Что такое гибридный вирус

За последние десятилетия биология и медицина совершили огромный рывок вперед. Вмешательство в гены человека и создание химер, гибридов совершенно разных организмов сегодня уже не фантастика. К сожалению, эти достижения можно использовать не только в мирных целях. Биотехнологии могут стать оружием, намного более опасным, чем ядерное, и покончить с человечеством несколькими разными способами.

Так получилось, что экосистемы в различных районах нашей планеты приходили в равновесие тысячи лет. Сотни видов животных, насекомых, растений и т.д. приспособились друг к другу и поддерживают жизнеспособность окружающей среды.

В ноябре 2011 года Министерство сельского хозяйства США объявило об опасности биотерроризма с использованием инвазивных видов. Противник может распространить чужеродные для определенной экосистемы организмы и тем самым нанести значительный экономический ущерб и вред людям. В качестве примера может служить барбарис. Это неприхотливое растение может расти в широтах от Крыма до Санкт-Петербурга. Само по себе оно безвредно и выращивается садоводами. Однако оно может быть промежуточным носителем опасной грибковой болезни - стеблевой ржавчины. Эта болезнь зерновых встречается редко, но приводит к огромным потерям сельскохозяйственной продукции – от 50% до 100%.

Нетрудно догадаться, что зараженный ржавчиной барбарис способен нанести государству больший ущерб, чем санкции и авиабомбы. При соответствующих генных модификациях грибка стеблевой ржавчины семена барбариса могут лишить небольшую бедную страну урожая зерновых и спровоцировать социальный взрыв.

Барбарис – всего лишь один из примеров инвазивных видов, способных лишить страну продовольствия

Один из самых опасных иназивных видов - это бактерии. Важнейшим продуктом сельского хозяйства является мясо, а значит, животные – первая мишень для экономического удара. С помощью переноса определенных фрагментов ДНК, взятых у устойчивых к антибиотикам бактерий, можно, например, превратить бактерию R. Rurninantium в биологическое оружие. Бактерия R. Rurninantium вызывает острое заболевание у животных и в отдельных случаях у людей. Распространенная через клещей генно-модифицированная бактерия может вызвать массовую гибель свиней и коров, а главное – панику среди населения.

Кроме естественных инвазивных видов сегодня существует возможность разработки химер – гибридных организмов, имеющих ДНК двух и более разных существ.

Гибридные бактерии - первый шаг на пути создания сложнейших химер

Здесь дело только за фантазией. Можно представить паразитов, передающих смертельные вирусы человеку, насекомых, саранчу, съедающую основу экономики отсталой страны, например, финики и т.п. Надо понимать, что внимание ученых сегодня сосредоточено в основном на создании гибридов человеческих генов и генов лабораторных животных – для медицинских целей. Впервые о химерах с человеческими генами громко заговорили в 2008 году, когда британские ученые попросили разрешения создать эмбрион-гибрид свиньи и человека, причем генов последнего было 99%. Обычно подобная работа с животными, насекомыми или растениями не афишируется и общественностью не обсуждается, но в научной медицине уже около 10 лет технология гибридизации существует и успешно применяется.

Информацией о новом типе вируса H5N1 обладают около 100 лабораторий и тысячи ученых по всему миру, так что при желании они могут изготовить свой собственный смертоносный штамм, который способен погрузить в хаос многие страны и дестабилизировать мировую экономику.

Вирус H5N1 имеет все необходимые инструменты для убийства человека. Прежде всего он поражает легочную ткань, в результате чего снижается уровень кислорода в крови, и человек постепенно умирает. Но даже если внешние симптомы инфицирования удалось победить, коварный вирус продолжает жить в мозге и уничтожать дофаминовые нейроны, вызывая симптомы болезни Паркинсона.

Таким образом, есть возможность нацелить вирусное оружие на определенные этнические группы. Также существуют технологии создания гибридных вирусов. Так, в марте 2011 года китайские ученые создали более 127 штаммов-гибридов вирусов H1N1 и H5N1 (свиной и птичий грипп), некоторые из них были патогенными.

Начинка вируса птичьего гриппа очень привлекательна с точки зрения создания разрушительного биооружия

В декабре 2012 года ученые из Университета Северной Каролины (США) разработали технологию разборки вирусов на фрагменты и последующей сборки нового вируса с заданными возможностями. Они планируют таким образом использовать вирусы для генной терапии – замены поврежденных участков ДНК исправными.

За основу будущего вируса можно взять различные типы вирусов. Возьмем, к примеру, адено-связанный вирус (AAV). Это небольшой непатогенный вирус, который живет в организмах большинства людей. Из различных форм вируса AAV выделяются определенные факторы, например, способность AAV1 проникать в мышцы или AAV8 - в клетки печени. Затем можно воспользоваться уже проверенной технологией, разработанной командой американских и британских ученых, которые научились программировать адено-связанный вирус на встраивание гена, продуцирующего выработку белка (фактора IX). Этот белок отвечает за свертываемость крови, и если вызвать гиперпродукцию фактора IX в определенной части тела, то там начнут образовываться микротромбы, делающие человека инвалидом или приводящие к смерти.

