FISH-анализ хромосом. Особенности

Добавил пользователь Алексей Ф.
Обновлено: 14.12.2024

CGH - еще более совершенная, по сравнению с FISH, методика молекулярной биологии, позволяющая выявлять (или, наоборот, исключать) хромосомные аномалии или нарушения парности хромосом в клетках эмбриона, полученного методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). В нынешних условиях это одна из наиболее перспективных методик преимплантационной диагностики, преодолевающая определенную ограниченность флюоресцирующей гибридизации in-situ (FISH).

Методика FISH подразумевает последовательное проведение нескольких гибридизаций (объединений молекулярных цепей нуклеиновой кислоты в единую молекулу) для исследования отдельных пар хромосом. После двух-трех гибридизаций, позволяющих проанализировать состояние немногим больше половины общего хромосомного набора, генетический материал становится непригодным для дальнейших исследований.

Где FISH «тормозит», там CGH идет дальше

CGH - это «сравнительная геномная гибридизация» (Comparative Genomic Hybridisation), осуществляемая, так сказать, одноразово. Гибридизируются не разрозненные цепи ДНК (или РНК), а полная структура обследуемой ДНК. Ее гибридизируют с аналогичной структурой, взятой в качестве контрольного образца.

Как и во время анализов, выполняемых по методике FISH, сравниваемые объекты флюоресцируют разными цветами, поскольку они помечены светящимися красителями. Но если при FISH приходится применять до семи различных красителей, чтобы помечать различные фрагменты ДНК, то здесь достаточно двух цветов: один для исследуемой ДНК, другой для контрольной.

Array-анализ

Участки некомплементарности (нарушенных соединений при гибридизации) хорошо поддаются сравнительному графическому анализу. Этот анализ проводит компьютер по программе обработки большого массива данных, состоящего из однотипных компонентов. Число компонентов, заложенных в массив данных, действительно ограниченное (совпадение или расхождение двух цветов на различных участках молекулярной структуры, оцифрованной компьютером в виде графика). Это так называемый array-анализ, хорошо знакомый специалистам в области информатики. А саму методику с применением такого анализа называют Array-CGH. Участки комплементарности (взаимного соответствия) и некомплементарности сравниваются как совпадения и и несовпадения между участками стандартного поля и ассоциативного массива.

На основе компьютерного анализа выявляются нарушения парности хромосом или различные аномалии: делеции (потери участка хромосом), амплификации (удвоение определенного участка хромосом, содержащее копии его генов), транслокации (перенос участка хромосом) и другие мутации.

Что дает анализ?

Выявление этих мутаций позволяет судить о жизнеспособности эмбриона, перспективах протекания (или непроизвольного прерывания) беременности, состоянии здоровья младенца, когда он родится на свет.

Исследование половых признаков набора хромосом позволяет, как и при методике FISH, «заранее» определить пол эмбриона, когда он еще даже не имплантирован в матку - то есть до фактического наступления беременности.

Исследования тоже выполняются in-situ, «у себя дома», без извлечения (и сопутствующего риска повреждения) хромосом из ядер клеток, взятых у эмбриона. Годятся все типы клеток, получаемые методом микробиологической биопсии на разных этапах развития эмбриона: полярные тельца из оплодотворяемых яйцеклеток, бластомеры из восьмиклеточной «ступени», которой эмбрион достигает на третий-четвертый день после оплодотворения, или клетки трофэктодермы - внешнего слоя бластоцисты (следующего этапа развития эмбриона).

Сегодня CGH стала основной методикой преимплантационного генетического скрининга (PGS, ПГС).

FISH-анализ хромосом. Особенности

Современный метод цитогенетического анализа, позволяющий определять качественные и количественные изменения хромосом (в том числе транслокации и микроделеции) и используемый для дифференциальной диагностики злокачественных заболеваний крови и солидных опухолей.

Синонимы русские

Флуоресцентная гибридизация in situ

Синонимы английские

Fluorescence in-situ hybridization

Метод исследования

Флуоресцентная гибридизация in situ.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Образец ткани, образец ткани в парафиновом блоке.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH, от англ. fluorescence in-situ hybridization) - это один из самых современных методов диагностики хромосомных аномалий. Он основан на использовании ДНК-проб, меченных флуоресцентной меткой. ДНК-пробы представляют собой специально синтезированные фрагменты ДНК, последовательность которых комплементарна последовательности ДНК исследуемых аберрантных хромосом. Таким образом, ДНК-пробы различаются по составу: для определения разных хромосомных аномалий используются разные, специфические ДНК-пробы. ДНК-пробы также различаются по размеру: одни могут быть направлены к целой хромосоме, другие - к конкретному локусу.

В ходе процесса гибридизации при наличии в исследуемом образце аберрантных хромосом происходит их связывание с ДНК-пробой, которое при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как флуоресцентный сигнал (положительный результат FISH-теста). При отсутствии аберрантных хромосом несвязанные ДНК-пробы в ходе реакции "отмываются", что при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как отсутствие флуоресцентного сигнала (отрицательный результат FISH-теста). Метод позволяет оценить не только наличие флуоресцентного сигнала, но и его интенсивность и локализацию. Таким образом, FISH-тест - это не только качественный, но и количественный метод.

FISH-тест обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами цитогенетики. В первую очередь, исследование FISH может быть применено как к метафазным, так и к интерфазным ядрам, то есть к неделящимся клеткам. Это основное преимущество FISH по сравнению с классическими способами кариотипирования (например, окрашиванием хромосом по Романовскому-Гимзе), которые применяются только к метафазным ядрам. Благодаря этому исследование FISH является более точным методом для определения хромосомных аномалий в тканях с низкой пролиферативной активностью, в том числе в солидных опухолях.

Так как в FISH-тесте используется стабильная ДНК интерфазных ядер, для исследования могут быть использованы самые различные биоматериалы - аспираты тонкоугольной аспирационной биопсии, мазки, аспираты костного мозга, биоптаты и, что немаловажно, сохраненные фрагменты ткани, например гистологические блоки. Так, например, FISH-тест может быть с успехом выполнен на повторных препаратах, полученных из гистологического блока биоптата молочной железы при подтверждении диагноза "аденокарцинома молочной железы" и необходимости определения HER2/neu-статуса опухоли. Следует особо подчеркнуть, что в данный момент исследование FISH рекомендовано в качестве подтверждающего теста при получении неопределенного результата иммуногистохимического исследования опухоли на онкомаркер HER2/neu(ИГХ 2+).

Другим преимуществом FISH является его способность определять микроделеции, которые не выявляются с помощью классического кариотипирования или ПЦР. Это имеет особое значение при подозрении на синдром Ди Джорджи и велокардиофациальный синдром.

FISH-тест широко используется в дифференциальной диагностике злокачественных заболеваний, в первую очередь в онкогематологии. Хромосомные аномалии в сочетании с клинической картиной и данными иммуногистохимического исследования являются основой классификации, определения тактики лечения и прогноза лимфо- и миелопролиферативнх заболеваний. Классическими примерами являются хронический миелолейкоз - t (9;22), острый промиелоцитарный лейкоз - t (15;17), хронический лимфолейкоз - трисомия 12 и другие. Что касается солидных опухолей, наиболее часто FISH-исследование применяется при диагностике рака молочной железы, мочевого пузыря, толстой кишки, нейробластомы, ретинобластомы и других.

Исследование FISH также может быть использовано в пренатальной и преимплантационной диагностике.

FISH-тест часто проводят в сочетании с другими методами молекулярной и цитогенетической диагностики. Результат этого исследования оценивают в комплексе с результатами дополнительных лабораторных и инструментальных данных.

Исследование должно выявить отклонения структуры строения и числа хромосом, которые могут стать причиной бесплодия или наследственных болезней у будущего ребенка

Анализ кариотипа

Исследуемый материал: Венозная кровь 2 мл в пробирке с литием и гепарином.

Подготовка к исследованию: В течение месяца до исследования кариотипа следует воздержаться от приема антибиотиков. На момент забора крови должно пройти не менее двух недель после перенесенных простудных заболеваний. При себе необходимо иметь направление.

Забор/прием материала: В часы работы лаборатории.

Анализ кариотипа позволяет ответить на следующие вопросы:

Страдает ли ребенок наследственными заболеваниями?
Имеются ли врожденные пороки развития, задержка физического, моторного или психоречевого развития, поведенческие аномалии, расстройства аутистического спектра?

Каков прогноз для будущих детей?
Где и какие анализы нужно сдать для подтверждения диагноза?
Скрининговый тест показал высокий риск синдрома Дауна у плода. Что это значит?

Анализ кариотипа
на генетическое заболевание
Показания для
кариотипирования
Дополнительная
информация

Все живые организмы характеризуются уникальным набором хромосом, хранящим их наследственную информацию. Совокупность морфологических особенностей полного хромосомного набора,свойственную клеткам одного организма определенного вида, называют кариотипом. Нарушения в кариотипе приводят к генетическим заболеваниям и синдромам.

Исследование кариотипа - анализ числа, формы и размеров хромосом с использованием специального окрашивания. Метод исследования: световая микроскопия. Результатом кариотипирования является описание кариотипа в виде формулы с указанием общего числа хромосом, набора половых хромосом и хромосомных аберраций (перестроек) в случае их выявления.

Нарушения хромосомного набора могут быть причиной наследственной патологии, бесплодия, невынашивания беременности, рождения ребенка с различными пороками развития.

В норме кариотип человека содержит 46 хромосом: 22 пары аутосом и 1 пару половых хромосом (гоносомы). Нормальный мужской кариотип - 46,XY; нормальный женский - 46,XX. Другие варианты указываются в заключении в соответствии с международной цитогенетической номенклатурой и могут потребовать консультации врача-генетика.

