Led микроскопия при туберкулезе

Федеральные клинические рекомендации по организации и проведению микробиологической и молекулярно-генетической диагностики туберкулеза

Основная цель этих рекомендаций – дать объективную основу для разработки пациент-ориентированной тактики противотуберкулезной помощи и оптимизации лечения пациентов: лечение пациентов должно предотвращать смертность, рецидивы, приобретение/амплификацию устойчивости к противотуберкулезным препаратам и распространение туберкулеза.

Основной целевой аудиторией рекомендаций являются клиницисты (фтизиатры), организаторы здравоохранения вместе с другими медицинскими работниками, занятыми лечением больных туберкулезом. Рекомендации направлены на получение данных для лечения активного туберкулеза у взрослых. Они не содержат многие смежные темы, которые описаны в других публикациях.

Рекомендации содержат отдельные положения по микробиологической и молекулярногенетической диагностике туберкулеза, влияющие на принятие решения в проведении необходимой и достаточной диагностики туберкулеза, выборе необходимого режима лечения, адекватного диагностированному случаю заболевания. Они не исключают дополнительных мер диагностики, уточняющих характеристику микроорганизма, пациента и дающих возможность применять более обосновано арсенал терапевтических мероприятий.

Упоминание тех или иных компаний или названий продуктов отдельных изготовителей не означает, что РОФ отдает им предпочтение по сравнению с другими компаниями или продуктами аналогичного характера, не упомянутыми в тексте.

Диагностика пациентов с подозрением на туберкулез органов дыхания. Среди лиц, подлежащих обследованию на туберкулез или микобактериоз, в соответствии с действующим Порядком оказания медицинской помощи больным туберкулезом в Российской Федерации, обследованию с целью диагностики туберкулеза органов дыхания подлежат пациенты, имеющие кашель с мокротой, или другие пациенты, при наличии соответствующей клинико-рентгенологической картины и после консультации фтизиатра, в том числе выявленные при диспансеризации по изменениям в рентгено/флюорограммах.

Диагностический материал. При туберкулезе легких, наиболее распространенной и эпидемически опасной форме заболевания, доступным и часто исследуемым диагностическим материалом является мокрота. При подозрении на другие формы туберкулез органов дыхания или при невозможности собрать мокроту у пациента с подозрением на туберкулез легких, могут исследоваться и другие виды диагностических материалов (промывные воды бронхов, аспирационный материал, бронхоальвеолярный лаваж, браш-биоптат, биоптат, экссудат и др.).

Исследования внелегочных диагностических материалов проводятся только с целью дифференциальной диагностики туберкулеза внелегочной локализации, при наличии показаний, по назначению фтизиатра и/или после консультации фтизиатра соответствующего профиля. Приоритетным является подтверждение/исключение наличия микобактерий туберкулезного комплекса (МБТК) в диагностическом материале методами с максимальной доступной чувствительностью и специфичностью. В связи с этим основными методами являются культуральные исследования на жидких и/или плотных средах и молекулярно-генетические методы (МГМ).

Приоритет исследования определяется лечащим врачом и зависит от клинической ситуации, информативности предыдущих исследований. Чтобы минимизировать вероятность расхождения в результатах, полученных разными методами, комплексное исследование должно проводиться из одной аликвоты клинического материала.

Методы микроскопии. Диагностическая чувствительность метода микроскопии обычно составляет не более 50% от всех больных туберкулезом легких, однако если говорить о наиболее инфекционно-опасных больных (у которых бактериовыделение подтверждено культуральным методом), диагностическая чувствительность метода микроскопии в этом случае достигает 90%.

Методы микроскопии не позволяют дифференцировать микобактерии туберкулеза от нетуберкулезных микобактерий и дают возможность выявлять кислотоустойчивые микроорганизмы (КУМ) только при наличии, по крайней мере, 5000-10000 бактериальных клеток в мл мокроты.

