Что такое идентификация вирусов

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ (позднелат. identificare отождествлять; вирусы) — определение родовой и видовой принадлежности вирусов, установление их тождественности или отличия при сопоставлении с уже известными вирусами.

И. в. является заключительным этапом при лабораторной диагностике вирусных заболеваний; широко проводится также при эпидемиол, исследованиях и при работе в области теоретической вирусологии.

И. в. осуществляется путем изучения их морфологии, физ.-хим. свойств, биол, особенностей и антигенной структуры; ее проводят на основе существующей классификации вирусов. При И. в. сначала определяют их принадлежность к определенной классификационной группе. Если группа представляет собой семейство, дополнительно определяют род вируса (напр., принадлежность изучаемого пикорнавируса к энтеро- или риновирусам). Далее устанавливают вид вируса, а для видов, подразделяющихся на типы (напр., вирусы полиомиелита, гриппа), также их тип.

Групповая принадлежность вируса обусловливается видом входящей в его состав нуклеиновой к-ты и ее мол. весом, местом формирования (сборки) капсида в клетке, числом капсомеров, видом симметрии нуклеокапсида, наличием или отсутствием оболочки, липидов, размерами вириона. Практически для И. в. обычно достаточно определения лишь нескольких, наиболее важных из перечисленных показателей.

После установления рода определяют вид вируса (а для определенных вирусов также тип) путем изучения его антигенной структуры с помощью иммунных сывороток к типичным представителям различных видов (и типов) вирусов данного рода. Реже с той же целью используют другие методы.

Наиболее сложной является И. в., которые по своим характеристикам не могут быть отнесены ни к одной из существующих классификационных групп. Очень ответственным является заключение, что изучаемый вирус отличен от всех известных; оно может быть сделано лишь после изучения всего комплекса его свойств.

И. в., как правило, проводится после их размножения в лаборатории, поэтому для исследования берутся органы зараженных животных, ткани и жидкости эмбрионов птиц, питательная среда или клетки инфицированных клеточных и тканевых культур. Если вирус не удается культивировать в лабораторных условиях, то для И. в. используют материал, взятый непосредственно от больного или погибшего организма.

Размеры вируса наиболее точно определяют при помощи электронной микроскопии (см.), к-рая одновременно дает возможность получить сведения о структуре вириона. Для электронномикроскопического исследования необходимо иметь высокоочищенный и конц. материал. Для этой цели предпочтительно использовать скоростное центрифугирование в градиенте плотности сахарозы (см. Ультрацентрифугирование), что позволяет не только очистить вирус от балластных веществ, но при наличии в материале нескольких вирусов и разделить их, если они отличаются по величине.

При некоторых вирусных инфекциях с целью быстрой диагностики электронноскопически исследуют материал, взятый без предварительной обработки непосредственно от больного (напр., содержимое пустул для дифференциации оспы и ветрянки). Метод этот находит все более широкое применение при диагностике вирусных инфекций.

Определение размеров вирусов с помощью фильтрации через целлюлозные мембранные фильтры (см. Ультрафильтрация, в вирусологии) является менее точным. Необходимо иметь набор фильтров с различным диаметром пор. Далее для каждого фильтра должен быть определен поправочный коэффициент адсорбции, показывающий соотношение между диаметром пор и максимальным размером вирионов, которые могут через них проходить. С этой целью фильтр калибруют, используя частицы известной величины. Исследуемый материал должен быть освобожден от грубых частиц путем пропускания через стерилизующий фильтр или центрифугирования в течение 10—15 мин. при скорости 2000— 3000 об/мин. Для уменьшения адсорбции вируса предварительно фильтруют какое-либо капиллярноактивное вещество (бульон, р-р пептона и т. п.) или его прибавляют к вирусной взвеси. Фильтрацию материала выполняют последовательно, начиная с наиболее крупнопористого фильтра. Размер вируса получают путем умножения величины пор мембраны, частично его задерживающей, на коэффициент адсорбции для фильтра данной пористости.

Для определения типа входящей в состав вируса нуклеиновой к-ты ее выделяют путем обработки вирусной взвеси водонасыщенным фенолом, анионными детергентами, напр, додецилсульфатом натрия и другими, с последующим хим. анализом. Если вирус размножается в культурах клеток, тип нуклеиновой к-ты часто определяют косвенным методом, который основан на способности галоидопроизводных дезоксиуридина, в частности 5-бром-2-дезоксиуридина, избирательно подавлять размножение ДНК-содержащих вирусов и не влиять на репродукцию большинства РНК-содержащих. Препарат вносят в питательную среду в дозе от 40 до 100 мкг/мл при заражении клеточной культуры вирусом.

