Молекулярный тест для диагностики туберкулеза

Анализ эпидемической ситуации по туберкулезу начиная с 90‑х годов свидетельствует о подъеме эндемии заболевания. Отмечается значительное увеличение заболеваемости как населения в целом, так и детей, особенно в группах риска [1]

Анализ эпидемической ситуации по туберкулезу начиная с 90?х годов свидетельствует о подъеме эндемии заболевания. Отмечается значительное увеличение заболеваемости как населения в целом, так и детей, особенно в группах риска [1]. Показатели заболеваемости туберкулезом в группах риска превышают общие показатели в 10 раз (заболеваемость в очагах туберкулеза взрослого населения в 2008 г. составила 864,8 на 100 тыс. контактов, детского — 541,0). В связи с этим совершенствование мероприятий по раннему выявлению заболевания в наиболее подверженных угрозе группах населения является важной задачей фтизиатрии.

Многие годы в мире ведется интенсивный поиск антигенных детерминант, присущих только Mycobacterium tuberculosis и позволяющих дифференцировать вакцинальный иммунитет, развивающийся в результате вакцинации бациллой Кальмета–Герена (БЦЖ), иммунные реакции на непатогенные микобактерии и инфекцию, вызванную M. tuberculosis. Обнаружить антигены, свойственные только M. tuberculosis, удалось лишь после завершения исследования по первичной структуре генома M. tuberculosis. Было установлено, что M. tuberculosis кодирует синтез двух секреторных белков ESAT-6 и CFP-10, которые отсутствуют у M. bovis и большинства непатогенных микобактерий. На основании полученных результатов разработаны такие диагностические тесты, как квантиферон и Т-СПОТ. Данные методики нашли широкое применение во многих странах мира, и в настоящее время проводятся исследования по внедрению их в России. К сожалению, одной из трудностей для широкого их использования является большая трудоемкость и высокая себестоимость. Кроме того, в детской практике необходимость забора крови из вены у ребенка также является препятствием для повсеместного внедрения.

В настоящее время в Российской Федерации разработан новый эффективный метод диагностики начальных проявлений туберкулеза — Диаскинтест®. Диаскинтест® это аллерген туберкулезный рекомбинантный в стандартном разведении, представляет собой рекомбинантный белок (ESAT/CFP), продуцируемый генетически модифицированной культурой Escherichia coli BL21(DE3)/pCFP-ESAT. Комбинация двух антигенов, присутствующих в вирулентных штаммах МБТ и отсутствующих в вакцинном штамме БЦЖ и штаммах других непатогенных микобактерий, делает тест высокоспецифичным [5–13]. В отличие от квантиферона и Т-СПОТ, широко применяемых в других странах, Диаскинтест® вводится внутрикожно и вызывает у лиц с туберкулезной инфекцией специфическую кожную реакцию, являющуюся проявлением гиперчувствительности замедленного типа. У лиц, вакцинированных БЦЖ и неинфицированных МБТ, реакция на препарат Диаскинтест® отсутствует [2–4].

Целью нашей работы было проведение крупномасштабных постмаркетинговых исследований на базе НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И. М. Сеченова и контингентов противотуберкулезных диспансеров Самарской и Рязанской областей.

Материалы и методы

Исследование проведено в 2008 – 2009 гг. Методом сплошного одномоментного отбора сформирована группа из 428 больных локальными формами туберкулеза (из них 328 детей и подростков, 100 взрослых в возрасте от 18 до 45 лет) и 1250 детей и подростков из групп риска по заболеванию туберкулезом. На первом этапе исследования у 265 детей и подростков, больных активным туберкулезом, изучены все известные факторы риска и определена роль туберкулинодиагностики в выявлении заболевания. На втором этапе у 1250 детей и подростков из групп риска по заболеванию туберкулезом, направленных на дообследование в противотуберкулезные диспансеры (ПТД) Рязанской и Самарской областей и в консультационное отделение НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И. М. Сеченова, проведено обследование с использованием традиционного метода выявления — туберкулинодиагностики РМ с 2ТЕ в комплексе с новым методом диагностики — введением внутрикожно аллергена туберкулезного рекомбинантного в стандартном разведении. При необходимости проведено дообследование, с проведением компьютерной томографии для исключения локальной малой формы туберкулеза. При отсутствии признаков интоксикации и отрицательном результате на Диаскинтест® проводилось наблюдение по соответствующей группе диспансерного учета без профилактического лечения. Кроме этого, у 163 пациентов, больных локальными формами туберкулеза в различных его проявлениях (63 ребенка и 100 человек старше 18 лет), проведено комплексное обследование с использованием Диаскинтеста® на разных этапах лечения.

На основании полученных данных определены наиболее подверженные угрозе по заболеванию туберкулезом категории населения, подлежащие обследованию на туберкулез с использованием диагностического препарата Диаскинтест®, и разработан алгоритм диагностики с последующим диспансерным наблюдением за данными пациентами. Статистическую обработку проводили при помощи компьютерной программы SPSS 11,0 с вычислением непараметрического критерия Х2 для категориальных величин, T-критерия для сравнения средних.

Сайт предоставляет справочную информацию исключительно для ознакомления. Диагностику и лечение заболеваний нужно проходить под наблюдением специалиста. У всех препаратов имеются противопоказания. Консультация специалиста обязательна!

Основное количество случаев туберкулёза обнаруживается при первичном обращении больного к докторам общей практики. Пациент, чувствуя недомогание, не сразу обращается за помощью к врачу. Появляется субфебрильная температура до 37,5 С, поддерживающаяся постоянно. Спустя некоторое время, присоединяется сухой кашель, иногда с выделением мокроты ( заядлые курильщики чаще всего не обращают на него внимания, ссылаясь на свою вредную привычку ). Вот тогда и стоит забеспокоиться, настало время обратиться к врачу. Каждый врач знает о широкой распространённости туберкулёза, поэтому при обращении пациента с характерными симптомами, должен задать больному контрольные вопросы, такие как:

• Болел ли ранее пациент туберкулёзом
• Болели ли его родственники туберкулёзом
• Находился ли он в контакте с больными туберкулёзом
• Не стоит ли пациент на учете в противотуберкулёзном учреждении по поводу наличия повышенной чувствительности на туберкулин
• Проходил ли ( и когда ) пациент флюорографию лёгких
• Находился ли пациент в заключении или в контакте с людьми, находившимися ранее в тюрьме
• Является ли он мигрантом, бездомным, проживает в неблагоприятных условиях и так далее

Общение с пациентом играет очень важную роль в диагностике туберкулёза. Из рассказа пациента можно узнать некоторые ключевые моменты заболевания, например перенесённые им ранее повторные респираторные инфекции или некоторые признаки скрытой туберкулёзной интоксикации, на которые указывает пациент.
После сбора анамнеза и тщательного обследования пациента приступают к проведению лабораторных и инструментальных исследований.

Туберкулинодиагностика

Тест Манту

Небольшой участок кожи на внутренней поверхности предплечья, а именно средней его трети, обрабатывается этиловым спиртом. Иглу вводят внутрикожно, параллельно поверхности кожи, срезом иглы вверх. Вводится 0,1 мл туберкулина, что составляет одну его дозу. На месте введения туберкулина в коже образуется небольшой ( диаметр 7-8 мм ) белесоватого цвета пузырёк в виде лимонной корочки. Очень важно, чтоб пробу Манту производила специально обученная медицинская сестра, так как при неправильной технике выполнения результаты становятся недостоверными. Результаты пробы оцениваются через 72 часа после проведения пробы. Оценка производится доктором либо специально подготовленной медицинской сестрой. Вначале осматривают предплечье в месте введения туберкулина. Так можно обнаружить отсутствие внешних признаков реакции, наличие покраснения кожи или же скопление инфильтрата.

Нельзя путать покраснение кожи с инфильтратом. Для этого необходимо сравнить толщину кожной складки предплечья над здоровым участком, а затем на месте введения иглы. Отличие заключается в том, что при покраснении складки остаются одинаковой толщины, а при инфильтрате, складка над местом введения туберкулина утолщается. После внешнего обследования производят измерение диаметра реакции при помощи прозрачной линейки.

Выделяют три вида ответной реакции на туберкулин:
1. Отрицательная реакция – характеризуется полным отсутствием покраснения кожи и инфильтрата ( 0 – 1 мм ).
2. Сомнительная реакция – покраснение кожи различного размера или наличие инфильтрата диаметром 2 – 4 мм/
3. Положительная реакция – обязательное наличие инфильтрата диаметром 5 мм и более.

В свою очередь положительные реакции так же можно разделить на несколько видов, в зависимости от диаметра инфильтрата:

• Слабоположительная – 5 – 9 мм.
• Средней интенсивности – 10 – 14 мм.
• Выраженная – 15 – 16 мм.
• Гиперергическая – у детей и подростков 17 мм и более, а у взрослых от 21 мм. Так же к этой категории относятся везикулонекротические реакции на коже.
• Усиливающаяся – реакция, сопровождаемая увеличением инфильтрата на 6 мм и более по сравнению с предыдущей пробой.

Лабораторные методы выявления микобактерии туберкулёза

1. Сбор и обработка мокроты: процедуру производят в специально подготовленном помещении, подальше от посторонних лиц. Наиболее распространённым методом является забор материала из гортани с помощью тампона. Слизь собирают во время кашля либо отхаркивания мокроты. Тампон помещается в специальный герметический контейнер и немедленно направляется на микробиологическое исследование. Так же сбор материалов производят при исследовании промывных вод бронхов и/или желудка, исследовании спинно-мозговой жидкости, плевральной жидкости, бронхоскопии, биопсии плевры, биопсии лёгкого.

2. Микроскопия мокроты:

Является самым быстрым и дешёвым методом выявления микобактерии туберкулёза. Метод основан на способности микобактерий сохранять свою окраску даже после обработки различными кислотными растворами. Так, они выявляются при помощи микроскопа в окрашенных мазках мокроты. На ряду с простой микроскопией используется и флюоресцентная микроскопия, в основу которой заложено использование, для выявления микобактерий, ультрафиолетовых лучей.

Молекулярно-генетические методы диагностики микобактерии туберкулёза

1. Полимеразная цепная реакция: заключается в расшифровке генетического материала микобактерии туберкулёза. Предназначен для обнаружения возбудителя в мокроте и распознавания разновидности бактерий. Метод обладает особой чувствительностью и специфичностью.

2. Определение лекарственной резистентности возбудителя
Чувствительными к какому либо определённому препарату считаются те штаммы микобактерий туберкулёза, на которые данный препарат в минимальной концентрации оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие.
Устойчивыми или резистентными к данному препарату называются те штаммы микобактерий, которые способны размножаться при воздействии на них препарата в минимальной или повышенной концентрации.

3. Серологические методы диагностики туберкулёза
Серологические методы исследования компонентов плазмы крови основаны на обнаружении многочисленных антигенов, относящихся к туберкулёзу, а также разнообразных иммунных ответов, вызванных различными формами туберкулёза.

4. Анализ крови
Гемоглобин и эритроциты в большинстве случаев остаются неизменёнными, за исключением случаев, сопровождаемых острой потерей крови. Показателем, свидетельствующим о наличии активного туберкулёзного процесса, является скорость оседания эритроцитов. Ускоренная СОЭ характерна не только для свежего активного туберкулёза, но и для обострения хронического процесса.
Остальные показатели анализа крови сильно варьируют в зависимости от характера повреждения лёгких.

5. Анализ мочи
В анализе мочи у больного туберкулёзом лёгких не отмечается заметных отклонений от нормы. Изменения появляются только при туберкулёзном поражении почек и мочевыводящих путей.

6. Рентгенологические методы диагностики


Наиболее часто при диагностике туберкулёза лёгких используются следующие методы:

• Рентгенография
• Рентгеноскопия
• 
  Флюорография
• Томография

7. Эндоскопические методы диагностики туберкулёза

• Трахеобронхоскопия
• Бронхоскопический лаваж
• Торакоскопия ( плевроскопия )
• Трансбронхиальная биопсия
• Трансторакальная игловая биопсия
• Плевральная пункция и пункционная биопсия плевры

Все данные методы исследования доступны только в специализированно оснащённых медицинских учреждениях.

Воздушно-капельное поражение возбудителем, известным как палочка Коха или микобактерия, органов дыхательной системы и является причиной легочной формы туберкулеза. Заражению ежегодно подвергаются более 1 млн. детей и около 9 млн. взрослого населения планеты, а по данным Всемирной организации здравоохранения из 10 человек 3 уже являются его носителями. Именно поэтому так важно проходить ежегодное тщательное обследование на туберкулез каждому, независимо от возраста, социального положения и половой принадлежности. Современные методы диагностики туберкулеза легких позволяют вовремя определить форму, степень тяжести и спрогнозировать последствия заболевания, назначить полноценное интенсивное лечение. И не стоит думать, что поставленный диагноз туберкулез — это приговор. Ранее выявление туберкулеза и возможности, которыми обладает на сегодняшний день медицина, способствуют выздоровлению более 70% всех обратившихся пациентов.

Когда назначают обследование на туберкулез легких

Современная палочка Коха и ее многочисленные штаммы, которых насчитывается более 74, очень отличается от ранее открытой микобактерии. Способность вирулентной бациллы проникать в здоровые клетки носителя и оставаться в организме человека незамеченной, жизнеспособность и устойчивость к кислым средам и дезинфицирующим средствам очень усложняют задачу врачам и сотрудникам лаборатории.

Диагностика туберкулеза легких требует все новых возможностей, чтобы провести полноценное исследование. Это касается и людей, которые входят в особую группу риска и имеют предрасположенность к возникновению туберкулеза: ВИЧ-инфицированные пациенты или с поставленным диагнозом СПИД, с зависимостью от алкогольной, наркотической и никотиновой продукции, при наличии сахарного диабета, бронхиальной астмы и наследственного фактора. Нуждаются в медицинском контроле и новорожденные дети от инфицированной матери, несовершеннолетние и подростки до 17 лет, люди пенсионного и преклонного возраста.

Как проявляется туберкулез легких

Опасность, которую представляет собой латентная форма туберкулеза, состоит в том, что на ранней стадии выявление заболевания не всегда возможно по причине отсутствия выраженных симптомов. В остальных случаях, болезнь активно прогрессирует. Как диагностировать туберкулез, и на какие признаки стоит обратить внимание:

1. сухой продолжительный кашель или с выделением мокроты, хрипы;
2. постоянная температура тела 37°C;
3. бледный цвет лица и уставший вид;
4. снижение аппетита и потеря веса;
5. одышка и боль в боку;
6. обильное выделение пота.

У женщин способами определения туберкулеза легких являются нарушения менструального цикла и частые головные боли, со стороны мочевыделительной системы возможен цистит или кровянистые выделения в моче.

Ранняя диагностика туберкулеза у детей и подростков

Люди старшего поколения способны объективно оценивать свое состояние здоровья и следить за ним, обращаться за помощью к специалистам. Несовершеннолетние дети еще не понимают всю опасность инфекционных болезней, поэтому в дошкольных и образовательных учреждениях постоянно проводятся мероприятия по профилактике и предупреждению туберкулеза.

Клинический осмотр — основной первичный вид обследования. Врач педиатр или фтизиатр обязан выслушать жалобы маленького пациента и внимательно ознакомиться с его медицинской картой для определения врожденных патологий дыхательной системы, хронических болезней щитовидной железы. Важную роль играет целостность и цвет кожных покровов, нормальный показатель температуры — 36,6°C — 36,7°C и отсутствие хрипов, одышки при прослушивании стетоскопом.

Если общее состояние оценивается врачом, как удовлетворительное, дальнейшие методы ранней диагностики туберкулеза у ребенка предусматривают обязательное проведение пробы Манту и вакцинация БЦЖ один раз в год. Родители не доверяют составу прививки и отказываются от введения ребенку туберкулина. В этом случае они обязаны предоставить в ближайшее время результаты анализа на туберкулез, который был сделан вместо Манту.

Выявление туберкулеза легких у взрослых

Частые простуды или обострения хронических заболеваний, инфекции и воспалительные процессы, которые спровоцированы переохлаждением, тяжелой физической работой или низким иммунитетом, могут стать причиной туберкулеза у старшего поколения. Реакция Манту — недостаточно эффективное исследование для взрослых. Используется вакцинация уже после лечения туберкулезной инфекции или при наличии ярко выраженных признаков заболевания. Существуют диагностические методы обследования, как распознать туберкулез у взрослых.

Чаще всего на ежегодном медицинском осмотре врачи назначают флюорографию или рентгенографию легких. Обзорный метод визуализации грудной клетки, дает представление о состоянии органов дыхания в виде черно-белого снимка, на основании которого может быть обнаружен очаг туберкулеза. Подозрение рентгенолога или выявленные патологии дыхательной системы потребует дополнительного обследования.

Туберкулинодиагностика

С целью предупреждения распространения заболеваемости среди младшего поколения применяется подкожная инъекция или проба Манту, которая проводится каждый год. Ребёнок получает вещество туберкулин или штамм возбудителя туберкулеза, созданный в искусственных лабораторных условиях. Ослабленная микобактерия должна вызвать реакцию со стороны иммунной системы на месте укола. Оценивают результат проведенной пробы Манту через 72 часа:

1. отрицательный — до 1 мм
2. сомнительный — 2-5 мм;
3. положительный — более 6 мм;
4. слабоположительный — 5-9 мм;
5. средний уровень интенсивности — 10-14 мм;
6. выраженный — до 16 мм;
7. гиперергические. У детей и подростков — более 17 мм, у взрослых — более 21 мм.

Кроме этого существуют и ложные показатели. Учитывают и предыдущие данные. Даже отрицательный результат не является гарантией отсутствия палочки Коха в организме. Но даже при таких недостатках, проба Манту — самая распространенная профилактика и диагностика туберкулеза у детей и подростков на ранних стадиях. Недопустима вакцинация при аллергии и бронхиальной астме, воспалительном процессе и заболеваниях органов пищеварения, сахарном диабете.

Тесты на туберкулез

Заменить традиционные методы профилактики и раннего выявления туберкулеза можно с помощью иммуноферментного анализа крови, который часто используется вместо пробы Манту. Принцип проведения данного исследования состоит в иммунной реакции организма, антител, к антигенам IgG и IgM возбудителя, микобактерии. В процессе анализа в среду с предполагаемыми туберкулезными палочками M. Tuberculosis помещают содержащие окрашивающее вещество защитные клетки, которые взаимодействуют с источником инфекции и передают вирусу часть фермента.

Метод диагностики ПЦР. Для лабораторного изучения лучше использовать мокроту. Под воздействие высокой температуры выделяют чужеродное ДНК. Для того, чтобы определить микобактерии или их штаммы, сравнивают образец с уже полученными ранее. Диагностированный туберкулез можно получить уже через 5 часов после сдачи исходного материала. Процедуру часто применяют для детей с противопоказаниями для проведения туберкулинодиагностики или для подтверждения диагноза.

Рентгеноскопическое исследование

Назначается на ежегодном медицинском обследовании у представителей старшего поколения. Не допускаются к процедуре дети из-за высокой дозы радиации для еще недостаточно окрепшего иммунитета. Лучевая диагностика предназначена для скрининга органов грудной клетки, поиска очагов туберкулеза и профилактики других патологий.

Рентгенография и флюорография органов грудной клетки. С помощью специального экрана рентгеновские лучи проходят через тело обследуемого человека, обрабатывается теневое изображение и переносится на пленку. Проявление занимает несколько минут. Цифровая флюорография выводит на монитор уже готовую картинку, которая распечатывается в черно-белом формате на принтере или сохраняется в электронном виде. На снимке флюорографии виден очаговый, инфильтративный и хронический запущенный туберкулез в виде очагов поражения.

Компьютерная и магнитно-резонансная томография легких. Методы более информативного характера для точного выявления туберкулеза, которые дают возможность с точностью определить размеры очагов поражения и жидкостные скопления, патологии. Чувствительность в 100 раз превышает флюорографию и рентген.

Общий анализ крови при туберкулезе

Изучение состава и количественных показателей жидкой соединительной ткани, которая, так или иначе, сталкивается с бациллой M. Tuberculosis, важно для ранней диагностики заболевания. При туберкулезе у пациента наблюдается умеренная анемия, уровень гемоглобина у мужчин ниже 130, у женщин менее 120. В период обострения легочной формы изменяется зернистость лейкоцитов и их количество увеличивается от 20% до 50%, число эозинофилов, молодых иммунных клеток, уменьшается.

Но основной показатель активности туберкулеза — это скорость оседания эритроцитов или СОЭ. Эта проба показывает способность эритроцитов, плотность которых больше плазмы, оседать под действием гравитации. В здоровом организме норма у женщин не должна превышать 15 мм/час, у мужчин — 10 мм/час. Повышение СОЭ от 20 мм/ч и до 80 мм/ч указывает на большое количество иммуноглобулинов и низкий уровень альбумина в крови, что означает активизацию защитных сил организма под действием чужеродных клеток.

Используют часто и лейкограмму, которая основана на изменении белкового состава крови во время острого воспалительного процесса. Учитываются показатели таких лейкоцитов, как нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты. Обследование на заболевание туберкулез легких выделяет три фазы поражения иммунной системы организма:

• нейтрофильная. Активная защитная реакция. Количество нейтрофилов увеличивается, уровень моноцитов и лимфоцитов снижается, эозинофилы отсутствуют;
• моноцитарная. Попытка преодолеть туберкулезную инфекцию. Число нейтрофилов низкое, прослеживаются единичные эозинофилы, лимфоциты увеличиваются;
• восстановления. Наблюдается после выздоровления пациента. Количество лимфоцитов и эозинофилов увеличено, но их показатели приходят в норму.

В сравнении с ИФА и ПЦР анализами, обнаружен сам возбудитель туберкулеза не будет, но изменения состава крови будет достаточно, чтобы заподозрить наличие в организме воспалительного процесса и продолжить обследование, направленное на поиски источника.

Метод выявления кислотоустойчивых микобактерий

Особенностью клеточной стенки туберкулезной палочки является отсутствие реакции на хлорсодержащие средства и кислые среды. Поэтому проведение диагностических мер в лабораторных условиях часто выполнить невозможно. Заменяет микроскопические методы исследования мазка в таких случаях бактериоскопия или окрашивание мокроты.

Микроскопия мазка или материала, содержащего КУБ, осуществляется по Граму и способом окрашивания, известного, как метод Циля-Нильсена. Вирус Коха сначала подвергается воздействию красного вещества карбол-фуксина, который проникает в мембрану клетки, а потом сверху обрабатывается раствором метиленовым синим. Положительным результатом наличия туберкулезной палочки станет присутствие в мазке на синем фоне красных микобактерий. В современной медицине чаще используется аурамин-родамин. После ультрафиолетового спектра бациллы приобретают желтый оттенок.

Бактериологическое исследование промывных вод бронхов

Используется, как дополнительный способ забора мокроты и метод выявления в ней возбудителя туберкулеза, когда у больного не получается собрать материал самостоятельно или количество выделений недостаточно для проведения обследования. Запрещено назначать людям пенсионного возраста, при заболеваниях сердечно-сосудистой системы и бронхиальной астме, детям до 15 лет.

Процедура предусматривает местную анестезию дыхательных путей и введение в гортань с помощью специального шприца подогретого физиологического раствора для повышения уровня секреции. После проведенных манипуляций мокрота у пациента интенсивно выделяется естественным путем и собирается медицинскими работниками в пробирку для последующего посева и выращивания микобактерий.

Пункционная биопсия легкого

Для определения патологического процесса, протекающего в легких, и получения исходного образца, назначается инвазивная диагностика туберкулеза у взрослых. Она направлена на изучение причин кашля с кровью, внутреннего легочного кровотечения, явной дыхательной недостаточности, взятие материала слизистых, бронхиального секрета или мокроты, получения образца пораженного участка.

Обязательным условием пункционной биопсии является четкий контроль над выполняемыми действиями через ультразвуковой аппарат или с помощью рентгеновских лучей. Суть процедуры состоит в местном обезболивании области грудной клетки и введения иглы Сильвермена для захвата и отделения фрагмента легочной ткани. После проведения биопсии определяется степень и форма поражения дыхательной системы. В запущенных случаях прибегают к открытому хирургическому вмешательству под общим наркозом.

Бронхоскопия

Чтобы изучить и оценить степень поражения легочной системы, включая трахеи, бронхи и слизистые оболочки, в медицинской практике все чаще отдают предпочтение эндоскопической диагностике туберкулеза. К показаниям для проведения процедуры относится длительный кашель, который наблюдается у человека более 1 месяца, выделения мокроты с кровью, выявленные ранее патологии в легких.

Во время обследования необходима местная анестезия и мышечные релаксанты, чтобы обеспечить свободный вход в дыхательные пути гибкого тубуса со светопроводным устройством. Взятие материала слизистой или секрета из трахеи и бронхов способствует изучению цитологического состава мокроты на наличие инородных клеток туберкулезной палочки.

Конкурирующие интересы: М. Тебрюгге является членом Редакционного совета PLOS ONE. Это не изменяет приверженность авторов PLOS ONE редакционным политикам и критериям.

Проанализированы данные: M. Tebruegge NR KK ANJ JS SW M. Tsolia BK. Вклад в рукопись рукописи: М. Тебрюгге Н.Р. К.К. АНДЖ СВ С. М. Цолия Б.К. Задуманное исследование: MT. Разработка исследования, анализ данных и подготовка рукописи: М. Тебрюгге Н.Р. К.К. АНДЖ СВ С. М. Цолия Б.К.

В настоящее время существуют только ограниченные данные о доступности и клиническом использовании молекулярных и иммунологических тестов на туберкулез (ТБ) в европейской обстановке.

В период с июня по декабрь 2013 года проводились онлайн-опросы членов группы педиатрической туберкулезной сети — European-Trialsgroup (ptbnet) и Tuberculosis-Network-European-Trialsgroup (TBnet). В обе сети входят клиницисты, микробиологи, эпидемиологи и исследователи, преимущественно находящиеся в Европе.

Как иммунологические, так и молекулярные тесты на туберкулез широко доступны в Европе. Анализ золота QuantiFERON-TB более широко используется, чем анализ T-SPOT.TB, что может отражать трудности интеграции анализа ELISPOT в обычные лабораторные установки. Хотя анализы Xpert MTB / RIF оптимизированы и лицензированы исключительно для анализа образцов мокроты, в клинической практике они обычно используются для недыхательных образцов. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, как текущие испытания молекулярного туберкулеза влияют на уход и лечение пациентов в повседневной клинической обстановке.

Обнаружение туберкулеза Mycobacterium с помощью микробиологических методов остается золотым стандартом для диагностики туберкулезного (ТБ) заболевания у людей, также называемого активным туберкулезом. Однако традиционные методы твердой и жидкой культуры могут занять несколько недель, чтобы получить положительный результат [1], [2]. В последние годы стали доступны некоторые коммерческие молекулярные анализы для выявления M. tuberculosis на основе принципа полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые имеют преимущество, что потенциально значительно сокращает время, необходимое для подтверждения подозрения на заболевание туберкулезом [1] , [3] — [9].

В декабре 2010 года Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) опубликовала официальное одобрение анализа Xpert MTB / RIF (Cepheid, Саннивейл, Калифорния, США) для диагностики ТБ [10]. Анализ основан на качественной вложенной ПЦР в реальном времени, которая позволяет обнаруживать комплекс M. tuberculosis в клинических образцах и одновременно обнаруживает мутации в гене rpoB, которые связаны с резистентностью к рифампицину [1], [4], [11], [12].

Чтобы облегчить внедрение и внедрение анализа Xpert MTB / RIF во всем мире, были согласованы льготные цены для более чем 140 стран с низким и средним уровнем дохода. По данным ВОЗ, по состоянию на сентябрь 2013 года 95 стран, имеющих право на льготное ценообразование, были закуплены в общей сложности 1843 инструментальных средства GeneXpert и более 4,2 миллиона картриджей Xpert MTB / RIF [13]. Однако, хотя ВОЗ собирает и регулярно публикует данные о ходе глобального развертывания МБР / РИФ Xpert, это исключительно включает данные стран, имеющих право на льготные цены, что исключает все западные страны и большинство стран Северной и Южной Европы. Поэтому в настоящее время доступны только очень ограниченные данные о доступности и клиническом использовании анализов Xpert MTB / RIF и других молекулярных анализов в европейской обстановке.

Тесты на интерферон-гамма-релиз (IGRA) были лицензированы для клинического применения в 2001 году [14]. IGRA лицензированы исключительно для диагностики скрытой инфекции туберкулеза и полагаются на обнаружение интерферона-гамма, продуцируемого сенсибилизированными Т-клетками в ответ на стимуляцию антигенными штаммами M. tuberculosis [15] — [20]. В настоящее время два ИГРР являются коммерчески доступными: анализ QuantiFERON-TB Gold (Cellestis / Qiagen, Carnegie, Australia) и анализ T-SPOT.TB (Oxford Immunotech, Abingdon, Великобритания), которые основаны на форматах ELISA и ELISPOT соответственно [17]. На сегодняшний день имеется немного данных о доступности IGRA по всей Европе, поскольку ВОЗ регулярно не собирает данные, относящиеся к этим иммуноанализам.

Целью этого исследования было определить наличие молекулярных микробиологических и иммунологических диагностических тестов для туберкулеза в европейских странах, установить, как эти тесты используются в клинической практике, и определить, как молекулярные тесты в настоящее время финансируются по всей Европе.

Инструмент онлайн-опроса был разработан и первоначально запрограммирован индивидуально всеми авторами для выявления потенциальных технических проблем. После этого инструмент опроса был опробован пятью членами ptbnet, базирующимися в разных европейских странах, которые не были частью исследовательской группы. На данном этапе не было выявлено никаких технических проблем, но были внесены небольшие изменения в формулировку вопроса на основе предоставленной обратной связи. Таблица S1 (дополнительное цифровое содержимое) содержит резюме окончательного инструмента обследования.

STAT (версия 12, StataCorp; College Station, TX, US) и Prism (версия 5.0; GraphPad; La Jolla, CA, US) использовались для анализа данных и построения фигур. Точные тесты Фишера использовались для оценки различий между подгруппами участников. Значения P 50 (29,3%)].

На рисунке 1 представлен доступ участников к ряду микробиологических и иммунологических тестов на туберкулез. Подавляющее большинство респондентов заявили, что они имеют доступ как к твердым, так и к жидким культурам микобактерий (91,1% и 95,5% соответственно). Более четверти (26,8%) заявили, что у них не было доступа к анализу Xpert MTB / RIF; менее половины (44,6%) заявили, что они имеют доступ к этому анализу с анализом, проводимым в их собственном учреждении. Среди респондентов, которые исключительно заботятся о взрослых, 62,3% заявили, что они имеют доступ к анализу Xpert MTB / RIF (выполняются в своем собственном учреждении или в качестве теста на отрыв), а 32,1% заявили, что у них нет доступа. Среди респондентов, предоставляющих исключительно уход за детьми и подростками, 70,4% заявили, что они имеют доступ к анализу Xpert MTB / RIF, а 24,1% заявили, что у них нет доступа. Не было статистически значимой разницы между этими двумя подгруппами относительно доступа к анализу Xpert MTB / RIF (p = 0,39). Среди подгруппы респондентов из университетской больницы 66,7% заявили, что они имеют доступ к анализу Xpert MTB / RIF, в то время как 32,4% заявили, что у них нет доступа. Среди подгруппы респондентов из региональной больницы или первичной медико-санитарной помощи 73,7% заявили, что они имеют доступ к анализу Xpert MTB / RIF, в то время как 23,7% заявили, что у них нет доступа. Статистически значимой разницы между этими двумя подгруппами не было, что касается доступа к анализу Xpert MTB / RIF (p = 0,40). Среди университетской подгруппы, имеющей доступ к анализу Xpert MTB / RIF, 62,9% заявили, что анализ проводился в их собственном учреждении, в то время как 37,1% заявили, что анализ проводился в другом месте (тест на отрыв); среди региональной больницы и подгруппы, основанной на первичной медико-санитарной помощи, с доступом к анализу Xpert MTB / RIF, 60,7% заявили, что анализ проводился в их собственном учреждении, а 39,3% заявили, что анализ проводился в другом месте (p = 1,00).

На рисунке 2 приведены ответы участников относительно их способности получить доступ к анализу Xpert MTB / RIF в зависимости от страны. В большинстве стран один или несколько респондентов имели доступ к анализу на дому. Все респонденты из Бельгии (n = 5), Литва (n = 1), Португалия (n = 2), Румыния (n = 7), Сербия (n = 1) и Словения (n = 2) заявили, что они не иметь доступ к анализу на дому; однако один или несколько респондентов из этих стран заявили, что они имеют доступ к анализу в качестве теста на отрыв, показывая, что анализ доступен, по крайней мере, на национальном уровне. Все респонденты из Чешской Республики (n = 3) и все респонденты из Дании (n = 5) заявили, что не имеют доступа к анализу Xpert MTB / RIF, как по собственному, так и по расследованию; однако все чехи и четыре из пяти респондентов из Дании указали, что они имеют доступ к другому коммерческому тесту на основе ПЦР на туберкулез.

Что касается финансирования Xpert MTB / RIF или альтернативного теста на молекулярный туберкулез, респонденты чаще всего заявляли, что расходы покрываются за счет национального страхования / национального здравоохранения (37,7%), за которым следуют больница (22,6%) и здоровье пациента страхование (21,8%); меньшая доля (10,9%) указала, что расходы были покрыты за счет общественного здравоохранения (например, программа борьбы с туберкулезом); ни один из участников не указал, что сам пациент должен был покрыть расходы.

Насколько нам известно, это первое исследование для оценки современного ландшафта иммунологических и молекулярных микробиологических анализов для диагностики туберкулеза по всей Европе. Из результатов этого исследования можно сделать ряд интересных выводов. Во-первых, в европейских странах широко распространен доступ к традиционным методам микробиологической культуры и IGRA. Интересно, что гораздо большая часть участников опроса имела доступ к анализу Gold Quantinefer-TB Gold по сравнению с анализом T-SPOT.TB, что может отражать большие трудности интеграции анализа ELISPOT в обычную диагностическую лабораторию.

Большинство участников имели доступ к испытаниям на молекулярный туберкулез. Интересно отметить, что наши результаты показывают, что больницы в больницах в больнице не имели больше шансов получить доступ к анализу Xpert MTB / RIF, чем их коллеги, работающие в учреждениях первичной медико-санитарной помощи или региональных больницах. Хотя четверть участников не имели доступа к анализу Xpert MTB / RIF, результаты показывают, что значительная часть участников имела доступ к ряду других коммерческих и некоммерческих тестов на основе ПЦР. Кроме того, результаты показывают, что анализ Xpert MTB / RIF был доступен специалистам здравоохранения, которые ухаживают за больными туберкулезом в большинстве европейских стран, хотя и в некоторых только на региональном или надрегиональном уровне (т. Е. При отклонении теста). Этот аспект важен, поскольку новые данные свидетельствуют о том, что централизованное размещение аналитического инструмента (например, в контрольной лаборатории на региональном уровне) может быть значительно менее полезным для управления пациентами, чем использование анализа в условиях почти пациента (например, точка -обслуживание в амбулаторной клинике ТБ), поскольку первые могут продлить время, необходимое для значительного результата теста (потенциально до тех пор, пока не будут приняты управленческие решения), и создает дополнительные проблемы, связанные с увязкой результатов [11], [22 ].

Интересно отметить, что значительная часть участников использовала анализ Xpert MTB / RIF для анализа множества невоспалительных образцов, несмотря на то, что анализ был оптимизирован и полностью лицензирован для анализа образцов мокроты [23]. Важно отметить, что, хотя имеются данные, свидетельствующие о том, что чувствительность анализа Xpert MTB / RIF относительно высока с образцами CSF и биопсии, в предыдущих отчетах было показано, что эффективность является неоптимальной с образцами стула, плевральной, перитонеальной и совместной жидкостью [24] — [32]. Примечательно, что недавняя обновленная политика ВОЗ в отношении использования анализа Xpert MTB / RIF для диагностики легочного и внелегочного туберкулеза рекомендует, чтобы этот анализ следовало использовать вместо традиционной микроскопии и культуры в качестве первоначального диагностического теста для образцов CSF у пациентов, предположительно имеют туберкулезный менингит [33]. Кроме того, обновление политики также рекомендует использовать этот анализ в качестве замены для обычной практики (включая микроскопию, культуру и / или гистопатологию) для тестирования лимфатического узла и других тканей у пациентов, предположительно имеющих внелегочный туберкулез. Вместе с тем в документе также говорится, что обе рекомендации основаны на данных очень низкого качества и подчеркивают, что эти рекомендации не применяются к другим биологическим образцам (включая табурет, мочу и кровь).

Удивительно, но значительная часть участников, которые имели доступ к анализу Xpert MTB / RIF, указали, что они не использовали результат резистентности теста для принятия решений о клиническом управлении на регулярной основе. Однако из этого трудно сделать твердые выводы, поскольку полезность результата устойчивости Xpert MTB / RIF зависит от распространенности резистентности рифампицина в популяции, к которой применяется тест (т. Е. Более высокая положительная прогностическая ценность в популяциях с высокими пропорциями (MDR) -TB). Однако наши данные показывают, что участники из восточноевропейских стран, где показатели МЛУ-ТБ, как правило, выше, чем в других европейских странах [34], [35], скорее всего, не будут регулярно принимать управленческие решения в отношении устойчивости на основе ПЦР чем их коллеги из других частей Европы. Это подчеркивает, что необходимы дальнейшие исследования для определения того, как текущие испытания молекулярного туберкулеза влияют на уход и лечение пациентов в повседневной клинической обстановке в Европе, особенно в связи с недавним исследованием из Южной Африки, в котором подчеркивается ограниченное влияние Xpert MTB / RIF анализ управленческих решений и, в конечном счете, результатов пациентов [36].

Частота ответов в этом опросе была неоптимальной. Тем не менее, показатель ответа 35,0% считается средним до хорошего в контексте онлайн-опросов [37]. Опрос проводился среди медицинских работников и исследователей, которые являются частью специализированной сети по борьбе с туберкулезом и имеют особый интерес и / или опыт в области ТБ, и поэтому данные могут не полностью отражать ситуацию в соответствующей стране. Примечательно, что большинство респондентов работали в условиях третичного ухода, где наличие диагностических тестов на ТБ, вероятно, будет больше, чем на уровне первичной или вторичной помощи. Таким образом, результаты могут переоценить наличие тестов в странах Восточной Европы, где многие больные туберкулезом получают уход за пределами службы третичного ухода. Однако в странах с низкой распространенностью ТБ большинство подозреваемых и подтвержденных случаев активного туберкулеза получают уход на третичном уровне, что подтверждает обоснованность результатов обследования, особенно в отношении стран Западной и Северной Европы. Возможно, что специалисты в области здравоохранения с особенно высокой нагрузкой реже участвуют в этом опросе, что, возможно, привело к предвзятости. Для некоторых стран число участников опроса было сравнительно небольшим, и поэтому некоторые данные не могут быть репрезентативными для всей страны. Тем не менее, данные показывают, что, хотя молекулярные анализы могут быть недоступны некоторым отдельным специалистам в области здравоохранения, они доступны, по крайней мере, на региональном или надрегиональном уровне в большинстве европейских стран.

Как иммунологические, так и молекулярные микробиологические тесты для диагностики туберкулеза широко доступны по всей Европе. Анализ золота QuantiFERON-TB более широко используется, чем анализ T-SPOT.TB. Тест Xpert MTB / RIF доступен для специалистов в области здравоохранения в большинстве европейских стран; большинство медицинских работников, оказывающих помощь больным туберкулезом, которые не имеют доступа к этому анализу, имеют доступ к другим молекулярным тестам для ТБ. В клинической практике анализ Xpert MTB / RIF обычно используется для анализа невоспалительных образцов, несмотря на то, что анализ оптимизирован для анализа образцов мокроты. Значительная часть медицинских работников указала, что они не использовали результат резистентности Xpert MTB / RIF для клинических решений управления на регулярной основе. Поэтому необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, как текущие испытания молекулярного туберкулеза влияют на уход и результат лечения пациентов в обычной клинической обстановке.

Резюме итогового инструмента обследования.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Авторы хотели бы поблагодарить членов ptbnet и TBnet, которые любезно приняли участие в этом опросе, и в частности д-ра. Bolette Søborg, Lise Jensen, Uros Krivec, Ozge Yilmaz и Nicolaus Schwerk для пилотного опроса.