В настоящее время методы микроскопии, обладающие относительно невысокой чувствительностью, сохраняют, тем не менее, свою актуальность, так как позволяют быстро и с минимальными финансовыми затратами выявлять наиболее эпидемически значимых больных туберкулезом и оценивать массивность бактериовыделения.

Методы микроскопии в обязательном порядке включаются во все схемы обследования пациентов в связи с необходимостью определения статуса бактериовыделения согласно классификатору заболеваний и дальнейшему диспансерному наблюдению пациента или при необходимости его целевой госпитализации в специализированное отделение противотуберкулезных учреждений. Современные методы микроскопии требуют обучения персонала. Методы микроскопии настоятельно рекомендуется включать в алгоритм микробиологической диагностики туберкулеза.

Микроскопия с окраской по Цилю-Нильсену. Световая микроскопия препаратов с окраской по Цилю-Нильсену (Ц-Н), приготовленных непосредственно из нативных образцов мокроты или других диагностических материалов, доступна для лабораторий всех уровней. В бактериологических лабораториях (БЛ) медицинских организаций фтизиатрического профиля субъекта РФ данный метод является актуальным при необходимости экстренного (в течение 1 часа) выявления больных туберкулезом и микобактериозом на первичном этапе обследования до госпитализации с целью определения статуса бактериовыделения.

Идентификация выросших микроорганизмов микроскопией с окраской по Цилю-Нильсену. При получении роста культуры микроорганизмов на плотной и/или жидкой питательных средах необходимо провести ее идентификацию, а также исключить наличие контаминации посторонней микрофлорой. Метод окраски по Цилю-Нильсену может быть использован для идентификации выросших микроорганизмов при отсутствии возможности использования современных молекулярных методов.

Методы люминесцентной микроскопии в бактериологических лабораториях медицинских организаций фтизиатрического профиля субъекта РФ в качестве основного метода микроскопического исследования рекомендуется применять методы люминесцентной микроскопии, где в качестве источника излучения может использоваться ртутная лампа или светодиодный излучатель (LED).

Основное преимущество люминесцентной микроскопии перед микроскопией с окраской по Цилю-Нильсену состоит в экономии времени, затрачиваемого на просмотр препарата, за счёт использования меньших увеличений объектива и, соответственно, возможности просматривать большую площадь мазка в поле зрения. Диагностическая чувствительность микроскопии с окраской люминесцентными красителями в среднем на 10% выше, чем микроскопии с окраской по Цилю-Нильсену, однако метод люминесцентной микроскопии требует значительной технической компетенции, а также более высоких капиталовложений и расходов.

Светодиодная (LED) микроскопия. LED технология позволяет сделать микроскопию более доступным анализом за счет более низкой стоимости как самих микроскопов, так и их сервисного обслуживания. Оценка, проведенная ВОЗ, подтвердила диагностическую точность LED микроскопии по сравнению с традиционной люминесцентной микроскопией и большую эффективность LED по сравнению с микроскопией по Цилю-Нильсену. Поэтому можно рекомендовать заменять традиционную люминесцентную микроскопию LED микроскопией, которая в качестве альтернативы традиционной световой микроскопии по Цилю-Нильсену может применяться как в крупных, так и в небольших лабораториях.

В связи с тем, что светодиодные люминесцентные микроскопы не требуют высококвалифицированного технического обслуживания и имеют значительно больший срок службы ламп по сравнению с обычными моделями люминесцентных микроскопов, применение данного метода является оправданным с экономической точки зрения и позволяет широко распространить технологию люминесцентной микроскопии для диагностики туберкулеза. Метод светодиодной люминесцентной микроскопии (LED) может быть рекомендован к применению вместо традиционной микроскопии/

Культуральные методы. Культуральные методы диагностики (методы посева диагностического материала на питательные среды с последующей идентификацией выросших микроорганизмов) являются основными методами выделения микобактерий туберкулеза. Их специфичность превышает специфичность микроскопических методов, а предел обнаружения значительно выше: он позволяет выявить микобактерии (МБ) при наличии в 1 мл исследуемого диагностического материала нескольких сотен и даже десятков жизнеспособных микроорганизмов.

С помощью культурального метода удается выявить на 20-40% больше случаев туберкулезом с бактериовыделением по сравнению с методом микроскопии среди впервые выявленных больных. Культуральный метод позволяет выделить культуру возбудителя, необходимую для определения его видовой принадлежности и определения спектра и степени лекарственной устойчивости. Видовая идентификация выделенной культуры с помощью комплекса современных молекулярных методов позволяет сразу же дифференцировать микобактерии туберкулеза от нетуберкулезных микобактерий и неспецифической микрофлоры.

Культуральные исследования являются достаточно трудоемкими и требуют значительных капиталовложений, наличия помещений и материально-технической базы для приготовления питательных сред, обработки образцов и культивирования микроорганизмов, специализированного лабораторного оборудования и надлежащих условий, обеспечивающих биологическую безопасность. Кроме того, культуральная диагностика требует специализированного обучения персонала.

Медленный рост микобактерий туберкулеза требует значительного времени ожидания результатов исследования. В среднем, при посеве диагностического материала от впервые выявленных больных для получения результатов на плотных средах требуется 21-36 дней, на жидких средах – 12-22 дня. Методы культивирования на жидкой и плотной питательных средах могут осуществляться в бактериологических лабораториях разных уровней.

Культивирование на плотных питательных средах. Метод культивирования микобактерий на плотных средах является менее дорогостоящим, чем в системах культивирования на жидких средах, но получение роста микобактерий на плотных средах занимает гораздо более длительное время (до получения отрицательного результата – 12 недель), чем культивирование микобактерий на жидких средах (42-46 дней). Процесс приготовления плотных питательных сред (ППС) проводится в каждой бактериологической лаборатории самостоятельно и сложно поддается стандартизации.

Однако указанный метод позволяет получить культуру микобактерий для проведения её дальнейших исследований и может быть рекомендован для использования в бактериологической лаборатории на всех этапах диагностики и контроля химиотерапии. Метод культивирования на плотной питательной среде остаётся востребованным и рекомендуется к использованию в лабораторной практике для диагностики туберкулеза в комплексе с другими методами исследования/

Культивирование на жидкой питательной среде в автоматизированной системе учета роста микроорганизмов. С 2006 г. международным сообществом были одобрены несколько новых тестов и диагностических подходов, включая использование жидких питательных сред с быстрой идентификацией в качестве стандартного эталона для подтверждения этиологии заболевания.

Культивирование на жидкой среде повышает выявление микобактерий примерно на 10% по сравнению с плотными питательными средами. В настоящее время широко используются системы с автоматической детекцией учета роста микобактерий, которые позволяют значительно ускорить получение результата. В бактериологических лабораториях медицинских организаций фтизиатрического профиля РФ преобладающей является автоматизированная система BACTEC MGIT 960/320.

Преимущества автоматизированной системы культивирования BACTEC MGIT 960/320 перед культуральными исследованиями на плотных питательных средах обеспечиваются высокой эффективностью стандартизованных и сертифицированных по ISO9001 производств реагентов и сред, а также поддержанием стандартных протоколов исследований. Посев на жидкие питательные среды настоятельно рекомендуется при диагностических исследованиях, для обследования впервые выявленных больных и повторных случаев лечения.

Начиная с открытия Коха, длительное время основным и наиболее распространенным методом выявления микобактерий туберкулеза являлась бактериоскопия.

В настоящее время метод бактериоскопии считается недостаточным для диагностики туберкулеза. В практической работе противотуберкулезных учреждений необходимо чаще применять посев исследуемого материала на питательную среду, т. е. бактериологический метод.

Кроме бактериоскопии и метода посева, необходимо в ряде случаев использовать и прививки лабораторным животным, т. е. биологический метод.

Микобактерии туберкулеза можно обнаружить в различном материале, полученном от больного. Таким материалом является прежде всего мокрота. С усовершенствованием лабораторных методов удается обнаружить микобактерии туберкулеза в мокроте при незначительных изменениях в легких, а в ряде случаев — и без видимых на рентгенограмме туберкулезных поражений в легких. При отсутствии мокроты или невозможности ее получения исследуют промывные воды желудка. Этот способ после работ Арман-Делилля [Armand-Delill, 1927] имеет широкое применение в практике противотуберкулезных учреждений. Предполагали, что микобактерии туберкулеза попадают с мокротой в желудок как у взрослых, так и особенно у детей, страдающих легочным туберкулезом. Исследования и клинические наблюдения, проведенные в СССР и за рубежом, показали, что микобактерии туберкулеза в промывных водах желудка можно обнаружить не только при легочном, но и при внелегочном туберкулезе (кожи, костей, глаз, лимфатических узлов). Эти наблюдения доказывают возможность поступления микобактерии туберкулеза в желудок лимфогематогенным путем независимо от локализации туберкулезного процесса.

При отсутствии мокроты можно исследовать, кроме промывных вод желудка, слизь из гортани, а также промывные воды бронхов. Для этого больному натощак после предварительной анестезии дыхательных путей 1 % раствором дикаина орошают гортань подогретым изотоническим раствором хлорида натрия (10—15 мл) с помощью гортанного шприца. При этом необходимо создать такое положение больного, которое способствовало бы попаданию раствора в бронхи пораженного легкого. Изотонический раствор хлорида натрия, раздражая слизистую оболочку бронха, вызывает усиленное отделение слизи. Выделяемые при откашливании больным промывные воды бронха собирают в стерильный сосуд и подвергают дальнейшему исследованию.

Можно исследовать микобактерии туберкулеза, выделенные в фекальных массах, но при обнаружении в них микобактерий туберкулеза трудно решить вопрос, из каких органов последние выделяются.

Исследовать можно также мочу, спинномозговую жидкость, другие биологические жидкости и патологический материал.

Бактериоскопические методы выявления микобактерий туберкулеза

Бактериоскопические методы выявления микобактерий включают: обычную бактериоскопию мазков, окрашенных по Цилю — Нильсену, флотацию и люминесцентную микроскопию.

Обычная бактериоскопия. В мазках, окрашенных по Цилю — Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены только при наличии не менее 50 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (предел чувствительности метода), причем тогда, когда микобактерии не изменены тинкториально или морфологически под влиянием антибактериальных препаратов (при лечении больного).

Для приготовления мазков мокроту выливают в чашку Петри и заостренными деревянными палочками из 5—6 участков выбирают гнойные комочки на два предметных стекла для приготовления мазков. Один препарат используют для исследования на эластические волокна. На другом стекле комочки мокроты растирают третьим стеклом и получают таким образом два препарата, один из которых окрашивают по Цилю — Нильсену, а второй, например, флюорохромными красками, если имеется возможность произвести люминесцентную микроскопию.

При окраске по Цилю — Нильсену на препарат наливают карболовый фуксин, подогревают до появления паров, обесцвечивают 6% раствором серной кислоты или 3% солянокислым алкоголем и докрашивают 0,25% раствором метиленового синего.

Окрашенные мазки микроскопируют с иммерсионной системой. При этом микобактерии туберкулеза выглядят красными на синем фоне. Типичные микобактерии имеют вид тонких, прямых или слегка изогнутых зернистых палочек.

Количество микобактерий туберкулеза, обнаруживаемых методом бактериоскопии в мокроте больного, зависит от многих причин и может колебаться в различных пределах. Учитывая возможные случайности и затруднения для определения количества микобактерий туберкулеза, мокроту больного рекомендуется исследовать повторно.

С введением в практику бактериостатических средств, препятствующих росту и размножению микобактерий туберкулеза в организме больного, определение количества их в мокроте в период лечения может быть относительным критерием эффективности антибактериальной терапии, учитывать который необходимо в комплексе с клиническими, рентгенологическими и другими лабораторными исследованиями. При отрицательных результатах бактериоскопии мокроты больных туберкулезом или лиц, подозрительных на туберкулез, рекомендуется производить повторные исследования мокроты 4—5 дней подряд или гомогенизировать мокроту при помощи химических веществ, т. е. превращать в однородную массу, и центрифугировать ее с целью концентрации микобактерий туберкулеза в небольшом объеме.

В мокроте могут быть различные форменные элементы: лейкоциты, эритроциты, эпителий, альвеолярные клетки, пылевые клетки, цилиндрический мерцательный эпителий, эластические волокна, известковые соли, кристаллы холестерина. Плоский эпителий может исходить из полости рта, глотки, гортани. У лиц, вдыхающих угольную пыль и дым, в мокроте обнаруживаются пылевые клетки. Цилиндрический эпителий может включаться в мокроту при прохождении последней через бронхи и трахею. Эритроциты, единичные и неизмененные, могут попадать в мокроту из поврежденных десен и носоглотки, но наличие эритроцитов в мокроте может быть и вследствие кровохарканья.

В мокроте могут быть, кроме описанных, эластические волокна Коплена — Джонса, или коралловидные. Они представляются толстыми, шероховатыми образованиями, заканчивающимися колбасообразно. Можно обнаружить и обызвествленные эластические волокна.

Наличие эластических волокон в мокроте указывает на разрушение легочной ткани. При свежем распаде пучки волокон сохраняют альвеолярное строение, при пролиферативных формах туберкулеза эластические волокна выделяются в виде пучков без сохранения альвеолярного строения. Волокна могут выделяться при всех формах туберкулеза; волокна Коппена — Джонса появляются преимущественно в случаях старого туберкулеза. Обызвествленные волокна можно видеть при распаде обызвествленных очагов во время обострения процесса.

Необходимо иметь в виду, что эластические волокна также можно обнаружить и при ряде нетуберкулезных заболеваний легких, например при абсцессе легких.

В мокроте больных туберкулезом можно обнаруживать известковые соли (карбонаты и сульфаты), имеющие под микроскопом вид темных зерен разной величины. Попадают они в мокроту чаще всего из старых, распадающихся обезвествленных очагов. Известковые соли от прибавления разведенной азотной кислоты растворяются.

Кристаллы холестерина в мокроте имеют вид нежных пластинок разной величины, большей частью с обломанными краями. Эти кристаллы обнаруживаются при наличии в легких старых каверн.

Метод флотации. Этот метод применяется в случаях скудного содержания микобактерий туберкулеза в исследуемом материале и при отрицательном результате бактериоскопии. По сравнению с обычной бактериоскопией микобактерии туберкулеза обнаруживаются методом флотации в патологическом материале примерно на 10—15% чаще. Для исследования методом флотации мокроту в количестве 12—15 мл помещают в колбу емкостью 250 мл, добавляют примерно равное количество 0,5% раствора едкого натра или кали и для лучшей гомогенизации встряхивают в течение 5—10 мин, затем до половины емкости колбы наливают дистиллированную воду с добавлением 0,5 мл ксилола или бензина. Все содержимое встряхивают 5—10 мин, после чего доливают дистиллированную воду до окончательного объема — 250 мл. Спустя 30—60 мин капельки бензина (ксилола) всплывают на поверхность, увлекая за собой микобактерии туберкулеза, концентрируя их в небольшом объеме образовавшегося на поверхности кольца. Полученное флотационное кольцо пипеткой переносят на два предметных стекла. Один препарат окрашивают по Цилю — Нильсену.

При флотации промывных вод, гноя, экссудата, спинномозговой жидкости и другого материала, не требующих гомогенизации, к ним добавляют меньшее количество раствора щелочи (от 1—2 капель до 1—2 мл в зависимости от количества материала). В дальнейшем поступают так же, как при флотации мокроты.

Люминесцентная микроскопия. Метод люминесцентной микроскопии основан на способности микобактерий туберкулеза, окрашенных флюорохромами, светиться под воздействием сине-фиолетовых лучей.

Этот метод позволяет дополнительно выявлять микобактерии туберкулеза на 17% чаще по сравнению с обычной бактериоскопией и на 8% чаще по сравнению с методом флотации. При люминесцентной микроскопии исследование производится при малом увеличении, что расширяет поле зрения и способствует обнаружению микобактерий туберкулеза, содержащихся в исследуемом материале в небольшом количестве.

Для люминесцентного исследования пользуются либо специальным микроскопом (МЛ-1 и МЛ-2), либо обычным микроскопом типа МБИ-1 с добавочным осветителем. Ко всем комплектам осветительной аппаратуры прилагаются наборы необходимых светофильтров.

Люминесцентным методом исследуют различный патологический материал. Фиксированные над пламенем препараты

окрашивают при легком подогревании в течение 15 мин специальной смесью: аурамин 00—0,5 г, радомин С — 0,05 г на 1000 мл дистиллированной воды. Затем мазок промывают водой и в течение полминуты обесцвечивают 3% солянокислым спиртом, снова промывают водой и докрашивают для гашения фона 0,25% раствором метиленового синего. При люминесцентной микроскопии микобактерии флюоресцируют золотисто-желтым цветом на темном нефлюоресцирующем фоне. Этот метод в настоящее время находит широкое применение.

Бактериологические методы

Больной туберкулезом в процессе антибактериального лечения может выделять микобактерии туберкулеза, измененные морфологически и в небольшом количестве, что не позволяет обнаружить их бактериоскопическими методами (обычная бактериоскопия, метод флотации, люминесцентная микроскопия). Поэтому в комплекс исследований, направленных на обнаружение микобактерий туберкулеза, в настоящее время обязательно включается посев патологического материала. Выделение культур микобактерий туберкулеза позволяет определить жизнеспособность возбудителя, его лекарственную чувствительность, ферментативную активность и вирулентность.

Для бактериологического исследования может быть использован любой патологический материал.

Поскольку обычно в посевном материале содержится и неспецифическая микрофлора, требуется его так обработать, чтобы уничтожить сопутствующую микрофлору и сохранить при этом жизнеспособность микобактерий туберкулеза.

В последние годы в связи с широким применением противотуберкулезных препаратов в 19—20% случаев наблюдается диссоциация между обнаружением микобактерий туберкулеза при бактериоскопическом исследовании и ростом их при посеве патологического материала. Это явление заключается в том, что видимые под микроскопом, они не растут на питательных средах. Такая диссоциация обусловлена воздействием на микобактерии туберкулеза лекарственных препаратов.

Биологическая проба. Наиболее чувствительным методом обнаружения микобактерий туберкулеза является заражение морских свинок. Однако не всегда удается получить развитие генерализованного туберкулеза в тех случаях, когда в патологическом материале содержатся микобактерии туберкулеза, устойчивые к препаратам гидразида изоникотиновой кислоты. В таких случаях микобактерии оказываются невирулентными для этих животных, и тогда при положительном результате посева патологического материала имеет место отрицательный исход заражения.

При развитии туберкулезного процесса после подкожного заражения в области введения материала к концу месяца прощупываются увеличенные лимфатические узлы. Аллергические реакции определяются при внутрикожном введении 0,1 мл ATK 1 : 10. При положительной биологической пробе у морских свинок развивается генерализованный туберкулез.

*Импакт фактор за 2018 г. по данным РИНЦ

Журнал входит в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК.

Читайте в новом номере

ЦНИИ туберкулеза РАМН, Москва

В настоящее время лабораторная диагностика занимает ведущее место в выявлении многих инфекционных заболеваний. Подтверждение диагноза туберкулеза основывается на результатах микробиологических анализов при выделении из биологического материала возбудителя – микобактерий туберкулеза. Современная микробиологическая диагностика туберкулеза состоит из нескольких основных групп анализов, направленных на выявление возбудителя, определение лекарственной чувствительности и типирование микобактерий.

Обнаружение возбудителя начинается с наиболее простых и быстрых бактериоскопических методов с использованием светового микроскопа с окраской по Циль–Нильсену и люминесцентного с окраской флюорохромами. Преимущество бактериоскопии – в быстроте получения результата. Однако возможности ее ограничены из–за низкой чувствительности. Этот метод является наиболее экономичным и рекомендован ВОЗ в качестве основного для выявления заразных больных (табл. 1).

При антибактериальной терапии обнаружение микобактерий туберкулеза имеет прогностическое значение. Поэтому бактериовыделение оценивается количественно. Золотым стандартом выявления микобактерий признаны культуральные исследования. Для посева патологического материала используют яичные среды: Левенштейна–Йенсена, среду Финна II, Мордовского и др. Количество микобактерий (или колоний в пробирке при культуральном методе исследования) в процессе химиотерапии является ориентировочным показателем ее эффективности или косвенным свидетельством развития устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам.

Для повышения процента выделения микобактерий посевы патологического материала проводят на несколько сред, в том числе и на жидкие в автоматизированных системах учета роста типа BACTEC, что позволяет удовлетворить все культуральные потребности возбудителя. Посевы инкубируют до двух с половиной месяцев. При отсутствии роста к этому времени посев считается отрицательным. Наиболее чувствительным способом обнаружения микобактерий туберкулеза считается метод биологической пробы – заражение диагностическим материалом высокочувствительных к туберкулезу морских свинок.

Развитие молекулярной биологии позволило значительно повысить эффективность обнаружения микобактерий. Базовым методом молекулярно–генетических исследований является полимеразная цепная реакция (ПЦР), направленная на выявление ДНК микобактерий в диагностическом материале. ПЦР дает экспоненциальное увеличение специфического участка ДНК возбудителя: 20 циклов ПЦР приводят к увеличению исходной ДНК в 1 миллион раз, что позволяет визуализировать результаты методом электрофореза в агарозном геле.

Роль молекулярной диагностики в клинической практике повышается, поскольку увеличивается число больных со скудным бактериовыделением. Однако при постановке диагноза результаты ПЦР являются дополнительными и должны сопоставляться с данными клинического обследования, рентгенографии, микроскопии мазка, посева и даже ответа на специфическое лечение.

Интереснейшая область исследования, которая открывается благодаря ПЦР–диагностике, – изучение латентной инфекции M. tuberculosis. По современной концепции туберкулезной инфекции, из 100 человек, контактирующих с M. tuberculosis, 90 могут быть инфицированы, но только у 10 развивается активная болезнь. У остальных 90% инфекция будет оставаться латентной из–за противотуберкулезного иммунитета. Положительные ответы ПЦР при отрицательных результатах посевов патологического материала отмечаются у 55% лиц, подвергавшихся бытовым контактам с M. tuberculosis, и у 80% лиц, у которых туберкулез протекал без рентгенографических проявлений. Проведение ПЦР–исследований у пациентов из групп риска выявляло больных с отрицательными результатами микроскопии и посевов, но с субклинической инфекцией M. tuberculosis [11]. Подобные результаты были получены и в наших исследованиях [6].

Определение лекарственной устойчивости микобактерий

Для определения лекарственной устойчивости микобактерий используется несколько групп методов (табл. 2). По приказу № 558 МЗ РФ от 1978 г. в бактериологических лабораториях России используется метод абсолютных концентраций. В лаборатории ЦНИИТ РАМН внедрен ускоренный метод по тестированию нитратредуктазной активности микобактерий с помощью реактива Грисса.

В крупных противотуберкулезных центрах используются методы определения лекарственной устойчивости в жидких средах с автоматизированной радиометрической и флюоресцентной системой учета роста микобактерий типа ВАСТЕК, позволяющие сокращать срок анализа до 14 дней.

В последнее время разрабатываются новые методы оценки лекарственной устойчивости на уровне генотипа [10]. Работа по изучению молекулярных механизмов резистентности показала наличие у микобактерий генов, связанных с устойчивостью к различным препаратам: к изониазиду – гены katG, inhA, kasA, к рифампицину – rpoB, к стрептомицину – rpsL и 16SрРНК, к этамбутолу – emb1, к фторхинолонам – gyrA и т.д. [7].

Широкомасштабные исследования по изучению спектра мутаций в геноме устойчивых микобактерий показали, что наиболее распространенными были мутации в 531, 526 и 516 кодонах rpoB гена, устойчивость к изониазиду характеризовалась мутациями в 315 кодоне katG гена. В целом спектр мутаций не отличался от выявленных исследователями в разных регионах мира [2].

Доступность данных по молекулярной основе лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам дала возможность разработки новых, основанных на ПЦР, методов, представленных в табл. 2. Наши работы, проведенные совместно с Институтом физико–химической медицины МЗ РФ и Институтом молекулярной биологии РАН, продемонстрировали перспективность использования молекулярно–генетических методов для быстрого определения лекарственной устойчивости [1, 3, 4].

Наибольшие надежды по совершенствованию методов для определения лекарственной устойчивости микобактерий связаны с развитием микрочиповой технологии, позволяющей определять устойчивость одновременно к нескольким противотуберкулезным препаратам микобактерий непосредственно из диагностического материала в течение 2 дней [9].

Комплекс методов имеется и для типирования микобактерий, когда используются традиционные культуральные и биохимические методы, биологические, а также молекулярно–генетические (табл. 3). На основе молекулярно–генетического типирования микобактерий интенсивно развивается область молекулярно–эпидемиологических исследований, в которой по генотипу микобактерии выявляются очаги и прослеживаются пути распространения туберкулезной инфекции [5, 8].

#Pt6982.gif В заключение необходимо подчеркнуть, что в настоящее время имеется научный потенциал для совершенствования бактериологических исследований, а благодаря успехам молекулярной биологии существует возможность значительного сокращения сроков выявления микобактерий, определения лекарственной устойчивости и контроля за эффективностью химиотерапии.

1. Альтшуллер М.Л. и др. Применение аллель–специфической амплификации и SSCP для выявления устойчивости к рифампицину клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis. // БЭБиМ, 1999; 128(11): 555–8.

2. Генерозов Э.В. и др. Молекулярная характеристика полирезистентных клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis из России. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2000; 1: 11–7.

3. Генерозов Э.В.и др. Детекция и характеристика мутаций в rроВ гене резистентных к рифампицину клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. // Проблемы туберкулеза, 1999; 2: 39–42.

4. В.М. Михайлович и др. Использование методов гибридизации и ПЦР на специализированном ТБ–микрочипе для обнаружения рифампицин–резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis // БЭБ и М, 2001, 1: 112–7.

5. Черноусова Л.Н.и др. Молекулярная эпидемиология туберкулеза в тюрьмах. // Актуальные проблемы пенитенциарной медицины. Мат–лы международной научно–практич. конференции, Минск, 2001: 48–50.

6. Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В., Голышевская В.И. Роль ПЦР–анализа в комплексных бактериологических анализах во фтизиатрии. // Проблемы туберкулеза, 2001; 3: 58–60.