Ориентировочные данные о типе нуклеиновой к-ты вирусов можно получить по окраске инфицированных клеток флюорохромами, напр, акридином оранжевым (его используют в разведении 1:10000 — 1:20000 в изотоническом р-ре хлорида натрия с фосфатным буфером pH 7,2—7,4). При соединении с РНК акридин оранжевый флюоресцирует красным, а после реакции с ДНК — зеленым. Этот метод позволяет определить тип нуклеиновой к-ты вирусных компонентов в местах их скоплений внутри клеток. На нем основан метод дифференциальной диагностики ряда респираторных инфекций: делают мазок-отпечаток с нижней носовой раковины больного; после окраски акридином оранжевым внутриклеточные включения вирусов гриппа и парагриппа начинают светиться красным, а при аденовирусной инфекции и герпесе — зеленым.

Наличие или отсутствие в оболочке вирусов липидов устанавливают по чувствительности к действию растворителей липидов, напр, эфира. Вирусную взвесь соединяют с равным объемом эфира, встряхивают в течение 20 мин. при комнатной температуре, затем выдерживают 18—20 час. при t° 4° в плотно закрытой посуде. Далее пробу наливают в чашку Петри и выдерживают для испарения эфира 30 мин. при t° 36—37°, после чего ее титруют параллельно с необработанным материалом для определения количества вируса. При наличии в оболочке вируса липидов он при воздействии эфира инактивируется.

Проведение этих исследований обычно позволяет отнести изучаемый штамм к определенной классификационной группе или к числу неклассифицированных вирусов. Дальнейшую И. в. проводят внутри группы путем их сопоставления с типичными представителями отдельных видов. В ряде случаев исследования внутри группы могут быть ограничены. Так, вирусы семейства пикорна испытывают на устойчивость в кислой среде. Риновирусы при pH 3,0—5,3 в течение 1 — 3 час. инактивируются, в то время как энтеровирусы сохраняют свою инфекционность.

И. в. с помощью серол, реакций проводят путем их испытания с сыворотками к известным вирусам или, наоборот, приготовленные к изучаемым штаммам иммунные сыворотки испытывают с известными вирусами.

Серол, идентификацию нередко осуществляют в два этапа. Сначала вирус изучают в реакции связывания комплемента (см.), или, если он обладает гемагглютинирующей активностью, в реакции торможения гемагглютинации (см.), а затем с помощью реакции нейтрализации. РСК в отношении многих вирусов не является строго специфичной. Так, аденовирусы человека и большинства животных имеют общий комплементсвязывающий антиген. Общий антиген имеют все известные реовирусы. В отношении других вирусов, напр, вирусов гриппа, РСК более специфична и позволяет определить их типовую принадлежность. То же самое относится к РТГА: она позволяет определить тип реовируса и очень специфична в отношении вирусов гриппа, но в то же время дает групповые реакции при идентификации тогавирусов.

Наиболее специфичной является реакция нейтрализации: в большинстве случаев она позволяет установить как видовую, так и типовую принадлежность вируса (для видов, подразделяющихся на типы). Ее осуществляют различными способами. Чаще всего готовят смесь вируса с сывороткой, к-рую затем испытывают тем или иным способом на наличие ненейтрализованного вируса.

Значительно реже И. в. проводят путем перекрестного испытания иммунитета: животных иммунизируют неизвестным вирусом, а затем заражают известным или наоборот.

Весьма широко для И. в. используют иммунофлюоресценцию (см.). Чаще всего инфицированные неизвестным вирусом клеточные культуры исследуют с флюоресцирующим иммуноглобулином к известному вирусу. Реже исследуют т. о. материал от больных (мазки из глотки при гриппе, мозг больных подострым склерозирующим панэнцефалитом на коревой антиген, мозг погибших от бешенства).

Преципитацию в агаре используют для И. в. довольно редко. В материале из кожных поражений больных оспой этим методом можно обнаружить вирусный антиген.

Некоторые виды вирусов пе удается достаточно четко дифференцировать путем изучения их антигенной структуры. В таких случаях прибегают к дополнительным тестам — определяют патогенность для животных, размножение в различных клеточных культурах и др. Т. о., напр., идентифицируют вирусы оспенной группы. Возбудитель натуральной оспы не вызывает поражений на скарифицированной коже кролика и не размножается в культурах клеток при t° выше 38,5°. В то же время вирусы осповакцины и оспы коров вызывают изменения на коже кролика и размножаются при t° до 40°. Отличаются вирусы также по морфологии поражений на хорионаллантоисной оболочке куриного эмбриона.

Библиография: Гайдамович С. Я. Классификация и идентификация арбовирусов, Вестн. АМН СССР, № б, с. 25, 1972; Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, под ред. Э. Леннета и Н. Шмидт, пер. с англ., М., 1974; Лурия С. и Дарнелл Дж. Общая вирусология, пер. с англ., М., 1970; Соколов М. И., С и н и ц к и й А. А. и P е-м e з о в П. И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях, Л., 1972.

Цитопатические эффекты оценивают при микроскопии клеточных культур. По степени поражения клеток выделяют вирусы с высокой или умеренной цитопатогенностью. Размножение вирусов в культурах клеток сопровождается нарушениями морфологии клеток монослоя. Некоторые вирусы вызывают характерные цитопатические изменения, что (с учётом клинической картины заболевания) позволяет быстро поставить предварительный диагноз. Например, размножение парамиксовирусов (вирусы кори, паротита, PC-вирус) сопровождается появлением характерных гигантских многоядерных клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений больших круглых клеток, а при репродукции герпесвирусов клетки округлой формы диффузно располагаются по всему монослою.

Тельца включений. Многие вирусы вызывают появление в заражённых клетках характерных образований — скоплений вирусных белков или частиц, видимых в световой микроскоп. Тельца включений могут располагаться как в цитоплазме (тельца Гварнери при оспе), так и в ядрах клеток (аденовирусы).

Отсутствие цитопатического эффекта. Некоторые вирусы (например, вирус краснухи) не проявляют цитопатического эффекта. Их можно выявлять по интерференции другого вируса, способного вызывать дегенерацию заражённых клеток.

Феномен гемадсорбции. Многие заражённые вирусами клетки приобретают способность сорбировать на своей поверхности различные эритроциты. Феномен гемадсорбции имеет общие механизмы с гемагглютинацией и проявляется на ранних сроках, до проявления цитопатического эффекта, при его отсутствии либо слабой выраженности.

Экспресс-диагностика. Для быстрой идентификации вирусной инфекции разработаны многочисленные методы экспресс-диагностики, основанные на обнаружении вирусных Аг. Например, для ранней диагностики ВИЧ-инфекции широко используют ИФА, выявляющий поверхностные Ar вируса.

Количественное определение вирусов проводят двумя путями — изучением инфекционности и количественным определением вирусных Аг. Определение титра инфекционности вирусов в значительной степени зависит от метода количественного исследования; у бактериофагов отношение инфекционность-частица составляет приблизительно 1 (то есть каждая вирусная частица способна вызвать инфекцию), для вирусов животных данное отношение составляет 1:10 (иногда выше из-за вирусингибирующего действия факторов резистентности).

Выявление вирусных Аг и вирусных частиц. Наиболее распространённый метод — реакция количественной гемагглютинации. Метод основан на способности вирусов сорбироваться на поверхности эритроцитов животных и человека. Количественную электронную микроскопию применяют для подсчёта общего числа вирусных (но не инфекционных) частиц в исследуемом обьекте (например, культуральной жидкости).

Изучение морфологии вирусов возможно лишь при помощи электронной микроскопии, однако чаще всего этот метод недоступен из-за отсутствия столь дорогого и сложного прибора. Более того, многие возбудители морфологически сходны, что снижает ценность этого метода. Наиболее распространён метод микроскопии содержимого везикул и тканевых экстрактов, обработанных красителями (негативное контрастирование), с последующим подсчётом ДНК- или РHK-содержащих вирусов. Электронная микроскопия позволяет быстро обнаружить орто- и парамиксовирусы в отделяемом дыхательных путей, герпесвирусы в жидкости везикул и ротавирусы в фекалиях.

Серологические методы идентификации

При большинстве вирусных инфекций развиваются иммунные реакции, применяемые для диагностики. Клеточные реакции обычно оценивают в тестах цитотоксичности лимфоцитов в отношении инфекционных агентов или заражённых ими клеток-мишеней либо определяют способность лимфоцитов отвечать на различные Аг и митогены. В работе практических лабораторий выраженность клеточных реакций определяют редко. Большее распространение нашли методы идентификации противовирусных AT.

РН основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными AT. Неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток указывает на несоответствие инфекционного агента и известных AT.

Торможение гемагглютинации. РТГА применяют для идентификации вирусов, способных агглютинировать различные эритроциты. Для этого смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.

Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов. Реакцию торможения цитопатического эффекта за счёт интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применённым AT.

Прямая иммунофлюоресценция. Среди прочих тестов наибольшее распространение нашла реакция прямой иммунофлюоресценции (наиболее быстрая, чувствительная и воспроизводимая). Например, идентификация ЦМВ по цитопатогенному эффекту требует не менее 2-3 нед, а при использовании меченых моноклональных AT идентификация возможна уже через 24 ч. Имея набор подобных реагентов, их можно вносить в культуры, заражённые вирусом, инкубировать, отмывать не связавшийся реагент и исследовать с помощью люминесцентной микроскопии (позволяет выявить наличие флюоресценции заражённых клеток).

Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода) позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами AT, но сложность и дороговизна метода ограничивают его применение.

Выявление противовирусных AT в сыворотке

Более простой и доступный подход — выявление противовирусных AT в сыворотке. Образцы крови необходимо отбирать дважды: немедленно после появления клинических признаков и через 2-3 нед. Чрезвычайно важно исследовать именно два образца сыворотки. Результаты однократного исследования нельзя считать окончательными из-за невозможности связать появление AT с настоящим случаем. Вполне возможно, что эти AT циркулируют после предшествующей инфекции. В подобной ситуации роль исследования сыворотки, полученной в период реконвалесценции, трудно переоценить. На наличие заболевания в период отбора первой пробы указывает не менее чем четырёхкратное увеличение титра AT, выявленное при исследовании второй пробы.

Перечисленные ниже методы не позволяют дифференцировать AT, образующиеся во время болезни и циркулирующие после выздоровления (продолжительность этого периода вариабельна для различных инфекций). Поскольку для адекватной диагностики необходимо подтвердить достоверное увеличение титров AT в двух пробах, то первую пробу исследуют в острой фазе, а вторую — в период выздоровления (через 2-3 нед). Полученные результаты носят ретрос пективный характер и более пригодны для проведения эпидемиологических обследований.

РТГА выявляет AT, синтезируемые против гемагглютининов вирусов (например, вируса гриппа). Метод позволяет легко выявлять подобные AT в сыворотке больного.

РСК — основной метод серодиагностики вирусных инфекций (среди доступных). Реакция выявляет комплементсвязывающие IgM и IgG, но не дифференцирует их; для оптимизации получаемых результатов постановка реакции требует определённых навыков персонала.

РИФ. При возможности получить биоптат инфицированной ткани и доступности коммерческих наборов AT, меченных флюоресцеином, диагноз может подтвердить реакция прямой иммунофлюоресценции. Постановка реакции включает инкубацию исследуемой ткани с AT, их последующее удаление и люминесцентную микроскопию образца.

Иммуносорбционные методы (например, ИФА и РИА) более информативны, поскольку выявляют IgM и IgG по отдельности, что позволяет делать определённые выводы о динамике инфекционного процесса или состоянии реконвалесценции. Для выявления AT известный Аг сорбируют на твёрдом субстрате (например, на стенках пробирок, пластиковых микропланшетах, чашках Петри) и вносят различные разведения сыворотки пациента. После соответствующей инкубации не связавшиеся AT удаляют, вносят антисыворотку к lg человека, меченную ферментом, повторяют процедуру инкубирования и отмывания несвязанных AT и вносят какой-либо хромогенный субстрат (чувствительный к действию фермента). Поскольку изменение окраски пропорционально содержанию специфических AT, то вполне возможно определение их титра спектрофотометрическим способом. В диагностике ВИЧ-инфекции наибольшее распространение нашёл метод иммуноблотинга.

Выявление вирусных Аг

ИФА. В настоящее время уже появились коммерческие наборы для выявления Аг некоторых возбудителей, позволяющие их идентифицировать в течение 5-10 мин. Для выявления Аг на твёрдой фазе сорбируют известные AT и добавляют сыворотку, содержащую Аг; после инкубирования несвязанный Аг декантируют, систему промывают и вносят меченые AT, специфичные к сорбированным AT. Повторяют процедуру инкубирования и отмывания, вносят хромогенный субстрат, положительный результат фиксируют при изменении окраски системы.

Гибридизация ДНК — высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве маркёра применяют ферменты и изотопы. Метод определяет способность вирусной ДНК гибридизироваться с меченой комплементарной ДНК; специфичность метода прямо пропорциональна длине I комплементарной цепочки. Перспективен метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ. Для постановки реакции меченую ДНК наносят на биоптаты тканей (в том числе на фиксированные формалином или заключённые в парафиновые блоки) и регистрируют взаимодействие с комплементарной ДНК. Метод используют для выявления вирусов простого герпеса, папилломы человека, Эпстайна-Барр и др.

ПЦР. Метод значительно увеличивает чувствительность метода гибридизации, повышая содержание вирусной ДНК в материале, полученном от больного, а также ускоряет время получения результата.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.

Определение типа вируса (его идентификация) основано на нейтрализации биологической активности вируса с помощью типоспецифических сывороток. Конечный результат ее может быть установлен на основании следующих признаков:

нейтрализация цитопатического действия: в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус. При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим антителам примененной сыворотки;

нейтрализация реакции гемадсорбции;

изменение проявления цветной пробы;

задержка (торможение) реакции гемагглютинации: смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.

нейтрализация в опытах на животных.

Таким образом РН (реакция нейтрализации) основана на подавлении соответствующей реакции, феномена, развития инфекционного процесса после внесения в культуру или введения в организм животного смеси вируса со специфичными AT, содержащимися в диагностической сыворотке.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR) - позволяет определить наличия инфекционного агента в присланном материале, в кратчайшие сроки. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя.

ПЦР - это метод ферментативного получения большого количества копий (амплификации) исследуемых фрагментов ДНК путем повторных циклов репликации и денатурации (разделения цепи ДНК на отдельные нити). При этом происходит копирование только исследуемого участка ДНК, поскольку только этот участок соответствует заданным условиям. И только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Для протекания этой реакции необходимы три ключевых компонента:

• — служащая матрицей молекула ДНК, содержащая исследуемый фрагмент;
• — ДНК-полимераза (фермент для производства копий ДНК) и нуклеотиды, используемые ДНК-полимеразой для синтеза ДНК.
• — два праймера ПЦР - два коротких сегмента однонитевой нуклеиновой кислоты, комплементарных началу исследуемого фрагмента ДНК (обычно это последовательности из 15-20 оснований). Присоединяясь к этому фрагменту, праймеры позволяют запустить синтез ДНК, поскольку ДНК-полимераза способна только добавлять звенья. Праймеры можно заказать в биохимической компании или синтезировать с помощью автоматизированного аппарата, задав программу требуемой последовательности нуклеотидов.

Метод ПЦР имитирует в пробирке естественную репликацию ДНК, повторяющуюся много раз и столько, сколько это необходимо для исследования.

Иммуноферментный метод (ИФА). В иммуноферметных методах антиген вируса взаимодействует с антителом диагностической сыворотки, при этом один из реагентов связан с энзимом. Для выявления этой энзимной метки необходимый соответствующий субстрат (хромоген), который реагирует с адсорбированным, например на молекуле антитела, ферментом, изменяя окраску реагирующей смеси.

Для такой метки широко используется фермент - пероксидаза хрена, которая в зависимости от субстрата дает разноцветные продукты реакции.

Иммуноблотинг [от англ. blot, пятно] - метод идентификации антигенов Аг (или антител AT - иммуноглобулины) с помощью соответствующих известных сывороток (или Аг). На практике применяют для идентификации антигенов ВИЧ. Первоначально электрофорезом в полиакриловом геле выделяют Аг вируса (на практике эту процедуру не проводят, а используют коммерческий реагент). Затем на полосы преципитата накладывают носитель (нитроцеллюлозную плёнку или активированную бумагу) и продолжают электрофорез. После чего на плёнку наносят сыворотку пациента и инкубируют (рисунок 19).

После отмывания несвязавшихся AT (при их наличии) проводят ИФА - на плёнку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам (Ig) человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов Аг-АТ-антисыворотка к Ig на носителе появляются окрашенные пятна (рисунок 20).

Рисунок 19 - Схема иммуноблотинга

Рисунок 20 - Результат иммуноблотинга

Вопросы для самоконтроля

• 1 Назовите основные принципы классификации вирусов.
• 2 Какие этапы включают в себя лабораторные исследования при идентификации вирусов и диагностике вирусных инфекций?
• 3 Какие биологические модели используются для выделения и культивирования вирусов человека и животных?
• 4 Как происходит заражение куриных эмбрионов в лабораторных условиях?
• 5 Какие методы получения культуры клеток вы знаете?
• 6 Как проводят идикацию вирусов в курином эмбрионе и на лабораторных животных?
• 7 Какие существуют методы индикации вирусов на культуре клеток?
• 8 Как внешне может проявиться патология клеток в результате инфицирования вирусом?
• 9 В чем заключается назначение и сущность реакций нейтрализации вирусов?
• 10 Назовите способы постановки реакций нейтрализации вирусов.
• 11 В чем заключается суть ИФА и иммуноблотинга?
• 12 В чем заключается принцип полимеразной цепной реакции?

Лабораторное занятие 2 Специальные методы выделения и изучения вирусов

Цель занятия: изучить принципы и методы выделения, культивирования и идентификации вирусов.

Материалы и оборудование: 1) световой микроскоп; 2) препараты для микроскопии (или фотографии препаратов) культур клеток неинфицированных вирусами и инфицированных вирусами а) с крупноклеточной дегенерацией клеток, б) с мелкоклеточной дегенерацией клеток, в) с образованием симпластов, г) с развитием очагов клеточной пролиферации, д) с внутриклеточными включениями; 4) демонстрационная планшетка с положительной реакцией гемагглютинации; 5) фотография препарата или препарат для микроскопии с положительной реакцией гемадсорбции; 6) демонстрационный препарат инфицированной вирусами культуры клеток с феноменом бляшкообразования; 7) штатив с пробирки, демонстрирующими цветную реакцию Солка; 8) демонстрационные варианты постановки реакции нейтрализации вирусов.

Задание 1: проведите индикацию вирусов в культурах клеток по цитопатическому действию.

• 1) Рассмотрите фотографии или промикроскопируйте в световой микроскоп при большом увеличении препараты неинфицированных и инфицированных вирусами культур клеток с разными типами цитопатического действия: а) с крупноклеточной дегенерацией клеток, б) с мелкоклеточной дегенерацией клеток, в) с образованием симпластов; г) с развитием очагов клеточной пролиферации.
• 2) Определите какой тип цитопатического действия вы обнаружили на препаратах культур клеток инфицированных вирусами.
• 3) В протоколе занятия назовите и нарисуйте типы цитопатического действия вирусов.

Задание 2: проведите индикацию вирусов в культурах клеток по наличию внутриклеточных включений.

• 1) Рассмотрите фотографии или промикроскопируйте в световой микроскоп при большом увеличении препараты инфицированных вирусами культур клеток с внутриклеточными включениями. Обратите внимание на расположение включений в клетке (в цитоплазме или в ядре) и их размеры и форму.
• 2) В протоколе занятий сделайте рисунки рассмотренных препаратов и укажите на них внутриклеточные включения.

Задание 3: проведите индикацию вирусов в культурах клеток с использованием реакции гемагглютинации и гемадсорбции.

• 1) Изучите механизм реакции гемагглютинации и гемадсорбции. В протоколе занятия опишите сущность этих реакций.
• 2) Рассмотрите демонстрационный материал (планшетка с положительной реакцией агглютинации и препарат для микроскопии с реакцией гемадсорбции).
• 3) В протоколе занятия сделайте рисунки рассматриваемых реакций.

Задание 4: проведите индикацию вирусов в культурах клеток с использованием феномена бляшкообразования.

• 1) Изучите метод бляшек. В протоколе занятия опишите сущность феномена бляшкообразования.
• 2) Рассмотрите демонстрационный материал с феноменом бляшкообразования. Обратите внимание на цвет питательной среды и наличие в ней бляшек (негативных колоний).
• 3) В протоколе занятия сделайте рисунок культуры клеток с феноменом бляшкообразования.

Задание 5: проведите индикацию вирусов в культуре клеток с использованием цветной реакции Солка.

• 1) Изучите методику постановки цветной реакции Солка. В протоколе занятия кратко опишите сущность этой реакции.
• 2) Рассмотрите демонстрацию результатов цветной реакции Солка.
• 3) В протоколе занятия отразите результаты реакции на рисунке и сделайте вывод о наличии вируса в культуре клеток.

Задание 6: проведите идентификацию вируса с использование реакции нейтрализации.

1) Изучите методику постановки реакций нейтрализации вирусов. В протоколе занятия кратко опишите сущность этой реакции.

2) Рассмотрите демонстрационный материал с постановкой одного из вариантов реакции нейтрализации.

3) В протоколе занятия укажите продемонстрированный вам вариант реакции нейтрализации и нарисуйте схему постановки этого варианта реакции.