Нормальный женский кариотип - 46,XX

Нормальный мужской кариотип - 46,XY

Показания для детей:

Множественные врожденные пороки развития, сопровождаемые клинически анормальным фенотипом или дизморфизмом.
Умственная отсталость или другие нарушения развития.
Нарушение половой дифференцировки или аномалии полового развития.

Задержка психомоторного развития.
Выраженные отклонения в росте (низкий, высокий) и размере головы (микроцефалия, макроцефалия).
Наличие родственников с хромосомными перестройками, умственной отсталостью, врожденными пороками развития или репродуктивными потерями.

В настоящее время анализ кариотипа часто используется для выявления хромосомной патологии в пренатальной и постнатальной диагностике. Аномалии кариотипа могут быть обусловлены изменениями как числа хромосом, так и их структуры.

С помощью стандартного кариотипирования легко детектируются количественные хромосомными перестройки. Наиболее часто встречающиеся синдромы представлены в таблице.

Структурные аномалии хромосом - разрывы хромосом с последующим соединением в аномальной комбинации. К сожалению, с помощью стандартного кариотипирования можно определить лишь большие структурные аномалии, от 5-7 миллионов пар нуклеотидов.

В большинстве случаев структурные аномалии хромосом представляют собой микроделеции и микродупликации, невидимые под микроскопом.

Однако такие изменения хорошо идентифицируются современными молекулярными цитогенетическими методами - флуоресцентной гибридизацией (FISH)
и хромосомным микроматричным анализом

Показания для супружеских пар:

Аномалии спермограммы - азооспермия или выраженная олигозооспермия.
Первичная, вторичная аменорея или ранняя менопауза.
Бесплодие неясной этиологии.
Привычное невынашивание (самопроизвольные выкидыши, два и более).

Родители пациента со структурными хромосомными аномалиями.
Повторное рождение детей с хромосомными аномалиями.
Планирование ЭКО и неудачные попытки ЭКО.
Хромосомные аномалии у плода, обнаруженными при пренатальной диагностике.
Прогноз здоровья для будущего потомства.

Кариотипирование делается для того, чтобы:

Определить причину врожденных дефектов или болезни ребенка.
Выяснить, являются ли хромосомы у взрослого человека аномальными, как это влияет на его здоровье и как может повлиять на здоровье его будущего ребенка.
Определить, является ли дефект хромосомы причиной бесплодия женщины или причиной выкидыша.
Обнаружить присутствие аномальных хромосом у плода.
Определить, являются ли хромосомные перестройки причиной внутриутробной гибели плода.

Виды анализа кариотипа

Аномальные кариотипы и хромосомные болезни

Нормальные кариотипы человека — 46,XX (женский) и 46,XY (мужской). Нарушения нормального кариотипа у человека возникают на ранних стадиях развития организма: в случае, если такое нарушение возникает при гаметогенезе, в котором продуцируются половые клетки родителей, кариотип зиготы, образовавшейся при их слиянии, также оказывается нарушенным. При дальнейшем делении зиготы все клетки эмбриона и развившегося из него организма обладают одинаковым аномальным кариотипом.

Однако нарушения кариотипа могут возникнуть и на ранних стадиях дробления зиготы, развившийся из такой зиготы организм содержит несколько линий клеток (клеточных клонов) с различными кариотипами. Такая множественность кариотипов всего организма или его отдельных органов называется мозаицизмом.

Как правило, нарушения кариотипа у человека сопровождаются множественными пороками развития; большинство таких аномалий несовместимы с жизнью и приводят к самопроизвольным абортам на ранних стадиях беременности. Однако некоторое количество плодов (~2.5 %) с аномальными кариотипами донашивается до окончания беременности.

Молекулярное кариотипирование, известное так же как хромосомный микроматричный анализ или сравнительная геномная гибридизация (CGH) на чипах, является революционным методом исследования генома.

Метод был разработан для выявления аномалий ДНК, известных как вариации числа копий генов, не обнаруживаемых другими традиционными цитогенетическими методами, такими, например, как стандартное кариотипирование или флуоресцентная гибридизация in situ (FISH).

Вариации числа копий генов — это потеря геномных участков (делеции) или присутствие дополнительных копий сегментов ДНК (дупликаций/амплификаций). Аномалии ДНК могут вызвать различные заболевания, такие как множественные врожденные пороки развития, умственную отсталость, аутизм, эпилепсию и рак.

Использование молекулярного кариотипирования позволяет обнаружить те структурные несбалансированные хромосомные перестройки, которые не определяются методами классической цитогенетики.

Хромосомный микроматричный анализ всего генома обеспечивает более высокое разрешение (в 100-1000 раз) по сравнению с другими генетическими исследованиями, такими как анализ кариотипа. Метод является ценным инструментом для обнаружения вариаций числа копий генов небольшого размера (даже несколько сотен пар оснований).

Это позволяет обнаруживать как известные, так и новые микроделеционные и микродупликационные синдромы. Кроме того, метод позволяет точно определить гены, которые находятся в области перестройки, и выяснить связь между этими генами и заболеванием.

Молекулярное кариотипирование используется для постнатальной диагностики сложных фенотипов, связанных с умственной отсталостью, множественными врожденными пороками развития. Также используется в качестве диагностического метода в пренатальной диагностике.

В настоящее время молекулярное кариотипирование, основанное на технологии хромосомного микроматричного анализа, представляет собой важный инструмент в поисках правильного диагноза множества генетических заболеваний.

Результаты кариотипирования готовы, как правило, через
одну-две недели и могут выглядеть следующим образом:

Есть 46 хромосом, которые могут быть сгруппированы как 22 парные и 1 пара половых хромосом.
Размер, форма и структура нормальные для каждой хромосомы. Такой кариотип обозначается как 46XX (для женщин) и 46XY (для мужчин).

Есть больше или меньше, чем 46 хромосом.
Формы и размеры одной или нескольких хромосом является ненормальными.
Пары хромосом могут быть нарушены или неправильно сгруппированы.

Что еще нужно знать?

Не рекомендуется сдавать данный тест натощак. За месяц до исследования надо воздержаться от приема антибиотиков, за три дня — исключить прием алкоголя. На момент забора крови должно пройти не менее двух недель после перенесенных простудных заболеваний.

Как это делается

Для процедуры определения кариотипа могут быть использованы любые популяции делящихся клеток. Для определения человеческого кариотипа используется либо одноядерные лейкоциты, извлеченные из пробы крови, деление которых провоцируется добавлением митогенов либо культуры клеток, интенсивно делящихся в норме (фибробласты кожи, клетки костного мозга). Обогащение популяции клеточной культуры производится остановкой деления клеток на стадии метафазы митоза добавлением колхицина — алкалоида, блокирующего образование микротрубочек и «растягивание» хромосом к полюсам деления клетки и препятствующего тем самым завершению митоза.

Полученные клетки в стадии метафазы фиксируются, окрашиваются и фотографируются под микроскопом; из набора получившихся фотографий формируется систематизированный кариотип — нумерованный набор пар гомологичных хромосом (аутосом). Изображения хромосом при этом ориентируются вертикально короткими плечами вверх, их нумерация производится в порядке убывания размеров, пара половых хромосом помещается в конец набора.

Исторически первые недетализованные кариотипы, позволявшие проводить классификацию по морфологии хромосом, получались окраской по Романовскому—Гимзе, однако дальнейшая детализация структуры хромосом в кариотипах стала возможной с появлением методик их дифференциального окрашивания. Классический и спектральный кариотипы

Классический и спектральный кариотипы

Для получения классического кариотипа используется окраска хромосом различными красителями или их смесями: в силу различий в связывании красителя с различными участками хромосом окрашивание происходит неравномерно и образуется характерная полосчатая структура (комплекс поперечных меток, англ. banding), отражающая линейную неоднородность хромосомы и специфичная для гомологичных пар хромосом и их участков (за исключением полиморфных районов локализуются различные аллельные варианты генов). Первый метод окраски, позволяющий получить такие высокодетализированные изображения, был разработан шведским цитологом Касперссоном. Используются и другие красители. Такие методики получили общее название дифференциального окрашивания хромосом: Q-окрашивание — окрашивание по Касперссону акрихин-ипритом с исследованием под флуоресцентным микроскопом. Чаще всего применяется для исследования Y-хромосом (быстрое определения генетического пола, выявление транслокаций между X- и Y-хромосомами или между Y-хромосомой и аутосомами, скрининг мозаицизма с участием Y-хромосом)

G-окрашивание — модифицированное окрашивание по Романовскому—Гимзе. Чувствительность выше, чем у Q-окрашивания, поэтому используется как стандартный метод цитогенетического анализа. Применяется при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, нежели нормальные гомологичные хромосомы).

R-окрашивание — используется акридиновый оранжевый и подобные красители, при этом окрашиваются участки хромосом, нечувствительные к G-окрашиванию. Используется для выявления деталей гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом.

C-окрашивание — применяется для анализа центромерных районов хромосом, содержащих конститутивный гетерохроматин, и вариабельной дистальной части Y-хромосомы.

T-окрашивание — применяют для анализа теломерных районов хромосом.

Анализ кариотипов

Сравнение комплексов поперечных меток в классической кариотипии или участков со специфичными спектральными характеристиками позволяет идентифицировать как гомологичные хромосомы, так и их отдельные участки, что позволяет детально определять хромосомные аберрации — внутри- и межхромосомные перестройки, сопровождающиеся нарушением порядка фрагментов хромосом (делеции, дупликации, инверсии, транслокации). Такой анализ имеет большое значение в медицинской практике, позволяя диагностировать ряд хромосомных заболеваний, вызванных как грубыми нарушениями кариотипов (нарушением числа хромосом), так и нарушением хромосомной структуры или множественностью клеточных кариотипов в организме (мозаицизмом).

О чем следует подумать

Исследование обычно проводится по назначению врача-генетика. В зависимости от симптомов заболевания может быть назначен один из видов анализа кариотипа.

Стандартное кариотипирование, несмотря на его невысокую стоимость, в настоящее время назначается в редких случаях, т.к. исследование не выявляет большей части хромосомных патологий.

Молекулярное кариотипирование обладает высокой разрешающей способностью. В зависимости от специфики заболевания может быть назначен один из видов молекулярного каритоипирования.

Таргетное молекулярное кариотипирование назначается для подтверждения диагноза. Изменения — делеции и дупликации, выявляются в случае, если необходимый ген имеется на микроматрице.

Стандарное молекулярное кариотипирование назначается в случае признаков генетического заболевания или врожденных пороков развития, когда врач затрудняется в определении конкретного синдрома. При одном исследовании можно определить наличие любого из всех возможных микроделеционных синдромов, которые являются причиной нескольких сотен заболеваний.

Расширенное молекулярное кариотипирование назначается в случае, когда необходимо выявить структурные нарушения на уровне отдельных генов и их участков. Это может быть полезно для диагностики не только микроделеционных/микродупликационных синдромов, но и моногенных заболеваний.

Молекулярное кариотипирование не выявляет всей генетической патологии. Если хромосомных изменений не обнаружено, могут потребоваться и другие виды исследований — например, секвенирование экзома.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) - новейший молекулярно-цитогенетический метод исследования, в процессе которого детектируется наличие и локализация специфических ДНК-последовательностей на хромосомах. В данном исследовании, основанном на методе FISH, выявляются генетические аберрации, характерные для следующих онкогематологических заболеваний: хронический лимфолейкоз, MALT-лимфома и лимфома Беркитта.

Флуоресцентная гибридизация in situ, молекулярная диагностика онкогематологических заболеваний, хронический лимфолейкоз, лимфома Беркитта, лимфопролиферативные заболевания.

Синонимы английские

Analysis of all specific aberrations on paraffin slides (FISH Histology, quantitative), Lymphoproliferative disorders, Chronic lymphocytic leukemia (CLL), MALT lymphoma, Burkitt's lymphoma.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

Образец ткани в парафиновом блоке

Специальной подготовки не требуется. Для исследования используется уже предварительно подготовленный биологический материал (парафиновый блок с образцом биоматериала).

Преимущества исследования

Является чувствительным методом для идентификации хромосомных аберраций при количествах лейкозных клеток менее 10 9 , обеспечивая при этом быстрый анализ большого (>500) числа клеток. Метод обладает высокой точностью для идентификации неизвестных фрагментов хромосомной ДНК.
Для исследования могут быть использованы различные биоматериалы - аспираты тонкоугольной аспирационной биопсии, костного мозга, мазки крови, биоптаты, полученные на различных стадиях заболевания;
Исследование FISH может быть применено как к метафазным, так и к интерфазным ядрам, то есть к неделящимся клеткам;
Позволяет определить даже самые небольшие генетические аномалии, которые нельзя рассмотреть при помощи обычного микроскопа, при использовании соответствующих ДНК-зондов.

Анализ с помощью флюоресцентной in situ гибридизации (fluorescence in situ hybridization, FISH) - молекулярно‐цитогенетический метод для идентификации генетических аберраций (отклонений от нормы). Изначально данный метод использовался как исследовательский для выявления наличия или отсутствия специфической ДНК последовательности в хромосомах, но благодаря прогностической и предсказательной ценности был внедрен в клиническую практику.

Метод основан на использовании флуоресцентно меченых ДНК-зондов, которые представляют собой искусственно синтезированные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), последовательность которых комплементарна последовательности ДНК исследуемых аберрантных хромосом. ДНК-зонды различаются по специфичности: для каждой хромосомной аномалии используются свои ДНК-зонды. Также зонды различаются по размеру: одни могут быть направлены к целой хромосоме, другие - к конкретному локусу (фрагменту хромосомы или гена).

После специальной процедуры - денатурации - молекула ДНК приобретает вид одноцепочечной нити. ДНК-зонд гибридизуется (связывается) с комплементарной ему нуклеотидной последовательностью и может быть обнаружен при помощи флуоресцентного микроскопа. Данное состояние интерпретируется как положительный результат FISH-теста. При отсутствии аберрантных хромосом несвязанные ДНК-зонды в ходе реакции "отмываются", что при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как отсутствие флуоресцентного сигнала (отрицательный результат FISH-теста). Метод позволяет оценить не только наличие флуоресцентного сигнала, но и его интенсивность и локализацию. Таким образом, FISH-тест - это еще и количественный метод.

FISH имеет широкие возможности в клинической онкологии для обнаружения хромосомных аномалий в опухолевых клетках. Метод позволяет исследовать генетический состав клетки, как во время митоза, так и в интерфазе. FISH имеет высокую чувствительность - позволяет обнаружить индивидуальные гены, кроме того, в одном препарате могут быть использованы несколько зондов с различными красителями.

FISH-анализ широко применяется при лимфопролиферативных заболеваниях, являясь в ряде случаев определяющим фактором для подтверждения диагноза.

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) - самый частый вид лейкозов у взрослых. Характеризуется пролиферацией и увеличением в периферической крови количества морфологически зрелых лимфоцитов на фоне лимфоцитарной инфильтрации костного мозга, лимфатических узлов, селезенки и других органов. Клеточный субстрат хронического лимфолейкоза представлен чаще В-популяцией (около 30 %) и значительно реже - Т-лимфоцитами (около 70 %). В-лимфоциты при ХЛЛ не развиваются до плазматических клеток вследствие изменений в клеточном геноме. Это ведет к резкому уменьшению выработки иммуноглобулинов, к которым относятся все антитела. Заболевание чаще возникает у лиц старше 65 лет, у 10-15 % больных в возрасте чуть старше 50 лет. До 40 лет хронический лимфолейкоз возникает крайне редко. Мужчины болеют примерно в 2 раза чаще, чем женщины.

Симптомы обычно развиваются медленно, чаще выявляется случайно при обследовании по поводу других причин. При ХЛЛ наблюдаются следующие симптомы: кровоподтеки (если тромбоциты снижены), увеличение лимфатических узлов, печени или селезенка, чрезмерное потоотделение, ночная потливость, усталость, лихорадка, реинфекции, потеря аппетита, потеря веса.

Лимфома маргинальной зоны, ассоциированная со слизистыми (MALT, mucosa-associated lymphoid tissue) является третьим по распространенности подтипом неходжкинской лимфомы и составляет ~ 7 % всех неходжкинских лимфом. Средний возраст, характерный для выявления MALT-лимфомы - 61 год. Это одна из немногих неходжкинских лимфом, которая чаще поражает женщин (соотношение 1,1:1).

Показано, что приблизительно 90 % случаев МАLT-лимфом желудка связано с инфицированием H. рylori. У 70-80 % больных под влиянием эрадикационной (антихеликобактерной) терапии наблюдается регрессия MALT- лимфомы. Дифференциальная диагностику проводят с H. pylori-ассоциированным гастритом.

Лимфома Беркитта - агрессивная форма неходжкинской лимфомы. Развивается из В-лимфоцитов, характерна экстранодальная локализация опухоли, имеет склонность прорастать и распространяться за пределами лимфатической системы - в процесс вовлекается спинномозговая жидкость, кровь и костный мозг. Этиология до сих пор не выявлена. Одним из провоцирующих факторов считается длительная персистенция вируса Эпштейна-Барр в организме. Наиболее часто поражаются органы брюшной полости: тонкая кишка (чаще ее терминальный отдел), брыжейка, а также желудок, толстая кишка, брюшина, печень, селезенка. Специфическое поражение костного мозга наблюдается в 25-35 % случаев, центральной нервной системы - в 20-25 % случаев. Типично вовлечение почек, яичников, яичек, абдоминальных и забрюшинных лимфатических узлов, реже периферических лимфатических узлов. Чаще развивается у детей (в 30-50 % случаев), подростков и молодых людей (средний возраст 20-25 лет). Выделяют три основных типа лимфомы Беркитта:

Африканский тип (эндемическая) - встречается в основном в Африке. Установлена связь африканского типа лимфомы с инфекцией вирусом Эпштейна-Барра.
Европейский тип (спорадическая) - встречается во всем мире, поражает в основном детей и молодежь. Чаще всего опухоль образуется в кишечнике.
Лимфома Беркитта, связанная с иммунодефицитом - встречается у пациентов с ослабленным иммунитетом, прежде всего у больных СПИДом и у людей после трансплантации органов, которые принимают иммуносупрессоры.

Симптомы варьируются в зависимости от типа: лихорадка, потеря веса, вздутие живота, искажение лицевых костей, ночная потливость, кишечная непроходимость, увеличенная щитовидная железа, увеличенные миндалины.

Для чего используется исследование?

Для уточнения диагноза при подозрении на злокачественное заболевание крови, в том числе при Ph-отрицательных комплексных кариотипах, когда присутствует ген BCR/ABL, определяемый только методом FISH;
Для повторного консультирования при подозрении на наличие злокачественного заболевания крови;
Для выбора тактики лечения и прогноза заболевания, которые зависят от хромосомного состава опухоли;
Чтобы определить наличие или отсутствие конкретной хромосомной аберрации.

Когда назначается исследование?

При подозрении на наличие злокачественного заболевания крови, для выбора тактики лечения и оценки прогноза, который зависит от хромосомного состава опухоли.
Для подтверждения диагноза при наличии клинических предпосылок: клиническая картина заболевания, изменения гемограммы, наличие специфических синдромов - гиперпластический, геморрагический, анемический и др.);
Для контроля "минимальной остаточной болезни" после химиотерапии или пересадки костного мозга.

Что означают результаты?

Отсутствие аберрантных хромосом в исследуемом образце

Хромосомные аномалии, характерные для лимфопролиферативных заболеваний:

перестройки гена ATM;
трисомия 12 хромосомы (+12);
моносомия, делеция 13 хромосомы -(del(13),-13);
делеция ТР53 гена.

Прогностически значимыми являются следующие аберрации: делеция длинного плеча хромосомы 13 (13q-), трисомия 12 хромосомы, делеция длинного плеча хромосомы 11 (11q-). Делеция короткого плеча хромосомы 17 (17p-) является главным цитогенетическим маркером, непосредственно влияющим на терапевтическую тактику. Рекомендуется проводить скрининг на делецию 17p у всех пациентов, имеющих показания к началу терапии и/или при неэффективности стандартной терапии, особенно пациентам моложе 55 лет, которым может быть проведена аллогенная трансплантация.

транслокация t(11;18)(q21;q21).
транслокация t (14; 18) (q32; q21)

t(11;18) (q21;q21) - наиболее распространенная хромосомная транслокация, связанная с MALT-лимфомой, которую не отмечают при других вариантах лимфом. Транслокация t(11;18) ассоциируется с более агрессивным течением.

Второй наиболее частой транслокацией, идентифицированной с MALT-лимфомой, является t (14;18)(q32; q21).Приблизительно в 4 % MALT-лимфомы желудка и 8 % MALT-лимфомы легких выявляется t(1;14) (p22;q32).Характерным для MALT-лимфом является также нарушение нормальной активности важного супрессора опухоли - гена BCL10, что наблюдается при t(1;14)(p22;q32).

Важно отметить, что лимфомы MALT не несут транслокацию t (11; 14) (q13; q32), типичную для лимфомы мантийных клеток.

перестройки С-MYC гена (t(8;14)(q24;q32)t(2;8)(p11;q24)t(8;22)(q24;q11)).

Выявление цитогенетического маркера лимфомы Беркитта - перестройки локуса гена C-MYC и транслокации t(8,14)(q24,q32) или ее вариантов t(2,8)(pl2,q24) или t(8,22)(q24,q11) позволяет диагностировать лимфому Беркитта. Перестройки гена C-MYC выявляется в 100 % случаев лимфомы Беркитта и является одним из главных диагностических критериев этого заболевания. В 80 % случаев встречается t(8;14)(q24;q32) перестройка локусов генов c-myc (8q24) и тяжелых цепей иммуноглобулинов Ig (14q32).

Изменения кариотипа являются независимым прогностическим фактором. При выявлении аберрации (13q-) можно прогнозировать стабильное состояние или медленное течение болезни и благоприятный ответ на терапию, если она является единственной (медиана выживаемости - 11 лет), в то время как остальные аберрации, в особенности (11q- ) и (17p- ) крайне неблагоприятны в прогностическом отношении (медианы выживаемости больных с трисомией 12 - 9,5 лет, ( 11q-) - 6,5 лет, (17p- ) - меньше 3 лет.

Кто назначает исследование?

Также рекомендуется

Литература

1. Иммуногистохимические методы: Руководство / Ed. by George L. Kumar, Lars Rudbeck.: DAKO / Пер. с англ. под ред. Г.А.Франка и П.Г.Малькова. - М., 2011. - 224 с.

2. Wan TS, Ma ES. Molecular cytogenetics: an indispensable tool for cancer diagnosis. Chang Gung Med J. 2012. Mar-Apr: 35(2): 96-110. Review. PubMed PMID: 22537925.

3. Steven H. Swerdlow Diagnosis of ‘double hit’ diffuse large B-cell lymphoma and B-cell lymphoma, unclassifiable, with features intermediate between DLBCL and Burkitt lymphoma: when and how, FISH versus IHC. Hematology . December 5, 2014 vol. 2014 no. 1 90-99

4. E. Zucca & Dreyling. Минимальные клинические рекомендации ESMO по диагностике, лечению и наблюдению при MALT - лимфоме желудка. Москва. 2010г.

5. М. Ж. Алексанян, Е. А. Асеева, А. И. Удовиченко, Е. В. Домрачева. Цитогенетические исследования в гематологии. Организационные аспекты. Гематология и трансфузиология, 2012, т. 57, № 4. С.23 - 27.

6. Хронический лимфолейкоз у взрослых. Клинические рекомендации. Национальное гематологическое общество Российское профессиональное общество онкогематологов. 2016г.

7. И.А. Крячок, Е.О. Ульянченко, Т.В. Кадникова, И.Б. Титоренко и др. MALT-лимфома: причины возникновения, патогенез, классификация, клиническая картина. Клиническая онкология, № 1 (25), 2017.

Исследование хромосом методом FISH

FISH - один из удивительнейших «инструментов» молекулярной биологии XXI века. В преимплантационной диагностике исследовательская техника FISH применяется для выявления хромосомных аномалий или нарушений парности хромосом в клетках эмбриона, только что полученного методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Если аномалий или признаков анеуплоидии (нарушения парности, нехватки хромосомных пар) не обнаружено, то «искусственный» эмбрион признается жизнеспособным. Его можно имплантировать в матку будущей матери.

FISH позволяет также проследить половые признаки в наборе хромосом эмбриона. Это дает возможность определить пол будущего ребенка еще до фактического наступления беременности (если считать ее началом имплантацию внетелесно зачатого эмбриона в матку).

Что такое FISH?

Аббревиатура расшифровывается так: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, или флюоресцирующая гибридизация in-situ. Расшифровка, скорей всего, ничего не говорит несведущему читателю. Поэтому разберем сложное понятие по частям, оставив недопереведенное «in-situ» напоследок.

Гибридизация

В молекулярной биологии у этого термина совершенно особое значение, не имеющее ничего общего со скрещиванием видов в «обычной» биологии.

Гибридизация - это молекулярно-генетический прием, применяемый для оценки состояния ДНК и РНК исследуемых клеток. Он основан на соединении отдельных цепочек нуклеиновых кислот в единую молекулу. Таким образом проверяется комплементарность (взаимное соответствие) молекул или их фрагментов друг другу. При полной комплементарности цепочки легко и быстро объединяются в общую молекулу. Медленное объединение говорит о недостаточной комплементарности. Некомплементарность цепочек как раз и обусловлена хромосомными аномалиями (нарушениями порядка расположения хромосом на тех или иных участках), непарностью хромосом или отсутствием некоторых пар.

«Инструментом» для измерения комплементарности является температура, при которой цепочки ДНК гибридизируются в общую молекулу. Для этого требуется сначала нагреть препарат нуклеиновой кислоты, а затем, смешав его с другим нагретым препаратом, охладить. При нагреве водородные связи между цепочками ДНК или РНК исчезают, образуются одноцепочечные фрагменты молекул. Смешанные препараты двух ДНК или РНК (или ДНК - РНК) охлаждаются. При охлаждении водородные связи между комплементарными основаниями быстро восстанавливаются, образуется единая, гибридная молекула ДНК (РНК или ДНК - РНК). При недостатке комплементарности процесс идет дольше, некомплементарные фрагменты остаются неприсоединенными. Следовательно, чем выше температура гибридизации, тем гармоничней и правильней хромосомные строения клеток. Чем ниже температура, тем больше аномалий в хромосомах. На основе анализа некомплементарных остатков можно установить конкретные аномалии или участки анеуплоидии.

Флюоресцентная маркировка

Для анализа комплементарности гибридизирующей молекулы ДНК (или РНК) применяются особые генетические зонды (или ДНК-зонды), которые, конечно же, тоже имеют мало общего со своими «тезками», используемыми, например, в хирургии.

Генетические зонды это синтезированные и специально помеченные одноцепочечные ДНК (реже РНК) с заранее установленными свойствами комплементарности. При гибридизации они сливаются с определенными генетическими фрагментами, подтверждая таким образом их комплементарность. Расположение зондов в гибридизированной молекуле свидетельствует о нормальном или дефектном строении первоначального хромосомного материала, из которого собрано это «искусственное сооружение».

Генетические зонды помечают, в частности, светящимися (флюоресцирующими) веществами, что делает их заметными под объективом специального флюоресцентного микроскопа.

Применение различных красителей для нескольких зондов позволяет производить одновременный анализ различных генетических структур, например, выявлять участки хромосом с двумя наложенными друг на друга генами и прочие аномалии.

В настоящее время при проведении единого анализа генетические зонды метят пятью-шестью различными красителями, иногда даже семью.

In-situ значит «у себя дома»

Первоначальная техника гибридизации была громоздкой. Извлеченные ДНК денатурировались в особых термобуферах, смешивались в центрифуге с другими денатурированными фрагментами. Гибридизация также проводилась лабораторно, «в химической посуде».

Современная техника позволяет проводить анализы in-situ, то есть «на месте», «у себя дома», в первоначальных генетических структурах, а не в лабораторно изготовленных препаратах. Объектами исследования стали сами ядра клеток (извлеченных при биопсии полярных телец, бластомеров, поверхностных клеток бластоцисты).

Наблюдение за генетическим материалом прямо в ядрах клеток ускоряет процесс, делает его более «чистым», свободным от внешних влияний и повреждений, которые не исключены при изготовлении лабораторных препаратов.

Существуют, однако, и проблемы, указывающие на непреодолимые границы данного метода. Единой гибридизацией невозможно «охватить» весь набор хромосом в клетках. Необходимы обычно две-три последовательные гибридизации, позволяющие исследовать 12-15 хромосомных пар (а их у человека 23). Способность к дальнейшей гибридизации у цепочек ДНК после каждой их регибридизации постепенно снижается. Это не позволяет проводить гибридизацию «сколько угодно раз», для исчерпывающего анализа одного и того же генетического материала.

Читайте также: