи медицинские. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 21241-89 Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 50380, а также следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 гельминты (helminths): Паразитические черви.

Примечание - К гельминтам относят гирокотилиды, моногенеи, нематоды, пиявки, скребни, трематоды, турбеллярии и цестоды. К опасным для здоровья человека относят отдельные личинки нематод, скребней, трематод и цестод, установленные в нормативных правовых актах Российской Федерации*.
_______________
* До введения соответствующих нормативных правовых актов Российской Федерации - в нормативных документах федеральных органов исполнительной власти [1].

3.2 личинка гельминта (helminths larva): Постэмбриональная стадия индивидуального развития паразита, ведущего самостоятельную жизнь, активно питающегося и развивающегося, претерпевая характерные для этой стадии линьки.

3.3 жизнеспособность (личинки гельминта) (viability): Способность личинки гельминта сохранять свою жизнь в меняющихся условиях среды.

4 Сущность методов

Методы определения жизнеспособности основаны на выделении личинок гельминтов и стимулировании их движений физическим раздражением, электрическим или химическим воздействием.

5 Требования к условиям проведения определения жизнеспособности личинок гельминтов

5.1 Лаборатория, в которой проводят определение жизнеспособности личинок гельминтов, должна иметь разрешение на работу с патогенными биологическими агентами IV группы.

5.2 Помещения лаборатории должны удовлетворять требованиям, приведенным в [2], [3].

5.3 Специалисты, проводящие испытания по установлению жизнеспособности личинок гельминтов, должны быть подготовлены и иметь допуск к работе с патогенными биологическими агентами IV группы.

6 Требования к средствам измерений, оборудованию, материалам, реактивам

6.2 Допускается использование вспомогательного оборудования по метрологическим, техническим характеристикам не хуже указанных в настоящем стандарте.

Допускается использование других реактивов, по качеству и чистоте не ниже вышеуказанных.

7 Порядок подготовки растворов реактивов и их применение

0,85 г хлористого натрия растворяют в 100 см дистиллированной воды. Допускается использовать предварительно прокипяченную питьевую воду.

Применяют при рассматривании личинок гельминтов и для приготовления раствора трипсина.

5,4 см соляной кислоты плотностью 1,188 г/см осторожно вливают в мерную колбу вместимостью 1000 см с предварительно налитой дистиллированной водой в объеме от 500 до 700 см , перемешивают и раствор доводят до метки дистиллированной водой.

Применяют для приготовления раствора пепсина.

0,5 г трипсина растворяют в 100 см физиологического раствора по 7.1.

Раствор применяют при использовании метода химического воздействия.

0,5 г пепсина растворяют в 1000 см раствора соляной кислоты концентрацией 0,063 моль/дм по 7.2.

Раствор применяют при использовании метода переваривания и физического раздражения.

8 Порядок подготовки к проведению определений жизнеспособности личинок гельминтов

8.1.1 Отбор проб проводят в соответствии с требованиями соответствующих стандартов для рассматриваемых групп продукции.

При отсутствии специализированных стандартов рекомендуется достижение соглашения заинтересованных сторон по отбору проб конкретной продукции.

8.1.2 Пробы, полученные для определения, не должны быть повреждены и/или изменены во время транспортирования и хранения.

8.2.1 При транспортировании проб должно быть обеспечено их содержание в условиях, предупреждающих влияние на жизнеспособность личинок гельминтов.

Условия транспортирования должны обеспечивать следующие температуры хранения:

- рыбы и нерыбных объектов сырца (свежих) и охлажденных - от 0 °С до 4 °С;

- рыбы и нерыбных объектов мороженых - не выше минус 18 °С;

- иной продукции - в соответствии с требованиями стандартов или технической документации.

8.2.2 Для проб продукции должна быть обеспечена доставка их на испытание наиболее быстрым способом транспортирования.

8.3.1 При поступлении проб на испытание должны быть проверены их состояние, акты отбора и, при необходимости, измерена температура.

8.3.2 Каждая проба должна быть снабжена этикеткой, на которую наносят:

- наименование и местонахождение владельца продукции;

- наименование и местонахождение изготовителя;

- наименование продукции;

- дату, время и место отбора пробы;

- срок и условия хранения пробы до испытания;

- номер пробы;

- номер и дату акта отбора пробы;

- обозначение документа (при наличии), в соответствии с которым изготовлена продукция, или реквизиты договора (контракта).

8.3.3 Пробу принимают на испытание согласно прилагаемому к ней акту отбора проб.

В случае несоответствия пробы акту или неполной информации на этикетке, не позволяющей ее идентифицировать, пробу не принимают на испытание, о чем немедленно уведомляют организацию, направившую пробу.

8.3.4 Принятые по акту пробы документируют таким образом, чтобы была возможность отследить их движение от приема до составления протокола испытаний.

В лабораторном журнале должна быть зафиксирована следующая информация:

- дата отбора и поступления пробы;

- номер пробы;

- наименование предприятия (организации), направившего пробу;

- состояние пробы при получении (наличие этикетки, упаковки и др.);

- наименование продукции, от которой взята проба;

- соответствие параметров пробы данным, приведенным на этикетке;

- цель направления пробы.

8.3.5 Пробы перед определением хранят в условиях, предупреждающих влияние на жизнеспособность личинок гельминтов в соответствии с требованиями стандартов или технических документов.

8.4.1 Пробы свежей (сырца), охлажденной кулинарной продукции, консервов и пресервов анализируют без предварительной подготовки.

8.4.2 Пробы подмороженной и мороженой продукции анализируют после их размораживания до достижения температуры в центре продукта от 0 °С до 5 °С.

8.4.3 Пробы соленой, пряного посола, маринованной, вяленой, сушено-вяленой, сушеной, подкопченной, копченой и икорной продукции анализируют после их отмачивания в питьевой воде не более суток. Воду меняют каждые 4-6 ч.

Время и кратность отмачивания устанавливают в зависимости от вида продукции.

9 Методы проведения определения жизнеспособности личинок гельминтов

9.1.1 Метод применим к личинкам нематод, скребней, трематод и цестод.

9.1.2 Отобранных личинок нематод, скребней и цестод помещают в чашку Петри или на часовое стекло на фильтровальную бумагу, смоченную физиологическим раствором в соответствии с 7.1, или в чашку Петри, или на часовое стекло в тонкий слой физиологического раствора без использования фильтровальной бумаги. Личинок рассматривают в бинокуляр при соответствующем увеличении.

При наблюдении за личинками в течение 1-2 мин, если личинки живые, фиксируют их слабую подвижность. Если движение личинок не наблюдается, то их следует стимулировать с помощью укола тонкой препаровальной иглой. Если личинка жизнеспособна, то укол вызывает сокращение тела личинки.

9.1.3 Выделенных метацеркарий трематод в цистах помещают на предметное стекло или плоское стекло в соответствии с 6.1, добавляют несколько капель физиологического раствора или воды, накрывают сверху другим предметным или плоским стеклом и помещают на стол бинокуляра или микроскопа. Раствора или воды должно быть добавлено столько, чтобы покровное стекло не сдавливало цисты метацеркарий.

Просмотр цист позволяет заметить медленные движения внутри них метацеркарий, если они живые. При отсутствии движений следует осторожно надавить на верхнее стекло, чтобы было видно легкое сдавливание оболочек цист. Если личинка жизнеспособна, то придавливание стимулирует ее самостоятельные движения.

9.2.1 Метод применим только к личинкам нематод, скребней и цестод.

9.3.1 Метод применим кличинкам трематод.

9.3.2 Выделенных личинок (метацеркарий) трематод в цистах помещают на часовое стекло в тонкий слой раствора трипсина по 7.3 с температурой 36 °С - 37 °С.

Просмотр цист в бинокуляр в течение не более 5 мин позволяет заметить стимулированные раствором трипсина движения личинок и выход инцистированных метацеркарий из цист, если они живые.

9.4.1 Метод применим кличинкам нематод.

9.4.2 Для выделения личинок нематод из мышечной ткани отбирают (200±10) г филе, измельчают вручную или на мясорубке и помещают в емкость (стакан) вместимостью не менее 2000 см , содержащую 1000 см раствора пепсина по 7.4. Смесь подогревают и прогревают на магнитной мешалке при температуре от 35 °С до 37 °С в течение 1-2 ч при постоянном медленном помешивании. Если мышечные ткани не растворились, то раствор процеживают через сито по 6.1, промывают водой и оставшиеся нерастворившиеся ткани переносят в стакан. В стакан добавляют 700 см раствора пепсина и смесь вновь подогревают на магнитной мешалке при температуре от 35 °С до 37 °С при постоянном медленном помешивании до исчезновения крупных кусков мышечной ткани. Раствор процеживают через сито, а содержимое сита промывают водой.

9.4.3 Выделенных личинок нематод пинцетом осторожно переносят в чашки Петри с раствором пепсина и ставят на диск просвечивания в соответствии с 6.1. Температура раствора в чашке Петри должна быть от 35 °С до 37 °С.

При уколе препаровальной иглой у жизнеспособной личинки наблюдаются видимые движения или самопроизвольная реакция. Разовое развертывание скрученных личинок не является признаком жизнеспособности. Живая личинка должна проявлять спонтанные движения.

Примечание - При установлении жизнеспособности личинок нематод в соленой или сладко-соленой продукции период реанимации личинок может продолжаться более 2 ч.

Бесплатная горячая линия юридической помощи

Главная
"МЕТОДЫ САНИТАРНО-ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.796-99" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 22.12.99)

7.7. Методы определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов

Жизнеспособность яиц гельминтов определяют по внешнему виду, путем окрашивания витальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы.

Яйца гельминтов микроскопируют вначале при малом, затем при большом увеличении. У деформированных и мертвых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плазма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдвинуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, которые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней части тела, по мере их гибели она распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли, так называемые "нитки жемчуга".

Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власоглавов, остриц следует вызывать активные движения личинок легким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 °С). Жизнеспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.

У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отслоившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце личинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнаруживается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от их места нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зернистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются вакуоли, а на кутикуле - разрывы.

Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина - 0,5 г, натрия бикарбоната - 0,09 г, дистиллированной воды - 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36 - 38 °С на 4 часа. При этом живые зародыши освобождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также растворяются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6 - 8 часов в термостате при 38 °С.

Если поместить яйца тениид в 1%-ный раствор натрия сульфида или 20%-ный раствор натрия гипохлорида, или же в 1%-ный раствор хлорной воды при 36 - 38 °С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 суток. Незрелые и мертвые онкосферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем "растворяются" в течение 10 минут - 2 часов. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1%-ного раствора натрия хлорида, 0,5%-ного раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36 - 38 °С.

Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на растениях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки трематоды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня наиболее проста методика Иониной Н.С.: у живых яиц медианная пара эмбриональных крючьев или параллельна латеральным, или последние образуют с медианной угол у основания меньше 45°. У мертвых яиц латеральные пары образуют у основания угол с медианной парой больше 45° или же крючья беспорядочно разбросаны (утрачивается их парное расположение); иногда наблюдается сморщивание зародыша, образование зернистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5 - 10° до 38 - 40 °С.

Определение жизнеспособности незрелых яиц нематод следует изучать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3%-ный раствор формалина, приготовленный на изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 24 - 30 °С, яйца власоглавов в 3%-ном растворе соляной кислоты при температуре 30 - 35 °С; яйца остриц в изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 37 °С. Чашки Петри следует открывать 1 - 2 раза в неделю для лучшей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.

Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2 - 3 месяцев свидетельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гельминтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых дней развивается до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию - морулу и т.д.

Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (высотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из равных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консистенции, наливают осторожно на дно цилиндра при помощи стеклянной трубки. В течение 1 - 2-суточного отстаивания в темноте при температуре 25 - 30 °С из яиц вылупляются рабдитовидные личинки, а через 5 - 7 суток они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны даже невооруженным глазом.

Яйца трематод, естественно развивающиеся в воде, например описторхисов, дифиллоботриид, фасциол и других, помещают на часовое стекло, чашку Петри или в другой сосуд, наливают небольшой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол следует учесть, что они развиваются быстрее в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22 - 24 °С через 9 - 12 суток формируется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц трематод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету.

Метод Фюллеборна. Личинки анкилостомид и стронгилид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После выдерживания в термостате при температуре 25 - 30 °С в течение 5 - 6 часов личинки расползаются по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий.

Метод Харада и Мори. В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой берут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровальной бумаге (15 х 150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Накрывают верхний конец куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На пробирке пишут номер, фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят 8 - 10 суток при температуре 28 °С. Для изучения личинок снимают и удаляют целлофановую крышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу фильтровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под поверхность целлофана.

Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 °С на 15 минут, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют под малым увеличением.

Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок необходимо пользоваться данными таблицы 3.

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ФИЛЯРИЕВИДНЫХ ЛИЧИНОК A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, trICHOStrONGYLUS SP.

Личинки	Размеры	Характерные признаки
A. duodenale	Длина тела около 660 мкм, чехлика - 720 нм	Исчерченность чехлика менее выражена, ротовой выступ менее заметен, передний конец тела (но не чехлика) тупой, диаметр кишечной трубки меньше, чем бульбус пищевода, хвостовой конец тупой
N. americanus	Длина тела около 590 мкм, чехлика - 660 нм	Чехлик заметно исчерчен, особенно в хвостовой части тела, ротовой выступ кажется темным, передний конец тела (но не чехлика) закруглен подобно узкому концу куриного яйца, передняя часть кишечной трубки такого диаметра, как бульбус пищевода, хвостовой конец резко заострен
S. stercoralis	Длина тела около 500 мкм	Личинка без чехлика, пищевод составляет около половины длины тела, хвост тупой или разветвленный
Trichostrongylus sp.	Длина тела около 750 мкм	Просвет кишечника не прямой, а зигзагообразный, хвостовой конец закруглен и имеет форму кнопки

Мертвые ткани в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем живые. Эти особенности используют в гельминтологии для определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдельных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми.

Для дифференциального определения живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы.

Для окраски живых и мертвых тканей часто используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцирует метиленовый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску.

Критерием состояния яйца является окрашивание зародыша, но не оболочки. Такая его способность связана с условиями гибели яйца. В тех случаях, когда волокнистая оболочка в мертвом яйце не теряет свойств полупроницаемости, она не будет пропускать красители, следовательно, мертвый зародыш не будет окрашиваться. Окрашенный зародыш всегда свидетельствует о гибели яйца.

Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый синий в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты - 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают; окрашиваются в синий цвет зародыши мертвых яиц. Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10000 осуществляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жидкости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Препарат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному стеклу при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости; после чего этот же препарат просматривают повторно через 2 - 3 часа. Живыми считаются только недеформированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 часов. Мертвые личинки или не выходят из яиц, или окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полностью).

При определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц возможна окраска препаратов 5%-ным спиртовым раствором йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аскаридий в течение 1 - 3 сек. окрашиваются в оранжевый цвет.

Мертвые яйца описторхисов и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раствором толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня - раствором бриллианткрезилового синего (1:10000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают их сафранином (в разведении 1:10000 спирта 10 °С). Спирт удаляет краску с оболочек, а сафранин окрашивает в красный цвет. В результате живые яйца окрашиваются в красный цвет; яйца с мертвыми зародышами - в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко-красный или розовый цвет сафранином или в синий цвет бриллианткрезиловым синим в разведении 1:4000, или индигокармином в разведении 1:1000 - 1:2000. Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2 - 7 часов.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня рекомендуется использовать следующие краски:

1. Бриллианткреазиловый синий (1:8000) - через 1 час у мертвых яиц особенно ярко окрашивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бесцветном фоне остальной части яйца.

2. Сафранин (1:8000 при воздействии в течение 2 часов и 1:5000 - в течение 3 - 5 часов).

3. 50%-ный раствор пирогалловой кислоты в разведении 1:2 - при воздействии в течение 1 часа при температуре 29 - 30 °С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).

Люминесцентная микроскопия дает возможность дифференцировать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюоресценции используются не ультрафиолетовые лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стеклами; к осветителю ОИ-18 добавляют специальный набор цветных фильтров.

Живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гельминтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин, ауролин, сульфат берлерина, трипафлавин, риванол, акрихин и др.).

Неокрашенные, живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц оболочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая часть; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболочка, а у мертвых - и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.

Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет, у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы.

При вторичной люминесценции (при окраске акридин оранжевым в разведении 1:10000 и 1:50000 от 30 минут до 2 часов) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.

Скорлупа живых и мертвых яиц аскарид, токсокар, остриц, карликовых цепней, крысиных цепней, бычьего цепня, лентецов окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых яиц аскарид, токсаскарисов, крысиного цепня, широкого лентеца и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши яиц этих гельминтов излучают "горящий" оранжево-красный цвет. Живые личинки остриц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают тусклый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в "горящий" светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, в ярко-оранжевый.

При окраске флюорохромами - корифосфилом, примулином у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от лилово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет.

Живые яйца трематод (парагонимусов и клонорхисов) не люминесцируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый цвет.

Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки стронгилят, рабдитат светятся: живые - зеленым (с оттенком), мертвые - ярко-оранжевым светом.

Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресничек, но спустя 10 - 15 минут после гибели проявляются ярким "горящим" светло-зеленым, а затем - оранжево-красным светом.

Биологическая проба - определение жизнеспособности инвазионных яиц гельминтов посредством их скармливания лабораторным животным. Это наиболее точный метод. Личинками гельминта заражают соответствующего промежуточного или окончательного хозяина, можно использовать также лабораторных животных, которым скармливают зрелые яйца или личинки паразитов.

Например, для определения жизнеспособности яиц аскаридат (аскариды свиные, человека, токсокары, токсаскарис и др.) на одно животное (морские свинки, мыши) необходимо не менее 100 - 300 яиц с развившейся личинкой. Яйца аскаридат в изотоническом растворе натрия хлорида вводят пипеткой через рот мыши или морской свинки. Через 6 - 7 суток животное забивают, вскрывают и исследуют его печень и легкие в отдельности на наличие личинок аскаридат. Для этого печень и легкие измельчают ножницами на мелкие кусочки и исследуют их по методу Бермана или Супряги (раздел 6.1.2).

Если животных заражали живыми инвазионными яйцами, то при вскрытии в печени и легких обнаруживают мигрирующие личинки аскаридат.

Для определения жизнеспособности адолескариев фасциол, собранных на растениях в биотопах малого прудовика - промежуточного хозяина паразита, используют мышей, морских свинок или кроликов, которым скармливают эти личинки или вводят их пипеткой через рот.

В случае заражения яйца фасциол в фекалиях лабораторных животных можно обнаружить у кроликов через 2 месяца, у морских свинок - через 50 суток, у мышей - через 35 - 40 суток.

Для более быстрого получения ответа лабораторных животных вскрывают через 20 - 30 суток и исследуют печень на наличие молодых фасциол.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня также рекомендуется их скармливание незараженным ими ранее белым мышам с последующим вскрытием животных через 92 - 96 часов и выявлением цистицеркоидов в кишечных ворсинках или цестод в просвете кишечника.

Для определения жизнеспособности яиц описторхисов рекомендуется метод (Герман С.М., Бэер С.А., 1984), основанный на физико-химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки, что приводит к открыванию крышечки яйца и активному выходу мирацидия в экспериментальных условиях.

Взвесь яиц описторхисов в воде предварительно охлаждают до 10 - 12 °С (все последующие операции осуществляют при комнатной температуре 19 - 20 °С). В центрифужную пробирку вносят 1 каплю взвеси, содержащую 100 - 150 яиц. Пробирку ставят в штатив на 5 - 10 минут. За это время все яйца успевают опуститься на дно. Затем полоской фильтровальной бумагой осторожно отсасывают излишек воды и в пробирку добавляют 2 капли специальной среды. Среду готовят на 0,005 М Трис-HCl буфере; в буфер добавляют 12 - 13%-ный раствор этанола и краситель (фуксин, сафранин, эозин, метиленовый синий и т.д.). Пробирку встряхивают, ее содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 10 минут, слегка покачивая. Затем добавляют 2 капли указанной среды. Препарат готов для микроскопирования под обычным световым микроскопом при 20-кратном увеличении.

За это время у жизнеспособных личинок открывается крышечка, и мирацидий активно выходит в указанную среду. Благодаря наличию в ней этанола, они через 2 - 5 минут обездвиживаются и затем окрашиваются с помощью красителя. Их легко можно обнаружить и посчитать при микроскопировании.

Читайте также: