Микобактерия туберкулеза посев на питательную среду

Молекулярные методы

Культивирование.Бактериологическое исследование позволяет выявить 20-100 микобак­терий в 1 г исследуемого материала, т.е. он существенно чувствительнее бактериоскопического.

Из каждого лимфатического узла вырезают кусочки объемом около 0,5 см 3 на границе здоровой и измененной ткани. Общая масса ткани лим­фатических узлов должна быть 6-10 г. Лимфатические узлы из области илеоцекального соединения и подвздошной кишки обрабатывают и высе­вают отдельно.

Исследуемый материал перед посевом на питательные среды подвер­гают обработке с целью подавления роста сопутствующей некислоустойчивой микрофлоры, освобождения микобактерий от муцина (в образцах трахеобронхеальной слизи), концентрирования клеток возбудителя. Для достижения перечисленных целей применяют методы, указанные ранее, а также нижеследующие.

Обработка материала щелочью.Более удобна, так как нет очень жест­ких ограничений времени контакта щелочи с материалом, кроме того, ще­лочь растворяет муцин, гной и т.д. В колбу с бусами помещают исследуе­мый материал и 4-6%-ный раствор NaOH в соотношении 1:2 и содержи­мое периодически встряхивают в течении 15-20 минут. Далее щелочь ней­трализуют 50%-ной H₂S0₄, содержащей настойку лакмуса. Кислоту вносят по каплям до момента розово-фиолетового окрашивания жидкости. После нейтрализации взвесь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 9-10 минут. Осадок высевают на плотные яичные среды.

Обработка материала трехзамещенным фосфатом натрия.Данная соль угнетает рост некислотоустойчивой микрофлоры и почти не влияет на микобактерии. Исследуемый материал и 10%-ный раствор трехзамещенного фос­фата натрия смешивают в соотношении 1:1, выдерживают в термостате при 37° С в течение 24 часов, нейтрализуют соляной кислотой, центрифугируют и высевают на питательные среды.

Материал, содержащий муцин.Материал смешивают с равным объе­мом раствора, содержащего тринатрий фосфат и цефиран (В 1000 мл горячей воды растворяют 250 г Na₂HP0₄*12H₇0 и добавляют 1,85 мл цефирана (17%-ный), встряхивают в течение 30 минут, центрифугируют и осадок ресуспендируют в 20 мл бу­ферного раствора (37,5 мл 0,067 N двунатрия фосфата и 62,5 мл 0,067 N калия фосфата (конечный рН 6,6), нейтрализующего цефиран и вновь центрифугируют 20 минут. Осадок высевают на питательные среды.

Плотные образцы материала (лимфатические узлы).Материал (неизмельченные образцы) выдерживают 4-16 часов в растворе гипохлорита (1:1000). Затем ткани и жировую пленку переносят в ступку со стерильным бульоном и индикатором фенолротом, измельчают, добавляют 2-4%-ный NaOH на 20-30 минут. Далее суспензию нейтрализуют 2N НС1, центри­фугируют с целью концентрации микобактерий, осадок высевают на пита­тельные среды, готовят окрашенные препараты для микроскопии.

Согласно ГОСТ 26072-89 рекомендуется материал обрабатывать по Го­ну или Аликаевой.

Для культивирования микобактерий используют различные питатель­ные среды. Наиболее подходят для первичной изоляции среды Левенштейна-Иенсена, Гельберга, Петраньяни, а также среда Stonebrinks для Mycobacterium bovis. Селективные свойства средам придает добавка малахитового зеленого (0,025 г/100 мл).

Для своего роста требуют добавления глицерина (4-5%) М. tuberculosis, М. avium и ряд атипичных микобактерий, однако при этом необходимо учи­тывать, что глицерин ингибирует натрий пируват (0,4%), стимулирующий рост М. bovis.

Селективные свойства сред можно повысить добавлением линкомицина (2 мкг/мл), циклогексимида (400 мкг/мл). М. bovis при выделении из материа­ла проявляет микроаэрофильные свойства, не требует глицерина, темпера­турный оптимум 38-40° С, М. avium —температурный оптимум 38-41° С, рН 6,8-7,3. М. tuberculosis — в первичных посевах рост стимулируется на­личием в атмосфере 10-15% СО₂, температурный оптимум 37-38° С, рН 6,4-7,0.

Подготовленый тем или иным способом материал засевают в 5-10 про­бирок с плотными средами. Посевы инкубируют при 37-38° С в наклон­ном положении. Через 48 часов посевы просматривают, если цвет среды не восстановился, посев повторяют. Пробирки с ростом посторонней микро­флоры выбраковывают, в остальных пробки парафинируют. В последую­щем посевы просматривают еженедельно до 3 месяцев.

Ускоренные методы культивирования микобактерий (метод микрокуль­тур на стеклах).На двух предметных стеклах готовят мазки из посевного материала. Мазки подсушивают в термостате, обрабатывают 5-10 минут 6%-ным раствором серной кислоты и трижды промывают дистиллирован­ной водой. Затем оба стекла складывают вместе (обратными поверхностя­ми) и помещают в культуральный сосуд, содержащий свежую гемолизированную кровь в разведении 1:4-1:6, инкубируют в течение недели. Один из мазков вынимают, промывают и окрашивают по Циль-Нильсену или люминесцирующими красителями.

Вирулентные штаммы образуют на стеклах микроколонии в виде кос, жгутов (наличие корд-фак­тора) или звездчатых образований.

Сапрофитные и атипичные микобакте­рий обычно грубее, толще, не образуют сплетений. Метод уступает по чувствительности обычному посеву на питатель­ные среды и может быть использован лишь как вспомогательный.

При обнаружении роста микобактерий для изучения свойств выделен­ной культуры отбирают колонии, наиболее характерные для возбудителей туберкулеза, бактериальную массу тщательно растирают в 1-1,5 мл сте­рильного физиологического раствора. Взвесь засевают на яичные среды и пробирку с МПБ.

Ранион по скорости роста и пигментообразованию под­разделил атипичные микобактерий на следующие группы:

Фотохромогенные— колонии формируются через 2 недели при 37° С ичерез 3 недели — при комнатной температуре. Образуют желто-оранжевый пигмент, при культивировании на свету дают более интенсивное окрашива­ние колоний. Типовой вид — M. kansasii. Пигмент образован кристаллами В-каротина, которые различимы при изучении колоний под малым увеличе­нием, что позволяет достаточно надежно отличить бактерии этой группы от других микобактерий. M. kansasii образует колонии от SR до RS, но могут быть и R-формы. M. marinum — S/SR,
M. simiae — S.

Скотохромогенные.У пигментнообразующих штаммов колонии окра­шены в желто-оранжевый цвет независимо от культивирования на свету или в темноте. M. scrofulaceum образует колонии S-формы через две недели культивирования.

Нефотохромогениые бактерии.Колонии формируются через 5-10 су­ток или позднее. Колонии обычно кремовые, иногда полупрозрачные, S-формы, реже SR- и R-формы. Старые культуры некоторых штаммов мо­гут быть желто-оранжевыми, но окрашивание не зависит от наличия света.

Весьма сходны виды М. avium и M. intracellulare (комплекс avium-intracellulare). Образуют звездчатые микроколонии. М. avium растет при 42-45° С. M. intracellulare не дает роста в течение трех недель инкубиро­вания.

Умеренно, и быстрорастущие микобактерии.Колонии формируются в течение 7 суток при 37 и 25° С. Адаптированные культуры могут давать макроскопически видимые колонии через 1-2 суток, рост первичных куль­тур может быть замедленным (до двух недель). Дифференцировать от дру­гих микобактерий по признаку пигментообразования согласно Ранион их не удается, так как на это сходство оказывают влияние многие факторы. При дифференциации принимают во внимание способность к росту при тем­пературе более 45° С и ускорение роста при оптимальной температуре.

При учете результатов посева исследуемого материала на питательные среды пробирки, в которых рост микобактерий появился в течение первой недели инкубирования, из дальнейшей работы исключают как содержащие сапрофитные быстрорастущие микобактерий.

Для основных патогенных видов микобактериий характерен следую­щий тип роста на питательных средах.

M. tuberculosis.В первичных посевах макроскопически видимый рост наблюдается обычно на 20-30 сутки. В жидких питательных средах рост характеризуется появлением на поверхности сухой, складчатой пленки, под­нимающейся по стенкам сосуда, среда остается прозрачной — эугонический рост. В средах с твином-80 с потерей гидрофобности наблюдается диф­фузный рост. На плотных средах характерен интенсивный рост в виде узелковоподобного, морщинистого, сухого налета цвета слоновой кости. Ко­лонии R-формы, морщинистые, суховатые, имеют неровный край, центр обычно приподнят (вирулентные штаммы). Могут встречаться S-варианты культуры.

M. bovis.Первичный рост на плотных средах наблюдается на 20-60 сутки (субкультуры на 20-30 сутки). В жидких питательных средах проис­ходит рост на поверхности среды в виде единичных островков, постепенно сливающихся в пленку — дисгонический рост. На плотных средах растет в виде мелкоморщинистого, сухого, сероватого налета. Колонии мелкие, сухие, блестящие, полушаровидные, гладкие, с неровными краями, цвета слоновой кости, иногда встречаются складчатые колонии.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Для культивирования микобактерии туберкулеза используют различные питательные среды: плотные, полужидкие, жидкие (синтетические и полусинтетические). Однако ни одна из них не обладает качествами, предъявляемыми к ним современной бактериологической диагностикой туберкулеза. В связи с этим для повышения результативности культурального метода рекомендуется применять посев патологического материала одновременно на несколько (2-3) питательных сред. Для выделения чистых культур микобактерии туберкулеза чаще всего применяют различные по составу плотные питательные среды. В качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя и определения его лекарственной чувствительности ВОЗ рекомендована среда Левенштейна-Йенсена. Это плотная яичная среда, на которой хороший рост микобактерии туберкулеза получают на 15-25-й день после посева бактериоскопически положительного материала.

В последние годы широкое распространение в нашей стране получила яичная среда II, предложенная Э.Р. Финном (среда Финна-II). Она отличается от среды Левенштейна-Йенсена тем, что вместо b-аспарагина в ней используется глутамат натрия. На этой среде рост микобайтерий туберкулеза появляется на несколько дней раньше, чем на среде Левенштейна-Йенсена. Процент выделения культур на этой среде на 6—8% выше, чем на среде Левенштейна-Йенсена.

Для повышения вероятности получения роста микобактерии рекомендуется засевать патологический материал на 2—3 различные по составу питательные среды одновременно. В настоящее время, кроме безаспарагиновой среды Финна-И, в практику внедряется еще одна безаспарагиновая среда, разработанная В.А. Аникиным. По данным Московского НИИ туберкулеза, применение сред, сбалансированных по солевому составу и источникам азотистого питания иначе, чем среда Левенштейна-Йенсена, культуральная диагностика туберкулеза улучшается в среднем на 6,7%. Это особенно важно при таких формах туберкулеза, при которых возбудитель паразитирует в условиях ацидоза и анаэробиоза, в частности, при туберкулезе мочеполовых органов.

Для повышения результативности культурального метода наряду с применением одновременно нескольких различных по составу питательных сред для посева рекомендуется повторное многократное исследование материала, так как в настоящее время отмечается состояние олигобациллярности у большинства больных даже со свежевыявленными деструктивными поражениями в легких. Олигобациллярность проявляется не только малым количеством возбудителей в диагностическом материале, но и транзиторностью, эпизодичностью их выделения. Поэтому часто посев даже на 3 различные питательные среды не обеспечивает полной информации о состоянии бактериовыделения.

Для повышения информативности культурального метода практикуется повторное многократное исследование материала от больных. По данным Центрального НИИ туберкулеза, методика 3-кратного первичного комплексного исследования бактериоскопическими и культуральными методами у впервые выявленных больных деструктивным туберкулезом легких дает дополнительно 3,4% положительных результатов, а у больных хроническим деструктивным туберкулезом, лечившихся до поступления в стационар, — 5,8% по сравнению с данными одноразового исследования. Однако, по данным ряда авторов, и 3-кратные посевы недостаточны для выявления истинной картины бактериовыделения. Так, установлено, что при обследовании нелечившихся больных максимальный прирост информации о бактериовыделении можно получить при 6-кратных повторных посевах материала, при этом количество положительных результатов возрастает на 36—37% по сравнению с данными 3-кратного посева. У больных после 3-месячного лечения ценность многократного исследования патологического материала методом посева возрастает и при 6-кратном исследовании показатель прироста положительных результатов может достигать 70%, а после 6 мес лечения он возрастает до 82%.

Таким образом, кратность исследования и состав питательных сред имеют важное значение для культуральной диагностики туберкулеза.

В связи с тем что в процессе интенсивной химиотерапии происходит повреждение различных метаболических систем микробной клетки, ряд микроорганизмов в микобактериальной популяции утрачивает способность нормально развиваться на питательных средах. Отмечается снижение жизнеспособности микобактерий, что может проявляться отсутствием роста на общепринятых питательных средах, а также возникновением способности расти только на осмотически сбалансированных (полужидкие или даже жидкие) питательных средах. Так, по данным И.Р. До рожковой, в процессе интенсивной противотуберкулезной химиотерапии часть микобактериальной популяции, утрачивая способность расти на плотных питательных средах, в то же время приобретает свойство расти на полужидких питательных средах, образуя микроколонии в верхнем наиболее аэрируемом участке питательной среды. Эта потребность в повышенной аэрации четко проявляется также при культивировании микобактерий в жидких питательных средах с увеличенной аэрацией, которая достигается при культивировании посевов во вращающемся термостате (Н.М. Макаревич).

После посева и закрытия пробирок материал должен быть распределен по всей поверхности питательной среды, для этого пробирки наклоняют. Пробирки должны находиться в горизонтальном положении в течение 24—48 ч, после чего их следует перевести в вертикальное положение.

Посевы нужно просматривать еженедельно. При этом обязательно регистрируются параметры:

• а) появление роста — срок появления, начиная со дня посева;
• б) интенсивность роста — число колоний, этот показатель имеет большое диагностическое и прогностическое значение, особенно если посевы производятся в динамике;
• в) загрязнение посева посторонней микрофлорой или грибами;
• г) отсутствие роста.

При первичном посеве бактериоскопически отрицательного материала на плотные среды средняя продолжительность роста составляет 20—46 дней. Отдельные штаммы растут 60 и даже 90 дней. Это заставляет выдерживать посевы в термостате в течение 3 мес, еженедельно проверяя появление роста.

Обычно вирулентные культуры микобактерий туберкулеза растут на плотных питательных средах в виде R-форм колоний различной величины и вида. Колонии сухие, морщинистые, цвета слоновой кости, но в случае диссоциации могут встречаться и влажные, слегка пигментированные колонии, розовато-желтый пигмент которых резко отличается от оранжевого или желтого пигмента сапрофитных или атипичных микобактерий. Последние обычно растут в S-форме. Следует отметить, что на среде Финна-II колонии микобактерий туберкулеза могут быть более влажными.

После курса химиотерапии от больных туберкулезом могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (S-формы). Гладкие колонии характерны также для Mycobacterium bovis, которые также патогенны для человека.

Интенсивность роста обозначают по 4-балльной системе: + единичные колонии; ++ от 20 до 100 колоний; +++ от 100 до 200 колоний; мм несосчитываемое число колоний (сливной рост). В двух последних случаях имеется обильное бактериовыделение, которое является показателем активности процесса и/или неэффективности лечения.

Если морфология колоний или палочек вызывает сомнения в их туберкулезной природе или культуры выделены из материала, который может содержать кислотоустойчивые сапрофиты (моча, гной из ушей и др.), мазки дополнительно обесцвечивают спиртом (в течение 45—60 мин) или жавелевой водой (в течение 1—2 ч). Следует учитывать, что молодые культуры микобактерий туберкулеза могут обесцвечиваться спиртом и жавелевой водой, так как они еще слабо кислотоустойчивы. В таких случаях культуры следует выдержать еще несколько дней (5—10) в термостате и вновь повторить микроскопическое исследование, чтобы убедиться в их кислотоустойчивости.

Авирулентные сапрофитные и атипичные микобактерий обычно грубее, толще, иногда менее интенсивно окрашены и, как правило, не образуют жгутообразных сплетений (корд-фактор отсутствует). Однако некоторые виды атипичных микобактерий (фотохромогенные) могут расти в R-форме. Многие атипичные и сапрофитные микобактерий имеют кислотоустойчивые зерна, весьма сходные с таковыми у вирулентных микобактерий туберкулеза.

В тех случаях, когда выделяются культуры, вызывающие сомнения в плане их принадлежности к микобактериям туберкулеза, их изучают, используя комплекс специальных исследований, позволяющих дифференцировать типичные микобактерий туберкулеза от нетуберкулезных (атипичных) микобактерий и кислотоустойчивых сапрофитов.

Как отмечалось выше, в случае появления на питательных средах роста колоний и установления с помощью микроскопии окрашенных по Цилю — Нильсену мазков факта, что выросшая культура относится к кислотоустойчивым микобактериям, производится количественная оценка результатов посева. С этой целью применяют различные схемы оценки (одна из них приведена выше). В Центральном НИИ туберкулеза используют количественную оценку бактериовыделения методом посева по 3 степеням:

1. скудное — на плотных питательных средах вырастает 1—20 колоний во всех пробирках, использованных для данного посева;
2. умеренное — от 21 до 100 колоний во всех пробирках;
3. обильное — обнаруживается рост более 100 колоний во всех пробирках.

Культуральные методы диагностики (методы выращивания МБТ путем посева диагностического материала на питательные среды с последующей идентификацией выросших микроорганизмов) являются основными методами выделения МВТ. Их специфичность превышает специфичность микроскопических методов, а предел обнаружения значительно выше: наличие нескольких сотен и даже десятков жизнеспособных микобактерий (МБ) в 1 мл исследуемого материала.

Диагностическая чувствительность методов культивирования МБТ достигает 70-80 % среди впервые выявленных больных туберкулезом легких.

Среди впервые выявленных больных туберкулезом легких с бактериовыделением с помощью методов культивирования МБТ удается выявить на 10-30% больше числа случаев заболевания по сравнению с методами микроскопии. Методы культивирования МБТ позволяют выделить культуру возбудителя, необходимую для определения его видовой принадлежности и определения спектра и степени лекарственной чувствительности.

Видовая идентификация выделенной культуры микроорганизмов с помощью комплекса современных молекулярных методов позволяет сразу же дифференцировать МБТ от НТМБ и неспецифической микрофлоры.

Медленный рост МБТ требует значительного времени ожидания результатов при данных видах исследований. В среднем, при посеве диагностического материала от впервые выявленных больных для получения роста МБТ на плотных питательных средах требуется 21-36 дней, на жидких питательных средах - 12-22 дня.

2.1. Методы культивирования микобактерий туберкулеза на плотных питательных средах.

Получение роста микобактерий на плотных средах занимает более длительное время (до получения отрицательного результата - 12 недель), чем культивирование микобактерий на жидких средах (42-46 дней). Указанный метод позволяет получить культуру микобактерий для проведения её дальнейших исследований и может быть рекомендован для использования на этапах диагностики (наряду с культивированием на жидких средах) и контроля эффективности химиотерапии.

2.2. Культивирование микобактерий туберкулеза в жидкой питательной среде в автоматизированной системе учета роста микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов в жидкой питательной среде повышает выявление микобактерий примерно на 10% по сравнению с выявлением на плотных питательных средах. В настоящее время широко используются системы культивирования микроорганизмов с автоматической детекцией наличия роста микобактерий, которые позволяют значительно упростить процедуру считывания результатов культивирования.

