Что изучает генетика вирусов

Вирусам, как и всем живым организмам, свойственны наследственность и изменчивость. Основной особенностью вирусного генома является то, что наследственная информация у вирусов может быть записана как на ДНК, так и на РНК. Геном ДНК-содержащих вирусов двухнитевой (исключение составляют парвовирусы, имеющие однонитевую ДНК), несегментированный и проявляет инфекционные свойства. У вирусов, принадлежащих к родам Poxvirus и Hepadnavirus геном представлен двумя цепочками ДНК разной длины. Геном большинства РНК-содержащих вирусов однонитевой (исключение составляют реовирусы и ретровирусы, обладающие двунитевыми геномами) и может быть сегментированным (представители родов Retrovirus, Orthomyxovirus, Arenavirus и Reovirus) или несегментированным.

У другой группы вирусов РНК не способна транслировать генетическую информацию непосредственно на рибосомы и функционировать как иРНК. Такие РНК служат матрицей для образования иРНК, т.е. при репликации первоначально синтезируется матрица (+РНК) для синтеза –РНК. Такой тип РНК определяют как минус-нить и обозначают –РНК (негативный геном). У вирусов этой группы репликация РНК отличается от транскрипции по длине образующихся молекул: при репликации длина РНК соответствует материнской нити, а при транскрипции образуются укороченные молекулы иРНК. Молекулы +РНК проявляют инфекционность, а –РНК не проявляют инфекционные свойства и для воспроизведения должны транскрибироваться в +РНК.

Исключение составляют ретровирусы, которые содержат однонитевую +РНК, служащую матрицей для вирусной РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). При помощи этого фермента информация переписывается с РНК на ДНК, в результате чего образуется ДНК-провирус, интегрирующий в клеточный геном.

Так же как и у прочих форм жизни нуклеиновые кислоты вирусов подвержены мутациям. Фенотипически мутации вирусного генома проявляются изменениями в антигенной структуре, неспособности вызывать продуктивную инфекцию в чувствительной клетке, термостабильностью, изменением размера и формы бляшек, образуемых под агаровым покрытием. Большинству мутаций присущи реверсии к дикому типу, причем каждая мутация имеет характерную частоту реверсий, которую можно точно измерить. У вирусов выделяют спонтанные и индуцированные мутации.

Скорость спонтанного мутагенеза в ДНК-геномах значительно ниже (10 -8 – 10 -11 на каждый включенный нуклеотид), чем у РНК-геномных (10 -3 – 10 -4 на каждый включенный нуклеотид). Более высокая частота спонтанных мутаций связана с низкой точностью репликации РНК-геномов, которая вероятно связана с отсутствием у РНК-репликаз корректирующей активности, свойственной ферментам, реплицирующим ДНК. Наиболее часто спонтанные мутации наблюдаются у ретровирусов, что связано с более высокой частотой сбоев в обратной транскрипции, не способных к самокоррекции.

Индуцированные мутации у вирусов получают при действии различных химических и физических мутагенов, которые подразделяют на действующие in vivo и in vitro.

Вирусные мутации классифицируют по изменениям фенотипа и генотипа. По фенотипическим проявлениям мутации вирусов разделяют на четыре группы:

1. Мутации, не имеющие фенотипического проявления.

2. Летальные мутации, т.е. полностью нарушающие синтез или функцию жизненно важных белков и приводящие к утрате способности к репродукции.

3. Условно летальные мутации, т.е. мутации с потерей способности синтезировать определенный белок или с нарушением его функции только в определенных условиях.

4. Мутации, имеющие фенотипическое проявление, например изменение размеров бляшек под агаровым покрытием или термостабильности.

По изменению генотипа мутации подразделяют на точечные (локализующиеся в индивидуальных генах) и генные (затрагивающие более обширные участки генома).

Заражение вирусами чувствительных клеток носит множественный характер, т.е. в клетку проникает сразу несколько вирионов. При этом вирусные геномы в процессе репликации могут кооперироваться или интерферировать. Кооперативные взаимодействия между вирусами представлены генетическими рекомбинациями, генетической реактивацией, комплементацией и фенотипическим смешиванием.

Генетическая рекомбинация чаще встречается у ДНК-содержащих вирусов или РНК-содержащих вирусов с фрагментированным геномом (вирус гриппа). При генетической рекомбинации происходит обмен между гомологичными участками вирусных геномов.

Генетическая реактивация наблюдается между геномами родственных вирусов с мутациями в разных генах. При перераспределении генетического материала формируется полноценный геном.

Комплементация происходит когда один из вирусов, инфицирующих клетку, в результате мутации синтезирует нефункциональный белок. Немутантный вирус, синтезируя полноценный белок, восполняет отсутствие его у мутантного вируса.

Фенотипическое смешивание происходит при смешанном заражении чувствительной клетки двумя вирусами, когда часть потомства приобретает фенотипические признаки, присущие двум вирусам, при неизменном генотипе.

При множественном инфицировании чувствительной клетки между вирусами могут возникать интерферирующие взаимодействия. Интерфернцией вирусов называют состояние невосприимчивости к вторичному заражению клетки, уже инфицированной вирусом. При гетерологической интерференции инфицирование одним вирусом полностью блокирует возможность репликации второго вируса в пределах одной клетки. Механизмы гетерологической интерференции связаны с угнетением адсорбции другого вируса путем блокирования или разрушения специфических рецепторов, а так же с ингибированием трансляции мРНК любой гетерологичной мРНК в инфицированной клетке. Кроме того, первичное заражение может индуцировать образование интерферона, ингибирующего репликацию второго вируса.

Гомологическая интерференция, т.е. интерференция между гомологичными вирусами, характерна для многих вирусов, особенно при повторных пассажах in vitro и при высокой множественности инфицирования. В таких условиях образуется много дефектных вирусных частиц, обычно не способных к репродукции. Однако размножение дефектных вирусов возможно при совместном заражении с полноценным вирусом (вирус-помощник). При этом дефектный вирус может вмешиваться в репликативный цикл вируса-помощника и образовывать дочерние дефектные интерферирующие (ДИ) вирусные частицы. ДИ-частицам присущи три основных свойства: дефектность (повреждение в важных генах), способность к интерференции (ДИ-частицы препятствуют репликации полноценного вируса или других гомологичных вирусов) и способность к самообогащению за счет стандартного вируса. Циркуляция ДИ-частиц и коинфекция с полноценным вирусом вызывают вялотекущие, длительные формы инфекции.

Кроме взаимодействий, происходящих между вирусами, при смешанной инфекции происходят также взаимодействие между вирусом и клеткой-хозяином. При взаимодействии клеток с ДНК-содержащими вирусами может происходить вирусная трансформация клетки. В результате трансформации у клеток изменяются морфологические, биохимические и ростовые характеристики, может появляться способность к опухолевому росту. Представляет интерес трансформация клеток под действием РНК-геномных ретровирусов. У ретровирусов трансформация и репликация не являются взаимоисключающими, поскольку трансформированные клетки способны реплицировать вирус. Геномы трансформирующих вирусов обычно интегрируют с геномом трансформируемой клетки.

Дата добавления: 2015-04-25 ; просмотров: 877 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Лекция 7

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ВИРУСА

Вирусы являются одним из излюбленных объектов молекулярной генетики благодаря простому строению и малой молекулярной массе их геномов, которая в 10 6 раз меньше массы генома эукариотической клетки. Организация генетического аппарата у ряда вирусов, например у SV40, настолько сходна с таковой генов эукариотичес­кой клетки, что получила название минихромосомы. Минихромосома широко используется для изучения орга­низации и репликации ДНК.

Число генов у вирусов значительно варьирует: от 3—4 генов у просто устроенных вирусов (парвовирусы) до 150 генов и больше у сложно устроенных (вирус оспы). Геном вирусов животных является гаплоидным, за ис­ключением ретровирусов, которые имеют диплоидный геном, представленный двумя идентичными молекула­ми РНК. У вирусов с фрагментарным геномом (вирусы гриппа, реовирусы) каждый фрагмент обычно представ­ляет собой один ген.

Так же, как и геном эукариотической клетки, ДНК-геном ряда вирусов животных имеет мозаичную структуру, при которой смысловые последовательности чередуются с неинформативными последовательностями. Механизм сплайсинга при формировании иРНК широко распростра­нен и среди вирусов, имеющих ядерную локализацию тран­скрипции (адено-, папова-, герпесвирусы), поскольку фер­менты, осуществляющие сплайсинг, находятся в ядре. Одна­ко сплайсинг был обнаружен и у РНК-содержащих вирусов. Например, у вирусов гриппа происходит сплайсинг транскриптов 7-го и 8-го генов; в результате сплайсинга и сдви­га рамки трансляции продуктами каждого из этих генов являются по два уникальных белка.

В составе генов ДНК-содержащих вирусов есть регуляторные участки, в том числе промотор, контролирую­щие функцию структурных генов. Сильными промоторами являются концы многих вирусных ДНК, представляющие собой длинные концевые повторы, сильный промотор име­ют гены тимидинкиназы вирусов оспы и герпеса. Эти промоторы используются в генной инженерии для усиле­ния транскрипции изучаемого гена.

СПОСОБЫ УВЕЛИЧЕНИЯ ИНФОРМАЦИОННОЙ ЕМКОСТИ ВИРУСНОГО ГЕНОМА

У многих вирусов молекулярная масса синтезирую­щихся белков превышает теоретически рассчитанную. Этот феномен объясняется наличием у вирусов механиз­мов, позволяющих получить развернутую генетическую информацию при максимальной экономии генетического материала; подобные механизмы выработаны в процессе эволюции вирусов как генетических паразитов.

Способами увеличения генетической информации яв­ляются: 1) двукратное считывание одной и той же иРНК, но с другого инициирующего кодона; 2) сдвиг рамки трансляции; 3) сплайсинг; 4) транскрипция с перекрываю­щихся областей ДНК и др.

Трансляция может происходить без сдвига рамки и со сдвигом рамки. Генетический код является триплетным, это означает, что три нуклеотида, составляющих триплет, или кодон, кодируют одну аминокислоту. В том случае, если триплеты сохранены и генетический код не изме­нился, то при трансляции с двух разных инициирующих кодонов будут синтезироваться полипептиды, представ­ляющие собой укороченную копию первого полипептида (трансляция без сдвига рамки).

В том случае, если произошел сдвиг на один или два нуклеотида, образуются новые триплеты (кодоны) и появ­ляется новый генетический код. В этом случае одна мо­лекула иРНК может транслироваться с образованием двух уникальных белков, т. е. таких белков, у которых нет идентичных аминокислотных последовательностей.

Сплайсинг со сдвигом рамки широко используется у ряда вирусов (вирусы гриппа, парамиксовирусы, буньявирусы, аденовирусы, паповавирусы, парвовирусы и др.). Например, все три иРНК аденоассоциированного вируса образуются при транскрипции одного гена и имеют общий З'-конец; самая короткая иРНК образуется путем сплайсинга и транслируется с образованием трех струк­турных белков, остальные две иРНК транслируются с образованием неструктурных белков. В результате сплай­синга и сдвига рамки иРНК 7-го и 8-го генов вируса гриппа транслируются с образованием двух белков: поли­пептидов М, и М₂ (продукты 7-го гена) и NSi и NS₂ (продукты 8-го гена). Белки NS_t и NS₂ имеют лишь первые 10 идентичных аминокислот, а затем — уникаль­ные аминокислотные последовательности. Один и тот же ген парамиксовирусов (вирус Сендай) кодирует два уникальных белка: структурный белок Р и неструктурный белок С.

Одним из способов экономии генетического материала является нарезание полипептида-предшественника на участки разной длины, в результате чего образуются раз­ные полипептиды с перекрывающимися аминокислотными последовательностями. Подобный механизм нарезания имеет место у аденоассоциированных вирусов и у SV40.

Таким образом, число реальных генов превосходит молекулярную массу генома. Основанный на длине генома расчет числа генов неизменно приведет к ошибочным ре­зультатам. Более точные представления о числе генов можно получить путем биохимического и генетического анализов.

ОСНОВНЫЕ ПРОЦЕССЫ, КОНТРОЛИРУЮЩИЕ НАСЛЕДСТВЕННОСТЬ И ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВИРУСОВ

Модификации. Модификациями называются не насле­дуемые (фенотипические) изменения у вирусов, обуслов­ленные клеткой-хозяином. Эти изменения лежат в основе адаптации вируса к новому хозяину и преодоления зави­симого от хозяина ограничения. Модификации нуклеино­вых кислот вирусов осуществляют клеточные ферменты, ответственные за ограничение (рестрикцию) репродукции вируса.

Мутации. В основе изменчивости вирусов лежат му­тации, т. е. изменения состава и последовательностей нуклеотидов вирусного генома. Мутации происходят у всех вирусов, независимо от того, является ли их ге­нетическим аппаратом ДНК или РНК. В результате мутаций отдельные вирионы могут приобретать новые свой­ства. Дальнейшая судьба таких вирусов зависит от естественного отбора, сохраняющего популяцию, наиболее приспособленную к условиям существования.

Мутации могут иметь разные последствия. В одних случаях они ведут к изменению фенотипических прояв­лений в нормальных условиях. Например, увеличивается или уменьшается размер бляшек под агаровым покры­тием; увеличивается или ослабляется нейровирулентность для определенного вида животных; вирус становится более чувствительным к действию химиотерапевтического агента и т. п.

В других случаях мутация является летальной, так как вследствие ее нарушается синтез или функция жизненно важного вирусспецифического белка, например вирусной полимеразы.

В некоторых случаях мутации являются условно ле­тальными, так как вирусспецифический белок сохраняет свои функции в определенных, оптимальных для него, условиях и теряет эту способность в неразрешающих (непермиссивных) условиях. Типичным примером таких мутаций являются температурно-чувствительные (tempe­rature sensitive) — ts-мутации, при которых вирус теряет способность размножения при повышенных температурах (39—42° С), сохраняя эту способность при обычных температурах выращивания (36—37° С).

По своему механизму мутации могут быть тоже раз­ными. В одних случаях происходит делеция, т. е. выпа­дение одного или нескольких нуклеотидов, в других слу­чаях происходит встраивание одного или нескольких нуклеотидов, а в некоторых случаях — замена одного нуклеотида другим.

Мутации могут быть прямыми и обратными. Прямые мутации меняют фенотип, а обратные мутации — ревер­сии — его восстанавливают. Возможны истинные реверсии, когда обратная мутация происходит в месте первичного повреждения, и псевдореверсии, если мутация происходит в другом участке дефектного гена (интрагенная супрессия) или в другом гене (экстрагенная супрессия). Реверсия не является редким событием, так как ревертанты обычно более приспособлены к данной клеточной системе. Поэто­му при получении мутантов с заданными свойствами, например вакцинных штаммов, приходится считаться с воз­можной их реверсией к дикому типу.

Мутации носят случайный характер и объясняются статистическими законами.

В качестве физических мутагенов наиболее часто при­меняется ультрафиолетовое облучение, так как его энергия сопоставима с энергией химических связей. Реже приме­няются более жесткие виды облучения — рентгеновское и γ-облучение, а также обработка вирусных суспензий нейтронами, протонами, электронами и ядрами гелия, так как они вызывают сильные разрушения вирусных геномов и их инактивацию.

В качестве химических мутагенов применяют аналоги оснований (бромурацил, бромдезоксиуридин, 2-аминопурин, нитрозогуанидин и пр.), алкилирующие и флуорес­цирующие соединения (профлавин), интеркалирующие агенты (актиномицин, этидий бромид), азотистую кислоту, гидроксиламин и многие другие.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И НЕГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ ВИРУСАМИ

Как в естественных, так и в экспериментальных усло­виях одна клетка может быть заражена не одним, а несколькими вирусами. В процессе такой смешанной инфекции могут иметь место различные формы взаимо­действия как между вирусными геномами, так и между продуктами генов. При взаимодействии геномов могут наблюдаться такие формы генетических взаимодействий, как множественная реактивация, рекомбинация, пересортировка генов, кросс-реактивация, гетерозиготность. При взаимодействии на уровне продуктов генов могут иметь место негенетические взаимодействия: комплементация, интерференция, фенотипическое смешивание и др.

Множественная реактивация. Вирусная инфекция мо­жет возникнуть при заражении клетки несколькими ви-рионами с поврежденными геномами вследствие того, что функцию поврежденного гена может выполнять вирус, у которого этот ген не поврежден. Этот феномен был вна­чале обнаружен на бактериофагах и получил название множественной реактивации. В основе множественной реактивации лежит кооперативный процесс, при котором вирионы с поражением разных генов дополняют друг друга путем генетической рекомбинации, в результате чего репродуцируется исходный неповрежденный вирус. Эффективность множественности реактивации зависит от многих причин: степени повреждения генома вирионов, числа проникших в клетку вирионов, концентраций их в определенных участках клетки, аутоинтерференции поврежденных вирионов. Для множественной реактивации важное значение имеет расстояние между вирионами с поврежденными геномами внутри клетки. Обработка ви­рионов двухвалентными ионами металлов, ведущая к их агрегации, усиливает множественную реактива­цию.

Рекомбинация. Генетической рекомбинацией называют обмен генетическим материалом, происходящий между родительскими вирусами. Возможен обмен полными ге­нами (межгенная рекомбинация), так и участками одного и того же гена (внутригенная рекомбинация). Образую­щийся вирус-рекомбинант обладает свойствами, унаследо­ванными от разных родителей.

Обычно рекомбинируемые штаммы обладают харак­терными признаками, которые обозначаются как маркеры. Например, были получены рекомбинанты между вирусами полиомиелита, обладающие повышенной устойчивостью и повышенной чувствительностью к гуанидину, разной нейровирулентностью, разной устойчивостью к повышенной температуре, разной чувствительностью к ингибиторам сы­вороток лошадей и коров и т. п. Для получения рекомбинантов используют штаммы, содержащие два или боль­шее число маркеров.

Тест рекомбинации применяют для генетических иссле­дований вирусов. С его помощью возможно построение генетических карт вирусов, в которых определяется, в ка­ких участках генома произошли мутации, а также в услов­ных единицах измеряется расстояние между разными мутациями.

Пересортировка генов. Вариантом рекомбинации явля­ется феномен, получивший название пересортировки генов. Она наблюдается при генетических взаимодействиях меж­ду вирусами, имеющими сегментированный геном. Обра­зующиеся при этом гибридные формы вирусов называют реассортантами. Реассортанты вирусов гриппа получают при совместном культивировании вирусов с разными гена­ми гемагглютинина и нейраминидазы. В этом случае из общего потомства путем нейтрализации соответствующих антигенов можно выделить интересующие исследователя варианты.

Существуют определенные группировки (констелляции или созвездия) генов, которые в данной системе клеток более стойки и делают вирус более жизнеспособным.

Сходные процессы пересортировки генов имеют место у вирусов гриппа типов А, В и С и у других вирусов с фрагментарным геном — у буньявирусов, аренавирусов (однонитчатые РНК) и реовирусов (ротавирусов) (двунитчатая РНК). Однако эти процессы не столь интенсивны и доступны изучению, как у вирусов гриппа.

Гетерозиготность. При совместном культивировании двух штаммов вируса может происходить формирование вирионов, содержащих в своем составе два разных генома или по крайней мере один полный геном и часть второго генома. Это явление названо гетерозиготностью.

Комплементация. Комплементация (дополнение) явля­ется таким видом негенетического взаимодействия при смешанной инфекции двумя вирусами, которое стимули­рует репродукцию обоих партнеров или одного из них, но не изменяет генотипы вирусов. Принцип комплементации заключается в том, что вирус снабжает партнера недоста­ющими компонентами, обычно белками, структурными или неструктурными.

Комплементация широко распространена среди вирусов и встречается как между родственными, так и неродствен­ными вирусами. Феномен тесно связан с проблемой де­фектности вирусов.

Поскольку в вирусной популяции помимо стандартных обычно присутствуют дефектные неинфекционные вирус­ные особи, в частности дефектные частицы, утратившие часть генетического материала, комплементация имеет место в инфекционном цикле многих вирусов и заключа­ется в том, что члены популяции снабжают друг друга продуктами генов, которые дефектны у партнеров. Отличие комплементации от генетической рекомбинации заключается в отсутствии обмена генетическим материалом.

Комплементация встречается и у неродственных ви­русов, принадлежащих к разным семействам. Одним из семейств, вирусы которого наиболее часто участвуют в комплементации, является семейство аденовирусов. В од­них системах аденовирусы могут действовать как дефект­ные вирусы, в других — как помощники. Например, в культуре клеток почек макак резусов аденовирусы могут репродуцироваться только в присутствии SV40, который является в данном случае вирусом-помощником. В других системах сами аденовирусы действуют как вирусы-по­мощники, а вирусом-сателлитом является аденоассоци-ированный вирус, относящийся к семейству парвовирусов. Репродукция этого вируса полностью зависит от комплементирующего действия аденовирусов. Вирус гепатита В является помощником для дельта-агента, который по­крывается его наружным белком — HBs-антигеном. Соче­тание обоих вирусов обнаружено при наиболее тяжелых формах гепатита.

Возможна не только межцистронная, но и внутрицистронная комплементация в том случае, когда один ген кодирует несколько белков.

Фенотипическое смешивание. При совместном культиви­ровании двух вирусов может наблюдаться феномен фенотипического смешивания, когда геном одного вируса бывает заключен в капсид, состоящий частично или пол­ностью из белков другого вируса.

Фенотипическое смешивание наблюдается при смешан­ной инфекции,многими вирусами, причем эти вирусы мо­гут быть как близкими друг другу (например, вирусы гриппа А и В или разные серологические подтипы вируса гриппа А), так и весьма далекими (онковирусы и рабдовирусы).

РЕСТРИКТАЗЫ И ФИЗИЧЕСКИЕ КАРТЫ ВИРУСОВ

Подлинную революцию в физическом картировании ге­номов вирусов произвело применение рестриктаз и секвенирование вирусных геномов. Рестриктазы имеют иск­лючительное значение в молекулярной генетике вообще и генетической инженерии в частности. Их открытие (1968—1970 гг.) впервые дало возможность специфически расщеплять ДНК на строго определенные фрагменты, дос­тупные для препаративного выделения и анализа.

Рестриктазы или эндодезоксирибонуклеазы — это прос­то организованные белки, являющиеся ферментами, ши­роко распространенными среди прокариотов и участву­ющими в генетических процессах. В отличие от экзонук-леаз, отщепляющих концевые нуклеотиды или свободные остатки фосфорной кислоты, эндонуклеазы расщепляют молекулу ДНК изнутри, обычно — в местах, где преобла­дают пиримидиновые основания. Рестриктазы характери­зуются высоковыраженной специфичностью, распознавая строго определенные последовательности нуклеотидов в двунитчатой ДНК.

Число новых рестриктаз стремительно нарастает и со временем, по-видимому, будут обнаружены рестриктазы, узнающие любую последовательность нуклеотидов.

Использование разных рестриктаз позволяет получать фрагменты разной величины, которые затем разделяются и анализируются путем электрофореза в агарозных или полиакриламидных гелях. Сочетание рестрикционного ана­лиза с другими методами позволяет составить физические карты геномов вирусов. Физические карты вирусных геномов обозначают взаимное расположение генов, их границы, локализацию начала репликации, промоторов, лидеров, экзонов и интронов, сигнальных последователь­ностей и других генетических элементов.

Генетический код для синтеза белков вируса SV-40 записан не на одной, а на обеих нитях ДНК, а транскрипция разных генов идет в разных направлениях.

В настоящее время полностью расшифрованы нуклеотидные последовательности отдельных генов и целых ге­номов методом секвенирования (от англ. sequence — последовательность). Если речь идет о РНК-содержащих вирусах, то предварительным условием для дальнейшего их анализа является переписка РНК на ДНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы), после чего генетический материал может быть под­вергнут рестрикционному анализу.

Проектное задание к модулю

В качестве проектного задания студентам предлагается написание рефератов по следующим темам:

1. Природа дефектных вирусных геномов. Вирусы-сателлиты.

2. Вирусная интерференция

3. Необычные свойства ретровирусов

4. Трансформация клетки опухолеродными ДНК-вирусами

5. Классификация и основные свойства вирусов гриппа

6. Индукция специфического иммунного ответа на вирусы

7. Особенности репродукции пикорнавирусов

8. Семейство тогавирусов. Особенность репродукции и инфекционного процесса.

9. Вирус клещевого энцефалита.

10. Вирус бешенства

11. Вирусная персистенция

12. Основные свойства парамиксовирусов

13. Вирус кори. Биология возбудителя. Особенности патогенеза

14. Аденовирусы, их репликация и связь с другими вирусами

16. Пути распространения вирусных болезней растений.

17. Прионы. Возбудители или провокаторы или….

18. Вироиды как вирусоподобные инфекционные агенты.

19. Вирусы, вызывающие респираторные инфекции. Сравнительная характеристика

20. Место вирусов в биосфере.

21. Бактериофаги. Их морфологическое многообразие и взаимодействие с бактериями.

22. Атипичная пневмония и возможность происхождения новых вирусов

23. Роль вирусов в возникновении злокачественных опухолей

24. Особенности транскрипции РНК- содержащих вирусов.

25. Морфогенез вирусов или морфологические превращения в процессе репродукции.

Тест рубежного контроля

Читайте также: АБВГД и ПП- агрессия бактерий, вирусов, грибов, дрожжей и простейших паразитов. Ареалы распространения вирусов. Вирусы. Морфология и физиология вирусов Воспроизводство вирусов, теория мемов и психогенетика. Генетика Генетика Генетика Генетика микроорганизмов Генетика пола. Генетика психических заболеваний Занятие №45. Морфология и культивирование в курином эмбрионе вирусов

1. Структура вирусного генома

2. Генетические признаки вирусов

3. Изменчивость вирусов и селекция

4. Генная инженерия

Генетика наука о наследственности и изменчивости живых организмов.

Наследственные признаки очень стойкие и передаются, из поколения в поколение от родителей к потомкам через материальные носители наследственности – нуклеиновые кислоты.

Но в тоже время организмы в мире не изолированы, а взаимосвязаны с внешней средой и другими организмами. И под влиянием этих факторов происходят изменения отдельных признаков в организмах как на генетическом уровне (наследственная изменчивость), так и не связанные с изменением генетического аппарата (не наследственная изменчивость).

Наследственность и изменчивость тесно связаны между собой и являются противоположными сторонами единого процесса эволюции живых существ. Следует отметить, что вирусы в значительной мере способствовали развитию генетики как науки, так как они являются удобной моделью для изучения состава, репликации, функций нуклеиновых кислот, явлений изменчивости, что связано с простым строением и быстрым размножением (репродукция).

В развитии биологии в том числе и вирусологии и генетики важную роль сыграли такие открытия:

1. Расшифровка структуры молекулы ДНК

2. Расшифровка синтеза белка

3. Расшифровка генетического кода

Эти открытия сравнивают с открытием атомной энергии и ХХ век называют веком биологии в связи с тем, что были раскрыты интимные стороны жизни – тончайшее строение и функции нуклеиновых кислот.

1 Структура вирусного генома

Долгое время считалось, что носителем наследственной информации является белок. Но в 1944 г. Эвери доказал, что трансформации бактерий обусловлены нуклеиновой кислотой. В вирусологии значение нуклеиновой кислоты как носителя информации доказали Хергии и Чейз в 1952 году Они заметили что заражение бактерий может вызвать фаг, лишенный белковой оболочки. .Функцию вирусного генома выполняет или ДНК или РНК. ДНК или РНК могут быть одно или двухцепочные

Геном вирусов может быть представлен 10 вариантами:

1. Одноцепочной нефрагментированной РНК + цепью т.е. выполняет роль информационной РНК (пикорна- и тогавирусы, ретровирусы)

2. Одноцепочная нефрагментированная РНК – цепь ( рабдо-, парамиксовирусы)

3. Одноцепочная фрагментированная РНК – цепь (ортомиксовирусы)

4. Одноцепочная фрагментированная кольцевая РНК (бунъя вирус)

5. Двухцепочная фрагментированная РНК (реовирусы)

6.Одноцепочная ДНК нефрагментированная (парвовирусы )

7. Одноцепочная ДНК циркулярная (цирковирусы)

8.Двухцепочная ДНК нефрагментированная (герпес-, аденовирусы)

9.Двухцепочная ДНК кольцевая (папиломавирусы)

Соединяясь между собой в определенной последовательности, триплеты образуют генетический код.

Но количество возможных вариантов кодонов (64) превышает количество аминокислот (21)Это значит, что на каждую аминокислоту приходится 2-3 кодона для страховки, исключение - триптофан и метионин они кодируется одним триплетом.

Нуклеиновая кислота вирусов состоит из участков отличающихся друг от друга определенной последовательностью и количеством триплетов – эти участки называют генами и каждый ген ответственен за синтез одного определенного белка.

Число генов в нуклеиновой кислоте у разных вирусов варьирует в широких пределах. Например, вирус ящура и гриппа имеют по 3-5 генов у вируса полиоэмилита 10, а у вируса ньюкаслской болезни -37, вируса оспы-400 генов, а у человека-10 млн.

2 Генетические признаки вирусов.

Генетические признаки это любые наследственно-передаваемые свойства, которым можно дать качественную и количественную оценку, и которые проявляются в определенных условиях среды. Вирусы обладают определенными генетическими признаками, совокупность которых составляет генотип вируса, а совокупность проявленных генетических признаков составляет фенотип вируса.

Изучение генетических признаков вирусов имеет большое практическое значение, как в теоретическом, так и в практическом отношении. По этим признакам вирусы классифицируются, отбираются необходимые штаммы. Эти признаки или свойства используют в диагностической и лечебно-профилактической работе.

Но генетические признаки вирусов изучены недостаточно полно т. к. не все признаки, заложенные в генотипе, могут проявиться в конкретных условиях. И еще это связано с неоднородностью генотипов вирусных частиц в одной популяции.

Генетические признаки вирусов условно разделяют на: групповые, видовые и штаммовые.

Групповые признаки – это тип нуклеиновой кислоты, тип симметрии, размер и морфология, тип капсидной оболочки, количество капсомеров, наличие суперкапсидной оболочки, устойчивость к жирорастворителям или наличие липидов, антигенная специфика

Видовые признаки – патогенность для того или иного вида животного, тропизм, устойчивость к кислотности среды (рН), способность к гемагглютинации, характер ЦПД.

Штаммовые (внутривидовые) признаки - вирулентность для животных и куриных эмбрионов, терморезистентность, гемагглютинирующая активность, антигенная активность, характер бляшек, устойчивость к различным химическим и физическим факторам.

Каждый генетический признак вируса принято обозначать латинскими буквами:

Температура размножения rct - 40°

Инфекционная доза - ИД 50

Способность размножаться в культуре клеток, вызывая ЦПД – ТС

Устойчивость к рН среды - РН

3 Изменчивость вирусов и селекция.

В процессе репродукции вирусов в потомстве могут появляться вирионы, отличающиеся по своим свойствам от исходных родительских. Изменения могут касаться величины, формы патогенности, антигенной структуры, тропизма. Вновь возникшее свойства могут быть наследуемые т.е. связанные с изменениями в геноме вируса (генетические) или не наследуемые т.е. не связанные с изменениями в геноме вируса (фенотипические) .

Фенотепическая форма изменчивости или негенетическаясвязана с особенностями клетки хозяина, в которой происходит репродукция. У вирусов позвоночныхизменения связаны прежде всего со строением суперкапсида, который формируется на оболочках клетки . Поэтому при образовании оболочки включаются клеточные липиды, белки , углеводы. Так в оболочку вируса гриппа , культивированного на куриных эмбрионах , встраиваются белки алантоиса.

К фенотипическим формам изменчивости относят и негенетические взаимодействия вирусов между собой, это:

Фенотипическое смешивание происходит при заражении клетки двумя разными вирусами, при этом потомство преобретает признаки обоих вирусов. Например при заражении вирусом гриппа и вирусом нъюкаслской болезни . При этом в потомстве выявляются вирионы содержащие антигены и вируса гриппа и вируса нъюкаслской болезни.

Негенетическая реактивация (восстановление активности). при этом инактивированный вирус у которого разрушены белки -ферменты , необходимые для репродукции способен репродуцироватся за счет фермента у другого вируса даже у которого поврежен геном.

Комплементация это когда белки, кодируемые геномом одного вируса, способствуют репродукции другого вируса. Например предоставление фермента вирусу у которого его нет. Таким образом , комплементация приводит к формированию полноценного вириона, но она происходит только между близкородственными вирусами. комплементация может быть односторонняя , когда один вирус обеспечивает другого необходимыми продуктами для репродукции. Двусторонняя, когда каждый из вирусов не способен к самостоятельной репродукции.

К наследственно закрепленным формам изменчивости относят мутации и генетические взаимодействия вирусов. Причины сравнительно высокой способности вирусов к этому виду изменчивости , является огромная численность популяции вирусов, высокая скорость репродукции, слабая защищенность нуклеопротеида от внешних воздействий.

Мутация – это изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке генома вируса.

В основе мутаций лежат следующие процессы:

1) Инверсия – изменение последовательности расположения одного или нескольких нуклеотидов (КОТ – ТОК) . Аналогично тому как меняется смысл вновь полученного слова, так и меняется состав гена, а значит при синтезе получится другой белок и другие свойства у вируса.

2) Замена одной или нескольких пар нуклеотидов другими( КОТ-КОМ).

3) Вставки – в цепь встраивается один или несколько нуклеотидов (ОКО-ОКНО).

4) Делеция – выпадение из цепи одного или нескольких нуклеотидов (ОКНО-ОКО)

5) Дупликация- дублирование одного или нескольких нуклеотидов

По обратимости необратимые при которых изменяется фенотип вируса и такие мутанты бястро вытесняют другиа популяции вируса.

Обратимые мутации при котрых происходит обратная мутация в месте первичной

По протяженности мутации могут быть точечными, захватывать лишь один триплет. Такие мутации могут не проявляться за счет того, что одна аминокислота кодируется– несколькими кодонами. Могут быть аберрационными , которые захватывают значительный участок гена. Такие мутации проявляются всегда.

По природе мутации бывают спонтанные и индуцированные.

Спонтанные – самопроизвольные, возникают в природе при воздействии на геном вируса различных естественных мутагенных факторов или ошибок действия ферментов ДНК-полимеразы или РНК-полимеразы

Одной из важных причин, приводящих к изменению вирусов в естественных условиях ,является коллективный иммунитет, который препятствует дальнейшему размножению вируса, вызвавшего инфекцию – (спад эпизоотии). В иммунном организме могут репродуцироваться антигенные варианты этого вируса, которые не обезвреживаются специфическими антителами. Следовательно, в процессе эпизоотии выживают вирионы с измененной антигенной структурой, которые в последствии после селекции образуют новую популяцию вируса, способную инфицировать иммунный организм.

Хорошо известна естественная изменчивость вируса гриппа, который проявляется появлением различных антигенных вариантов вируса. Способствующим фактором является фрагментированная РНК. В результате мутации и рекомбинации между вирусами гриппа человека и животных, образуются новые варианты вируса.

Вирус ящура имеет 7 типов, а внутри десятки вариантов и в ходе эпидемии происходит смена типов и вариантов, что затрудняет специфическую профилактику болезни.

Помимо антигенной изменчивости может наблюдаться изменчивость патогенных свойств – повышение или понижение вирулентности. Например вирус ньюкаслской болезни сначала вызывал смертельное заболевание птицы. В настоящее время регистрируют легкое течение данной болезни. такой вирус называется природно-ослабленный штамм и используется для приготовления вакцины. К сожалению, бывают и противоположные факты: усиление вирулентности вируса в природных условиях (так произошло с вирусом бешенства и вируса миксоматоза кроликов).

Индуцированные (искусственные)мутации – возникают в результате направленных воздействий экспериментатора на вирус различными физическкими и химическими мутагенами а также при адаптации вируса к необычной биосистеме.Такое воздействие на вирус вызывают мутаций в десятки и сотни раз эффективнее, чем природные факторы. Действие мутагенов имеет определённую направленность, что позволяет заранее предвидеть, куда действует мутаген и какие последствия вызовет.

1) Физические мутагены: повышенная температура способствует удалению пуринов из ДНК и замена другими; УФО – поглощается нуклеиновой кислотой, изменяет структуру пиримидинов

2).Химические мутагены могут действовать на нуклеиновую кислоту во время её репликации (аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований) или вступать в реакцию с покоящейся молекулой нуклеиновой кислотой, но требующие для выявления (формирования) мутаций, последующей её репликации (азотистая к-та, гидроксиломин) и т.д.

Пастер 1822-1895 – ослабил вирус бешенства, пассируя через организм кролика.

Рекомбинация – это обмен генетическим материалом между двумя близкими, но отличающимися по наследственным свойствам вирусами.

Рекомбинации могут быть:

межгенные – обмен полными генами,1 внутригенная – обмен участками генов. Образующися рекомбинантный вирус преобретает свойства обоих вирусов. Рекомбинанты вирусов получаются только при скрещивании близких по свой ствам вирусов родственных.

Рекомбинации между одноцепочными НК и между двухцепочными НК

В экспериментальных условиях гибридные (рекомбинантные) формы можно получить при совместном введении в клетку:

1) двух жизнеспособных вирусов ;

2) живого и инактивированного вируса

3) живого вируса и вирусной нуклеиновой кислоты , выделенной из другого штамма;

4) одновременно двух нуклеиновых кислот от разных вирусов.

Таким образом, получают гибриды с признаками не встречающиеся в природе. Так в результате гибридизации инактивированного УФ-лучами вируса гриппа типа А, образующего бляшки, с инфекционным вирус гриппа не обладающего такой способностью получили бляшкообразующий инфекционный вирус. Открыты гибридизации между вирусами гриппа животных и человека, ящура и реовирусов.

К генетическим взаимодействиям вирусов относят также

множественную реактивацию( восстановление активности), которая наблюдается при заражении клетки несколькими вирионами с поврежденным геном. При этом функцию повркжденного гена выполняет вирус, у которого этот ген не поврежден . Таким образом вирионы дополняют друг друга путем генных рекомбинаций и в результате репродуцируется неповрежденный вирус.

Кросс-реактивация-Сходна с предыдущей но отличается тем что один вирус используют в неизменным а другой инактивируют при этом наблюдается восстановление активности инактивированного генома геномом неповрежденного вируса

Пересортировка генов наблюдается среди вирусов с фрагментированным геномом. При этом образуются группировки генов которые позволяют более благоприятно жить вирусу в данной биосистеме.

Гетерозиготность. феномен , наблюдающийся в случае репродукции в клетке вирионов отличных по генетическим признакам. При этом потомство может обладать частично свойствами одного, частично другого родителя и частично смешаными свойствами ( вирус гриппа и вирус болезни Нъюкасла)

Транскапсидация наблюдается при репродукции в клетке нескольких неродственных вирусов. При этом вирусный геном неспособный сентезировать белки капсида прекрепляется в неизменном виде к геному другого вируса и "переезжает" сним в другую клетку.

Популяции вирусов в результате генетических взаимодействий: рекомбинаций, пассажей или воздействия мутагенов и тд. генетически неодинаковы. В общей массе мутированных, есть вирионы, которые не изменились или реверсировали (восстановили свои свойства). В результате дальнейшей репродукции ( за счет них) популяция вирусов может восстанавливать свои первичные свойства.

Поэтому проводят селекцию вирусов, используя различные методы отбора вирионов и создание однородной популяций .

1. Выделение культуры вируса из отдельных бляшек на ХАО куриного эмбриона или на культуре клеток . Так как считается, что 1 бляшка это потомство 1 вириона.

2. Методом предельных разведений . Вирус разводят до 1 вириона в определенном объеме культуральной жидкости и этой дозой заражается культура клеток или куриный эмбрион. В результате получается популяции из одного вириона.

3. Методом избирательной адсорбции и элюции. Вирусную суспензиюсмешивабт с сорбентом ,на который прилипают только измененные вирионы. Затем сорбент с вирионами отмывают , а вирионы снимают с сорбента .

4. Методом пассажей в измененных условиях культивирования. вирусы продолжают культивировать на нечуствительной живой системе в течение 100-200 пассажей . за это время останутся только измененные вирионы , которые уже не смогут восстановить свои первоначальные патогенные свойства , даже если их ввести в бывшую чуствительную систему

4. Генная инженерия

Благодаря детальному изучению структуры ДНК, синтеза белка появилась отрасль науки – генная инженерия – цель которой создание новых генетических структур. В отношении вирусологии эта отрасль работает в направлении:

1. Создание новых вирусных геномов.

2. Получение вирусных протективных белков , на которые образуются защитные антитела в организме и получение интерферона.

Конечной целью первого направления является создание новых вакцин против вирусных болезней.

Если ввести такой рекомбинант в организм он будет вызывать образование защитных антител к двум вирусам. Таким образом получают рекомбинантные вакцины.

Для получения определённого вида белка например интерферрона или антигенных белков вируса поступают аналогично. Получают ген из природной ДНК вируса или клетки ,ответственный за синтез белка и встраивают в вектор (вирус, фаг, плазмида).

Вектор вводят в клетку в которой вектор размножается, давая необходимое количество геномов содержащих ген ответственный за синтез определенного белка.

Затем под различными воздействиями геном запускает синтез этого белка и он получается в необходимых количествах (интерферон, субъединичные вакцины ,инсулин и т.д.)

Таким образом в промышленных масштабах можно получать дешовые белковые препараты необходимые в любой отрасли (медицина, ветеринария, пищевая промышленность и тд).