Несчастное насекомое не подозревает, что любимое лакомство, сладкая кукуруза, изменит его гены и приговорит к смерти

Свертываемость – это лишь один из сотен механизмов, влияющих на жизнедеятельность организма. Скорее всего, врачи даже не поймут, что произошло с человеком, особенно если собранный специалистами вирус будет имитировать симптомы распространенной болезни.

Современные биологическая война и терроризм могут быть совсем не похожи на представления большинства неспециалистов. Наука открывает все больше возможностей для скрытого, тонкого воздействия на организм человека. Трудно организовать распыление вируса или патогенной бактерии над всеми крупными городами страны, но есть и другие технологии, пока находящиеся на острие прогресса. Например, в начале этого года китайские ученые из Нанкинского университета обнаружили, казалось бы, невероятный факт: частички микро-РНК пищи могут ограниченно воздействовать на наши гены, влияя на работу печени и других органов пищеварения. По-видимому, этот природный механизм должен помогать нам лучше усваивать пищу.

Например, в 2007 году компании Monsanto и Devgen научились с помощью искусственных микро-РНК, внедренных в растения, убивать насекомых вредителей. Несчастное насекомое под названием блошка длинноусая ест генетически модифицированную кукурузу. В организм вредителя попадает молекула микро-РНК, которая блокирует ген, ответственный за выработку энергии в организме блошки. В результате максимум через 12 дней вредитель гарантированно гибнет, поскольку безопасная для всех остальных живых существ пища стала для блошки смертельно ядовитой. Растительную микро-РНК можно настроить на убийство или изменение биологических процессов любого насекомого. Теперь, как выяснилось, это возможно и в отношении человека.

Современные биотехнологии имеют огромный разрушительный потенциал. Страшно представить, как целые государства или даже регионы планеты гибнут в эпидемиях, как миллионы граждан неотвратимо к 30-40 годам заболевают болезнью Альцгеймера или неожиданно теряют зрение, слух. Сценариев можно придумать бесчисленное множество. К сожалению, защититься от таких разрушительных атак смогут только страны, обладающие высоким научным потенциалом в области биотехнологий и особенно генной инженерии. Сегодня таких государств совсем немного…

Конспирологическая версия об искусственной природе вируса SARS-CoV-2, он же 2019-nCoV, набирает обороты и наполняется подробностями, которые не стоит игнорировать.

Первые версии о том, что нынешний коронавирус был выведен лабораторным путём, появились несколько недель назад. Пользователи Сети обнаружили статью в одном из самых престижных академических научных журналов Nature об экспериментах по созданию нового гибридного вируса. Их суть заключалась в том, чтобы к вирусу пневмонии присоединить белковую оболочку, ту самую "корону", которая и позволяет вирусу проникать в клетки человека.

Статья эта вышла еще в 2015 году. Речь шла об экспериментах в лабораториях американского штата Северная Каролина. Тогда же под давлением американского научного сообщества эксперименты были свёрнуты.

Более того, правительство США наложило мораторий на подобного рода исследовательскую деятельность в границах страны. Но ученые не сдались и поехали продолжать свои изыскания не куда-нибудь, а в Китай. В провинцию Хубэй, в лабораторию под городом Ухань.

Как оказалось, и в Штатах некоторые изыскания продолжались.

Это подтверждается статьей о закрытии некой военной биологической лаборатории на базе Форт-Детрик в штате Мэриленд, опубликованной 5 августа 2019 года в газете The New York Times. Очевидно, что от Северной Каролины туда ехать довольно далеко, минуя весь штат Вирджиния. Но уже ‪31 августа все та же NYT даёт публикацию о странной вспышке атипичной пневмонии среди военнослужащих.

При этом распространение инфекции носит взрывной характер: на момент публикации было уже 215 зараженных. Дабы успокоить общественность, некие американские "профильные эксперты" обозначают причину эпидемии: курение вейпов.

Но вернемся в Китай, где с 2015 года под Уханем без привлечения внимания СМИ проводились вирусологические изыскания.

В 2019 году первой об угрозе эпидемии вируса нового типа заявила китайский вирусолог Ши Чжэнли, по странному стечению обстоятельств именно она все эти годы работала в рамках экспериментальной программы по изобретению нового коронавируса.

Следует оговориться: коронавирусы — это обширная группа, включающая в себя около 40 видов. И над каким именно штаммом трудились ученые — доподлинно неизвестно. Впрочем, и американцы, и китайцы в один голос утверждают, что совершенно над другим, а не над тем, который сейчас инфицирует тысячи людей.

Между тем в США на 11 сентября 2019 года насчитывается уже 500 инфицированных, и все они — военнослужащие, находившиеся в районе дислокации военной лаборатории в Мэриленде либо контактировавшие с ними. Основной причиной снова называют… курение вейпов.

Дошло до того, что президент США созвал специальное совещание по поводу запрета или ограничения продажи электронных сигарет. Но NYT пишет о том, что заболели даже те, кто вообще никогда не курил.

Далее, ‪17 ноября, в Ухане заболевает первый пациент.

Через непродолжительное время, когда инфицированных по официальной статистике становится 20-25, Ши Чжэнли первой заявляет о начале эпидемии. Её никто не слушает. Все относятся к новой инфекции как к чему-то локальному и отдаленному.

Однако уже в марте 2020 года ВОЗ присваивает инфекции коронавируса статус пандемии, хотя на тот момент во всем мире заразилось чуть больше 100 тысяч человек. Сезонным гриппом при этом каждый год болеют более миллиона человек на планете, и особой тревоги никто не бьёт.

Однако ВОЗ нагнетает обстановку, а мировое сообщество реагирует с разной долей скепсиса. Закрываются границы, отменяются массовые мероприятия, международные форумы, спортивные соревнования и всё, что предполагает массовое скопление народа с тесным и непосредственным контактом между людьми.

Что касается оперативности принятия мер, то здесь тоже есть масса вопросов. Британия поначалу решает игнорировать инфекцию с формулировками о "стадном иммунитете" — пусть все переболеют, и тогда коллективный иммунитет народа Королевства адаптируется под новый вирус.

Но после того, как число заразившихся перевалило за 20 тысяч, а случаев излечения насчитывалось едва ли больше сотни, британские власти решили, что идея со "стадным иммунитетом" себя не оправдала, и все же ввели карантин.

Что касается США, то там до последнего опровергали угрозу эпидемии. Официально только 11 марта 2020 года в Штатах были признаны летальные случаи от коронавируса. До этого их списывали на грипп и пневмонию. При этом первый, кто заговорил об этом — доктор Рэдфилд, глава Центра по контролю и профилактике заболеваний (СDС), который был связан с экспериментами в Северной Каролине и курировал работу лаборатории в Мэриленде.

Об этом 12 марта напомнил официальный представитель МИД КНР, когда Китаю надоело слушать обвинения в том, что именно они — источник пандемии.

Китайский дипломат Чжао Лицзянь публично заявил следующее: "CDC был пойман на месте. Когда нулевой пациент появился в США? Сколько людей заражено? Как называются больницы? Возможно, американские военные принесли эпидемию в Ухань. Информация должна быть обнародована! США должны объясниться!".

Пока происходит эта публичная дипломатическая перепалка, эпидемия всё разрастается, в США вводят карантин, а российские самолёты с медицинской помощью летят в Италию, а потом уже и в Штаты.

В целом ситуация не тянет на зомби-апокалипсис, но определенные художественные сюжеты прослеживаются здесь невооруженным взглядом.

Стоит вспомнить еще и странные совпадения в художественных произведениях. Например, в сериале "Териус у меня за спиной", где в десятой серии персонажи говорят именно о мутировавшем коронавирусе и его опасности.

Вышел "Териус" в 2018 году, в Южной Корее.

А еще внезапно стал популярен сериал "Заражение" Стивена Содерберга от 2011 года, который фантастически точно описывает и действие нынешнего вируса, и меры, принимаемые государствами в рамках противодействия инфекции, и многие особенности нынешнего положения вещей в мире.

Рождается мысль, что кто-то либо предсказал, либо знал и намёками предупреждал весь мир о том, что может произойти. И этот факт также настораживает.

В России некоторые ученые и эксперты прямо говорят об искусственной природе вируса.

В частности, советник генсека ООН по биооружию, микробиолог Игорь Никулин заявил Pravda.ru:

"Я изучал документы. Есть открытые публикации, например, в журнале Nature Medicine от 2015 года говорится, что американские биологи в Форт-Детрике создали искусственную модификацию коронавируса китайской летучей мыши с белком SHCO14. Это — достаточно известный белок гликопротеин, но в нем есть 4 вставки от ВИЧ, которые позволяют ему проникать в клетки человека.

Ни в одном коронавирусе из 4 десятков вида таких белков нет. Эта вставка — явно искусственная. Есть и подтверждающая публикация.

Автор попытался предупредить мировое сообщество. Судьба его неизвестна. Эту статью редакция уже отредактировала и написала, что, дескать, это просто гипотеза, мнение автора, оно не совпадает с мнением редакции и так далее. А вирус, который создали там, не имеет никакого отношения к тому вирусу, который сейчас гуляет по свету.

Но на самом деле многие факты указывают, что это — именно он".

В общем, искусственная природа у нынешнего вируса или нет, в любом случае вся эта история учит нас тому, что с матерью-природой лучше не шутить, а запрет на разработку биологического оружия введен по всему миру совершенно не зря.

Конспирологическими версиями коронавирус начал обрастать с первых дней своего появления на свет. Covid-19 заявил о себе в Ухани, а там как раз располагается Уханьский институт вирусологии, где в 2015 году была оборудована первая в материковом Китае лаборатория четвертого - самого высокого уровня биобезопасности (BSL-4). Пазл, как говориться, сложился. Поначалу конспирологи заботливо взращивали версию о том, что коронавирус избирательно поражает представителей монголоидной расы (непонятно зачем нужно было выводить такой вирус китайским вирусологам), но теперь мы на примере России и других стран знаем, что это неправда. Другая популярная теория утверждала, что Covid-19 это бактериологическое оружие. Но затем энтузиасты к этой версии охладели: кому нужно оружие, которое практически безопасно для молодых людей призывного возраста, а угрожает представителям возрастной категории 65+?

Сторонники теории заговора сосредоточились на версии о том, что SARS-CoV-2 (это название вируса, а Civid19 - болезнь, которую вирус вызывает) случайно “сбежал” из лаборатории во время научных экспериментов. Тем более, что вскоре конспирологи получили возможность опереться на научную основу.

В 2015 году в журнале Nature Medicine вышла статья об успешном эксперименте по созданию искусственного коронавируса, который способен поражать легкие человека и практически не лечится. В исследовании участвовали специалисты Университета Северной Каролины ( США ), Института микробиологии Цюриха ( Швейцария ) и Уханьского института вирусологии (Китай). Сторонники теории заговора восприняли эту публикацию, как камин-аут: ученые сами признались, что сконструировали вирус-химеру, который четыре года спустя вырвался на свободу и терроризирует все человечество!

Искусственный вирус генетически далек от коронавируса, который нас заражает

Подробный разбор этой гипотезы на своей странице в “Фейсбуке” и YouTube-канале провел известный популяризатор научного знания, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник сектора молекулярной эволюции Института проблем передачи информации РАН Александр Панчин. К нему мы и обратились за комментарием.

- Коронавирус SARS-CoV-2, который вызвал сегодняшнюю пандемию, не может быть “сбежавшим” из Уханьской лаборатории искусственным вирусом сконструированным в 2015 году, - объясняет Александр Панчин. - Это легко доказать, сравнив геномы того и другого вируса. В статье 2015 года подробно описывается, как ученые делали свой вирус. В качестве основы исследователи взяли штамм SARS-CoV MA15 (в природе существует множество разновидностей коронавируса - Ред) и внесли туда ген, который кодирует шиповидный белок другого коронавируса летучей мыши - SHC014-Cov. Шиповидный белок помогает вирусу проникать внутрь клетки, из-за этих шипов - короны, коронавирусы и получили свое название. Получившийся гибрид назвали SHC014-MA15. Если конспирологическая теория верна, то последовательность аминокислот белков искусственного вируса SHC014-MA15 должна совпадать с SARS-CoV-2, который сейчас всех заражает. Но этого не происходит. Я проводил сравнение с помощью компьютерной программы BLAST.

- Что это такое?

- Эта программа чем-то напоминает всем хорошо знакомый контекстный поиск офисной программы Word - ищет совпадения и различия в “буквах” (только в геноме буквами обозначается последовательность аминокислот или нуклеотидов - Ред). Так вот шиповидный белок искусственного вируса, имеет лишь 77.31% сходства с SARS-CoV-2. Это очень большое расхождение. Если мы посмотрим на другие белки - например полипроеин 1аb, то увидим такие же большие различия. Для сравнения разные вариации SARS-CoV-2 имеют между собой сходства от 97.8 до 100%. Что это значит? Это значит, что искусственный вирус эволюционно очень далек от коронавируса, который вызвал пандемию.

Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник сектора молекулярной эволюции Института проблем передачи информации РАН Александр Панчин

Какая мутация сделала его таким опасным?

- Но ведь могли быть и другие версии искусственно созданных вирусов, статьи о которых не публиковались. И в качестве деталей конструктора могли использовать вирусы-исходники, которые не так радикально отличались. Существуют ли признаки, по которым точно можно отличить искусственно сконструированный вирус (даже если он более тщательно “склеен”) от мутировавшего естественным путем?

- Cамый близкий родственник SARS-CoV-2 это штамм коронавируса летучих мышей RaTG13 - его шиповидный белок дает 97.41% сходства, а полипротеин 1ab - 98.53% сходства. Он был открыт в 2013 году, сам людей не заражал, и в 2015 году для создания искусственного вируса не использовался. Если мы сравним геном нового человеческого SARS-COV-2 с геномом коронавируса мыши RaTG13 с то опять же не увидим никаких признаков чужеродных вставок. При этом геном SARS-COV-2 все же отличается по всей своей длинне от геномов всех остальных известных коронавирусов, так что пока нет даже кандидата на "исходник", с которым работали бы гипотетические генные инженеры. Мы видим у SARS-CoV-2 признаки эволюции, а не дизайна.

- Какая мутация сделала коронавирус таким опасным?

- Мы не знаем точно, какая именно мутация сделала коронавирус таким заразным для людей. Упомянутый выше коронавирус RaTG13 людей не заражает, промежуточные варианты пока не найдены. Были работы про изучение мутаций в участке, который кодирует шиповидный белок, использующийся вирусом для проникновения в клетки. Вероятно, эти мутации сыграли свою роль, но не факт, что ими все ограничивается.

Зачем нужны вирусы-химеры

- А зачем ученые создавали искусственный вирус? Это выглядит как-то подозрительно…

- Идея таких экспериментов вполне понятна: мы хотим заранее знать какие эпидемии могут нам угрожать и какие меры можно принять? Пытаемся понять, как вирусы могут мутировать? Учимся заранее придумывать лекарства, чтобы их создание занимало не 10 лет, как это обычно бывает в практике клинических исследований новых препаратов, а хотя бы год или полгода. Как раз тут нет ничего подозрительного.

- В зарубежных СМИ приводят косвенные доказательства того, что вирус мог “сбежать” из Уханьской лаборатории: в ноябре 2019 года в самом начале вспышки институт открыл вакансии для вирусологов для работы с коронавирусом летучих мышей. Называют имя пропавшей аспирантки лаборатории, которая гипотетически могла быть тем самым “нулевым” пациентом, который вынес вирус наружу…

- То, что в Уханьском институте были специалисты, которые работали с коронавирусами из летучих мышей, никогда не скрывалось, это общеизвестный факт. Коронавирусы уже перескакивали от летучих мышей к людям, как было в случае атипичной пневмонии. Та же статья в Nature Medicine 2015 года была ровно про то, что такое перескакивание может случиться снова. Поэтому странно приводить это, как довод в пользу конспирологической теории. Заявление о том, что кому-то известен нулевой пациент вызывает у меня большие сомнения. Такое очень сложно выяснить. Я бы даже сказал, что абсолютно не решен вопрос о том, действительно ли все началось именно в Ухане ? Мы даже не знаем напрямую ли люди получили коронавирус от летучих мышей или с переходом от каких-то других млекопитающих (как вариант рассматривают панголинов). Потребуется немало времени, чтобы выяснить, как именно произошло первое заражение. Выстраивать на этой почве какие-то теории просто абсурдно.

ЧИТАЙТЕ ТАКЖЕ

Ученый объяснил, почему коронавирусом придется переболеть большинству жителей планеты

Появление тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса (SARS-CoV) и ближневосточного респираторного синдрома (MERS) -CoV подчеркивает угрозу межвидовых трансмиссивных событий, ведущих к вспышкам среди людей. Здесь мы изучаем потенциал заболевания SARS-подобным вирусом, SHC014-CoV, который в настоящее время циркулирует в популяциях китайских подковообразных летучих мышей 1 . Использование системы обратной генетики SARS-CoV 2Авторы создали и охарактеризовали химерный вирус, экспрессирующий пик коронавируса летучей мыши SHC014 в адаптированном для мыши остове SARS-CoV. Результаты показывают, что вирусы группы 2b, кодирующие спайк SHC014 в позвоночнике дикого типа, могут эффективно использовать несколько ортологов человеческого ангиотензин-превращающего фермента II рецептора SARS (ACE2), эффективно реплицироваться в первичных клетках дыхательных путей человека и достигать титров in vitro, эквивалентных эпидемическим. штаммы SARS-CoV. Кроме того, в естественных условияхэксперименты демонстрируют репликацию химерного вируса в легких мыши с заметным патогенезом. Оценка доступных иммунотерапевтических и профилактических методов на основе атипичной пневмонии показала низкую эффективность; подходы как к моноклональным антителам, так и к вакцинам не смогли нейтрализовать и защитить от инфицирования CoV с использованием нового белка с шипами. На основании этих результатов мы синтетически воспроизвели инфекционный полноразмерный рекомбинантный вирус SHC014 и продемонстрировали надежную репликацию вируса как in vitro, так и in vivo . Наша работа предполагает потенциальный риск повторного появления SARS-CoV из вирусов, циркулирующих в настоящее время в популяциях летучих мышей.

Появление SARS-CoV ознаменовало новую эру в межвидовой передаче тяжелых респираторных заболеваний с глобализацией, ведущей к быстрому распространению по всему миру и огромному экономическому воздействию 3 , 4 . С тех пор несколько штаммов, в том числе штаммы гриппа A H5N1, H1N1 и H7N9 и MERS-CoV, появились в популяциях животных, вызывая значительные заболевания, смертность и экономические трудности для пострадавших регионов 5 . Хотя меры общественного здравоохранения смогли остановить вспышку SARS-CoV 4 , недавние исследования в области метагеномики позволили выявить последовательности близкородственных SARS-подобных вирусов, циркулирующих в популяциях китайских летучих мышей, которые могут представлять угрозу в будущем 1 , 6., Однако одни только данные о последовательностях обеспечивают минимальную информацию для идентификации и подготовки к будущим препандемическим вирусам. Поэтому, чтобы изучить потенциал появления (то есть возможность заражать людей) циркулирующих CoV у летучих мышей, мы создали химерный вирус, кодирующий новый, зоонозный белок-шип CoV - из последовательности RsSHC014-CoV, которая была выделена из китайских подковообразных летучих мышей 1 - в контексте SARS-CoV, адаптированной к мышам основной цепи. Гибридный вирус позволил нам оценить способность нового белка шипа вызывать заболевание независимо от других необходимых адаптивных мутаций в его естественном скелете. Используя этот подход, мы охарактеризовали CoV-инфекцию, опосредованную спайком белка SHC014 в первичных клетках дыхательных путей человека и in vivo.и проверили эффективность доступных иммунных терапевтических средств против SHC014-CoV. Вместе эта стратегия переводит данные метагеномики, чтобы помочь предсказать и подготовиться к будущим возникающим вирусам.

Последовательности SHC014 и родственных RsWIV1-CoV показывают, что эти CoVs являются ближайшими родственниками эпидемических штаммов SARS-CoV ( Fig. 1a, b ); однако существуют важные различия в 14 остатках, которые связывают человеческий ACE2, рецептор SARS-CoV, включая пять, которые являются критическими для диапазона хозяев: Y442, L472, N479, T487 и Y491 (ссылка 7 ). В WIV1 три из этих остатков отличаются от эпидемического штамма SARS-CoV Urbani, но не ожидалось, что они изменят связывание с ACE2 ( дополнительная рис. 1a, b и дополнительная таблица 1 ). Этот факт подтверждается обоими экспериментами с псевдотипированием, в которых измерялась способность лентивирусов, кодирующих белки спайка WIV1, проникать в клетки, экспрессирующие ACE2 человека ( дополнительная фиг. 1).) и анализом репликации in vitro WIV1-CoV (ссылка 1 ). Напротив, 7 из 14 остатков взаимодействия ACE2 в SHC014 отличаются от остатков в SARS-CoV, включая все пять остатков, критических для диапазона хозяев ( дополнительная рис. 1c и дополнительная таблица 1 ). Эти изменения в сочетании с неспособностью псевдотипированных лентивирусов, экспрессирующих пик SHC014, проникать в клетки ( дополнительный рисунок 1d ), позволяют предположить, что пик SHC014 не способен связывать человеческий ACE2. Однако сообщалось, что аналогичные изменения в родственных штаммах SARS-CoV позволяют связывать ACE2 7 , 8., предполагая, что для проверки требуется дополнительное функциональное тестирование. Таким образом, мы синтезировали шип SHC014 в контексте компетентного к репликации адаптированного к мышам скелета SARS-CoV (далее мы будем называть химерный CoV как SHC014-MA15), чтобы максимизировать возможность патогенеза и исследования вакцин на мышах ( дополнительная фиг.8). 2а ). Несмотря на предсказания как из структурного моделирования, так и из экспериментов с псевдотипированием, SHC014-MA15 был жизнеспособным и реплицировался до высоких титров в клетках Vero ( дополнительная фиг. 2b ). Подобно SARS, SHC014-MA15 также требовал функциональной молекулы ACE2 для входа и мог использовать ортологов ACE2 человека, циветты и летучей мыши ( дополнительная Рис. 2c, d). Чтобы проверить способность шипа SHC014 опосредовать инфекцию дыхательных путей человека, мы исследовали чувствительность клеточной линии эпителия дыхательных путей человека Calu-3 2B4 (ссылка 9 ) к инфекции и обнаружили надежную репликацию SHC014-MA15, сравнимую с таковой у SARS-CoV Urbani ( рис. 1в ). Чтобы расширить эти результаты, первичные эпителиальные культуры дыхательных путей человека (HAE) были инфицированы и показали устойчивую репликацию обоих вирусов ( Fig. 1d ). Вместе данные подтверждают способность вирусов с шипом SHC014 инфицировать клетки дыхательных путей человека и подчеркивают потенциальную угрозу межвидовой передачи SHC014-CoV.

Фигура 1: SARS-подобные вирусы реплицируются в клетках дыхательных путей человека и вызывают патогенез in vivo

( a ) Полноменные последовательности генома репрезентативных CoV были выровнены и филогенетически картированы, как описано в Online Methods . Масштабная линейка представляет нуклеотидные замены, причем только поддержка бутстрапа выше 70% помечена. Дерево показывает CoV, разделенные на три отдельные филогенетические группы, определяемые как α-CoV, β-CoV и γ-CoV. Классические кластеры подгрупп отмечены как 2a, 2b, 2c и 2d для β-CoV и как 1a и 1b для α-CoV. ( b ) Аминокислотные последовательности доменов S1 спайков репрезентативных β-CoV группы 2b, включая SARS-CoV, были выровнены и филогенетически картированы. Шкала представляет аминокислотные замены. ( с , д) Вирусная репликация SARS-CoV Urbani (черный) и SHC014-MA15 (зеленый) после инфицирования клеток Calu-3 2B4 ( c ) или хорошо дифференцированных первичных воздух-жидкостных интерфейсных культур клеток HAE ( d ) при множественной инфекции (МВД) 0,01 для обоих типов клеток. Образцы собирали в отдельные моменты времени с биологическими повторностями ( n = 3) для экспериментов Calu-3 и HAE. ( e , f ) Потеря веса ( n = 9 для SARS-CoV MA15; n = 16 для SHC014-MA15) ( e ) и репликация вируса в легких ( n = 3 для SARS-CoV MA15; n = 4 для SHC014- MA15) ( ф) 10-недельных мышей BALB / c, инфицированных 1 × 10 4 БОЕ адаптированных к мыши SARS-CoV MA15 (черный) или SHC014-MA15 (зеленый) через интраназальный (in) путь. ( g, h ) Представлены репрезентативные изображения срезов легких, окрашенных на антиген SARS-CoV N от мышей, инфицированных SARS-CoV MA15 ( n = 3 мыши) ( g ) или SHC014-MA15 ( n = 4 мыши) ( h ). Для каждого графика значение в центре представляет среднее по группе, а столбцы ошибок определяют столбцы шкалы полусферы, 1 мм.

Чтобы оценить роль шипа SHC014 в опосредовании инфекции in vivo , мы заразили 10-недельных мышей BALB / c 10 4 блоками, образующими бляшки (pfu), либо SARS-MA15, либо SHC014-MA15 ( рис. 1e – h). ). Животные, инфицированные SARS-MA15, испытывали быструю потерю веса и летальность к 4 дню после заражения (dpi); в отличие от этого, инфекция SHC014-MA15 приводила к значительной потере веса (10%), но без летальности у мышей ( Fig. 1e ). Изучение репликации вируса выявило почти эквивалентные титры вируса в легких мышей, инфицированных SARS-MA15 или SHC014-MA15 ( рис. 1f ). Принимая во внимание, что легкие от мышей, инфицированных SARS-MA15, показали сильное окрашивание как в терминальных бронхиолах, так и в паренхиме легких 2 dpi ( Fig. 1g).), у мышей, инфицированных SHC014-MA15, наблюдалось снижение окрашивания антигена дыхательных путей ( рис. 1h ); напротив, в паренхиме или в общем гистологическом балансе не наблюдалось дефицита окрашивания антигена, что свидетельствует о дифференциальной инфекции легочной ткани для SHC014-MA15 ( дополнительная таблица 2 ). Затем мы проанализировали инфекцию у более восприимчивых, старых (12-месячных) животных. Животные, инфицированные SARS-MA15, быстро теряли вес и умирали от инфекции ( дополнительная рис. 3а, б ). Инфекция SHC014-MA15 вызывала устойчивую и устойчивую потерю веса, но имела минимальную летальность. Тенденции в гистологии и картинах окрашивания антигенов, которые мы наблюдали у молодых мышей, были сохранены у более старых животных ( дополнительная таблица 3). Мы исключили возможность того, что SHC014-MA15 опосредовал инфекцию через альтернативный рецептор, на основании экспериментов с мышами Ace2 - / - , у которых не наблюдалось потери веса или окрашивания антигена после инфекции SHC014-MA15 ( дополнительная фиг. 4a, b и дополнительная). Таблица 2 ). Вместе данные указывают на то, что вирусы с шипом SHC014 способны вызывать потерю веса у мышей в контексте вирулентного остова CoV.

Учитывая доклиническую эффективность терапии моноклональными антителами против вируса Эбола, такой как ZMApp 10 , мы затем попытались определить эффективность моноклональных антител против SARS-CoV против инфекции SHC014-MA15. Ранее сообщалось о четырех широко нейтрализующих человеческих моноклональных антителах, нацеленных на остроконечный белок SARS-CoV, и они являются вероятными реагентами для иммунотерапии 11 , 12 , 13 . Мы исследовали влияние этих антител на вирусную репликацию (выраженную в процентах ингибирования вирусной репликации) и обнаружили, что тогда как SARS-CoV Urbani дикого типа был сильно нейтрализован всеми четырьмя антителами при относительно низких концентрациях антител ( рис. 2a-d)), нейтрализация варьировалась для SHC014-MA15. Fm6, антитело, генерируемое с помощью фагового дисплея и избегания мутантов 11 , 12 , достигало только фоновых уровней ингибирования репликации SHC014-MA15 ( Fig. 2a ). Аналогично, антитела 230.15 и 227.14, которые были получены из В-клеток памяти пациентов, инфицированных SARS-CoV 13 , также не смогли блокировать репликацию SHC014-MA15 ( Fig. 2b, c).). Для всех трех антител различия между аминокислотными последовательностями спайков SARS и SHC014 соответствовали прямым или смежным изменениям остатков, обнаруженным у побежавших мутантов SARS-CoV (fm6 N479R; 230,15 L443V; 227,14 K390Q / E), что, вероятно, объясняет отсутствие антител нейтрализующая активность против SHC014. Наконец, моноклональное антитело 109.8 смогло достичь 50% нейтрализации SHC014-MA15, но только при высоких концентрациях (10 мкг / мл) ( рис. 2d ). Вместе результаты показывают, что широко нейтрализующие антитела против SARS-CoV могут иметь только незначительную эффективность против возникающих SARS-подобных штаммов CoV, таких как SHC014.

Фигура 2: моноклональные антитела против SARS-CoV имеют предельную эффективность против SARS-подобных CoV.

( a - d ) Нейтрализационные анализы, оценивающие эффективность (измеренную как уменьшение количества бляшек) панели моноклональных антител, которые все первоначально были созданы против эпидемии SARS-CoV, против инфекции клеток Vero SARS-CoV Urbani (черный) или SHC014-MA15 (зеленый). Проверенные антитела были fm6 ( n = 3 для Urbani; n = 5 для SHC014-MA15) 11 , 12 ( a ), 230,15 ( n = 3 для Urbani; n = 2 для SHC014-MA15) ( b ), 227,15 ( n = 3 для Урбани; n = 5 для SHC014-MA15) ( с ) и 109,8 ( n= 3 для Урбани; n = 2 для SHC014-MA15) 13 ( d ). Каждая точка данных представляет среднее значение для группы, а столбцы ошибок определяют sem. Обратите внимание, что столбцы ошибок в ячейках Vero, инфицированных SARS-CoV Urbani в b , c , перекрываются символами и не видны.

Чтобы оценить эффективность существующих вакцин против инфекции SHC014-MA15, мы вакцинировали старых мышей двойной инактивированной цельной SARS-CoV (DIV). Предыдущая работа показала, что DIV может нейтрализовать и защитить молодых мышей от заражения гомологичным вирусом 14 ; однако вакцина не защищала старых животных, у которых также наблюдалась патология усиленного иммунитета, что указывает на возможность нанесения вреда животным из-за вакцинации 15 . Здесь мы обнаружили, что DIV не обеспечивает защиту от заражения SHC014-MA15 в отношении потери веса или вирусного титра ( дополнительная фиг. 5a, b ). В соответствии с предыдущим отчетом с другими гетерологичными группами 2b CoVs 15сыворотка от мышей, вакцинированных DIV, в возрасте мышей также не смогла нейтрализовать SHC014-MA15 ( дополнительная фигура 5c ). Примечательно, что вакцинация DIV привела к сильной иммунной патологии ( дополнительная таблица 4 ) и эозинофилии ( дополнительная фиг. 5d – f ). Вместе эти результаты подтверждают, что вакцина DIV не будет защищать от заражения SHC014 и может усиливать заболевание в возрасте вакцинированной группы.

В отличие от вакцинации мышей DIV, использование SHC014-MA15 в качестве живой аттенуированной вакцины показало потенциальную перекрестную защиту от заражения SARS-CoV, но результаты имеют важные предостережения. Мы заразили молодых мышей 10 4 БОЕ SHC014-MA15 и наблюдали их в течение 28 дней. Затем мы заражали мышей SARS-MA15 на 29 день ( дополнительная фиг. 6a ). Предшествующее заражение мышей высокой дозой SHC014-MA15 обеспечивало защиту от заражения летальной дозой SARS-MA15, хотя был только минимальный ответ нейтрализации SARS-CoV от антисыворотки, вызванный через 28 дней после инфекции SHC014-MA15 ( Дополнительный рис. 6б1: 200). В отсутствие вторичного усиления антигена 28 dpi представляет ожидаемый пик титров антител и подразумевает, что со временем будет снижена защита от SARS-CoV 16 , 17 . Аналогичные результаты, демонстрирующие защиту от заражения летальной дозой SARS-CoV, наблюдались у старых мышей BALB / c в отношении потери веса и репликации вируса ( дополнительная фиг. 6c, d ). Тем не менее, доза инфекции SHC014-MA15 10 4 БОЕ вызвала> 10% потерю веса и летальность у некоторых пожилых животных ( рис. 1 и дополнительная рис. 3).). Мы обнаружили, что вакцинация более низкой дозой SHC014-MA15 (100 БОЕ) не вызывала потерю веса, но она также не защищала пожилых животных от заражения SARS-MA15 смертельной дозой ( дополнительная фиг. 6e, f ). В совокупности данные свидетельствуют о том, что заражение SHC014-MA15 может обеспечивать перекрестную защиту от SARS-CoV посредством консервативных эпитопов, но необходимая доза вызывает патогенез и исключает использование в качестве ослабленной вакцины.

Установив, что шип SHC014 обладает способностью опосредовать инфицирование клеток человека и вызывать заболевание у мышей, мы затем синтезировали инфекционный клон SHC014-CoV во всю длину на основе подхода, использованного для SARS-CoV ( рис. 3а ) 2 . Репликация в клетках Vero не выявила дефицита для SHC014-CoV относительно дефицита для SARS-CoV ( Fig. 3b ); однако SHC014-CoV значительно ( P