2.3. Видовая идентификация культур микобактерий туберкулеза.

2.3.1. Дифференциация микобактерий по культуральным свойствам.

При посеве на плотные питательные среды на основании скорости роста, морфологии, окраски колоний и положительной кислотоустойчивой окраски микроорганизмов можно сделать предварительное заключение о принадлежности культуры либо к микобактериям туберкулезного комплекса, либо к нетуберкулезным микобактериям.

2.3.2. Идентификация микобактерий с помощью биохимических тестов.

Дифференциация микобактерий туберкулезного комплекса и нетуберкулезными видами микобактерий основана на их культуральных свойствах и способности к росту на дифференциально-диагностических средах. Наиболее часто применяемыми и общепринятыми тестами являются способность к росту на среде, содержащей 1000 мкг/мл натрия салициловокислого; к росту на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты; к росту на среде, содержащей 5% хлорида натрия. Виды микобактерии туберкулезного комплекса не способны к росту на указанных питательных средах. Для дифференциации вида M.bovis от других видов туберкулезных микобактерий используют культуральный тест на способность к росту на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2 карбоксиловой кислоты (ТСН). Среди всех представителей этой группы только указанный вид не дает роста на этой питательной среде.

Для дифференциации видов микобактерий внутри рода применяют следующие основные биохимические исследования: тест на наличие способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест); тест на наличие нитратредуктазной активности; тест на наличие термостабильной каталазы; тест на наличие пиразинамидазы и др.

Для контроля контаминации при культивировании на жидкой/плотной питательной среде проводят посев культур на чашки Петри с кровяным агаром. Наличие роста микроорганизмов через 24 - 72 часа инкубации при +37°С свидетельствует о контаминации материала посторонней микрофлорой.

3. Методы определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза

Для определения лекарственной чувствительности МБТ в качестве основных рекомендуется использовать непрямые фенотипические методы исследований, т.е. исследование культуры МБТ в присутствии противотуберкулезных препаратов (ПТП):

- метод абсолютных концентраций на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена;

- модифицированный метод пропорций в жидкой питательной среде в системе с автоматизированным учетом роста микроорганизмов;

- нитратредуктазный метод индикации роста МБТ на основе метода абсолютных концентраций на плотной питательной среде с использованием реактива Грисса;

- модифицированный метод определения минимальных ингибирующих концентраций в жидкой питательной среде.

На плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена проводят определение ЛЧ МБТ методом абсолютных концентраций к ПТП первого ряда (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол,) и к ПТП второго ряда (канамицин, капреомицин, циклосерин, офлоксацин, этионамид, аминосалициловая кислота, амикацин).

На жидких питательных средах проводят определение ЛЧ МБТ к ПТП первого ряда (изониазид, рифампицин, этамбутол, стрептомицин, пиразинамид) и к ПТП второго ряда (амикацин, канамицин, офлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, этионамид, протионамид, капреомицин, аминосалициловая кислота, линезолид).

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

В соответствии с современными программами ВОЗ, основой выявления туберкулёза за рубежом считают проведение микроскопии мазков мокроты, полученной от кашляющих больных, обратившихся к врачам общей практики; мазки окрашивают по Цилю-Нильсену. Эта методика входит в отечественный поликлинический и клинический минимум обследования пациента, выделяющего мокроту. В 1995 г. Минздравмедпром России в приказе № 8 "О развитии и совершенствовании деятельности лабораторной клинической микробиологии (бактериологии) лечебно-профилактических учреждений" подтвердил эту обязанность клинико-диагностических лабораторий. Обязательное бактериологическое исследование мокроты на М. tuberculosis должно быть организовано для нетранспортабельных больных, больных хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящей системы, а также для работников неблагополучных по туберкулёзу животноводческих хозяйств. Этот старейший метод полностью сохраняет свое значение вследствие доступности для практических клинико-диагностических лабораторий, низкой стоимости и быстроты выполнения.

При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 - 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии, что и является большим минусом этого метода. Только при идеальном выполнении всех требуемых условий, указанных в Приказе № 109 МЗ РФ,-исследование не менее трех проб диагностического материала, правильный сбор мокроты, наличие современного бинокулярного микроскопа и высококачественных реактивов, просмотр до 300 полей зрения - возможно повышение чувствительности до 10000 микробных клеток.

Микобактерии туберкулёза имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке (рисунок 1,а) Окрашенные по Цилю-Нильсену мазки микроскопируют с иммерсионной системой не менее 10 мин.

Люминесцентная микроскопия

Метод основан на проникновении в микробную клетку карболового производного флюоресцентного красителя (аурамина, родамина). При окраске флюоресцентным красителем аурамином-родамином микобактерии можно видеть при неиммерсионном 100-кратном увеличении. Более точен результат при окраске по Цилю-Нильсену карболфуксином и иммерсионной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Именно окраска мазка по Цилю-Нильсену рекомендована при применении технологий DOTS. Микобактерии в этом случае выглядят светящимися желтыми палочками (рисунок 1, б). Метод имеет неоспоримые преимущества, так как позволяет при меньшем увеличении микроскопа просмотреть фактически весь мазок, так же этот метод экономически более эффективен, так как уменьшается время, затрачиваемое на просмотр мазков.

К недостаткам метода ЛМ следует отнести значительно более высокую стоимость люминесцентного микроскопа, при процедуре окрашивания- соблюдение и коррекция pH мазка, а также освобождение микобактерий в диагностическом материале (особенно в мокроте) от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению флуоресцентного красителя в микробную клетку. Поэтому нецелесообразно использование ЛМ для нативной мокроты, но применять этот метод рекомендуется при исследовании мазков, приготовленных после центрифугирования из осадка материала, обработанного для культурального исследования и нейтрализованного после деконтаминации. Поэтому метод ЛМ следует применять в бактериологических лабораториях, где культуральное и микроскопическое исследование может быть произведено из одной и той же порции диагностического материала.

При гистологическом или цитологическом исследовании иногда можно обнаружить характерные для туберкулёза клетки, являющиеся результатом защитной реакции организма на внедрение туберкулёзной палочки. Наличие в цитограмме гигантских клеток Лангханса с несомненностью решает диагноз туберкулёза. Эти клетки имеют очень большие размеры (80 - 90 мкм и более в диаметре). Цитоплазма окрашена в серо-голубой цвет. По её периферии расположено в ряд большое количество ядер (до 20), расположенных в форме кольца (рисунок 1, в).

Другим признаком туберкулёза является присутствие в препарате так называемых эпителиоидных клеток, из которых и развиваются клетки Лангханса. Это происходит при увеличении количества ядер без разделения цитоплазмы, которая только увеличивается в размерах (рисунок 1, г).

Микроскопия позволяет быстро получить результат, но обладает низкой чувствительностью и специфичностью, невозможностью дифференциации кислотоустойчивых микобактерий.

Рисунок 1

Микобактерии туберкулеза
а - метод окраски по Цилю-Нельсену
б - метод люминисцентной микроскопии
в - клетки Лангхаса
г - эпителиоидные клетки

Наиболее распространенным методом выявления микобактерий туберкулеза в нашей стране является культуральный метод. Это "золотой стандарт" бактериологической диагностики туберкулеза, так как чувствительность метода существенно выше микроскопического и дает возможность получить чистую культуру микобактерий для её последующей идентификации и исследования лекарственной устойчивости. Этот метод дает положительные результаты при наличии в исследуемом материале от 20 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл. Однако он трудоемок и длителен в связи с тем, что микобактерии туберкулеза растут очень медленно и их обнаружение может быть зарегистрировано только через 3 недели культивирования.

Исторически сложилось, что питательные среды на яичной основе (Левенштейна-Йенсена, Финна-2, Огавы, Аникина, "Новая", Попеску) получили наибольшее распространение среди плотных питательных сред, применяемых для выделения МБТ. Посев материала на среду Левенштайна-Йенсена проводят в бактериологической лаборатории. Рост первых колоний на классических средах отмечают через 4 - 8 недель. Однако появившиеся в последние годы агаровые среды Миддлбрука (7Н10, 7Н11) позволяют быстрее обнаружить рост микобактерий (от двух до четырех недель) и обеспечивают лучшие возможности для изучения морфологии колоний, чем на яичных средах. Недостатком агаризованных питательных сред является необходимость инкубации посевного материала в термостате с углекислым газом, поэтому агаризованные среды в России практически не применяются.

Следует отметить, что в связи с высокой избирательностью различных штаммов микобактерий и потребностью в полноценных белках до сих пор нет универсальной питательной среды, способной заменить все остальные. В Приказе № 109МЗ РФ для посева диагностического материала на МБТ рекомендуется использовать по одной пробирке международной питательной среды Левенштейна-Йенсена и Финна-2. Однако практика показывает, что кроме указанных сред целесообразно использовать и какую-либо из дополнительных, а посев на три пробирки питательной среды также повышает эффективность культуральной диагностики.

Для полноценной культуральной диагностики туберкулеза необходимо иметь соответствующие помещения и оборудование. Особенно важно наличие центрифуги и антиаэрозольной защитой и способностью обеспечить ускорение 3000g. А также шкафов биологической безопасности для предотвращения внутрилабораторного инфицирования.

Основным недостатком культуральной диагностики туберкулеза является длительность исследования - от трех недель до трех месяцев. Поэтому остаются актуальными дальнейшие исследования по разработке методов ускорения роста микобактерий.

Культуральная диагностика туберкулеза переживает в настоящее время принципиальные изменения, связанные с внедрением в практику полностью автоматизированных систем культивирования МБТ. Главное отличие этих методов - применение жидких питательных сред для культивирования с последующей радиометрической (BACTEC 460), колорометрической (Mb-Bact, Вас- tALERT) и люминесцентной детекцией роста (BACTEC MGIT 960). Рост МБТ на жидкой питательной среде в этих системах удается обнаружить уже через 1 - 2 недели в зависимости от их исходного количества в диагностическом материале. Частота выявления микобактерий так же несколько выше, чем на плотных питательных средах. Автоматизированные системы BACTEC с использованием соответствующих флаконов, содержащих различные противотуберкулезные препараты, позволяют сократить время исследования лекарственной устойчивости микобактерий до 10 - 14 суток.

Из перечисленных автоматизированных систем наиболее эффективна в настоящее время система BACTEC MGIT 960BD. Флаконы MGIT с жидкой питательной средой 7Н9 содержат в придонной части под силиконом флуоресцентный индикатор, "погашенный" высокими концентрациями кислорода. При наличии роста микобактерий в процессе поглощения кислорода индикатор начинает светиться, регистрация флуоресценции в сисиеме BACTEC MGIT производится автоматически. Использование флаконов MGIT возможно и "вручную", тогда регистрацию свечения производят с помощью трансиллюминатора на флаконах MGIT составляет 11 суток.

Основным недостатком BACTEC MGIT, как и других систем BACTEC, является высокая стоимость оборудования (до 100000 долларов США) и флаконов с питательной средой - посев одной пробы диагностического материала стоит до 400 рублей.

Так называемые дефектные по клеточной стенке L-формы микобактерий и других инфекционных патогенов являются результатом изменчивости и основным видом персистирования, то есть переживания в неблагоприятных условиях. Посев на L-формы особенно эффективен при внелегочном туберкулезе, поскольку вегетация МБТ в очагах ВЛТ при повышенном ацидозе и анаэробиозе приводит к снижению их жизнеспособности и ферментативной активности.

Диагноз не может быть поставлен только на основании выявления L-форм микобактерий, но их обнаружение, особенно при верификации методом ПЦР, является весомым аргументом в пользу туберкулезной природы заболевания. В очагах внелегочного туберкулеза наблюдается ранняя L-трансформация микобактерий, поэтому их обнаружение позволяет поставить диагноз на начальных стадиях заболевания.