Что такое неструктурный белок при ящуре

Цена:

Авторы работы:

Научный журнал:

Год выхода:

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2006, том 40, № 1, с. 165-171

ПРИКЛАДНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

РЕКОМБИНАНТНЫЕ НЕСТРУКТУРНЫЕ БЕЛКИ ЗА, 3В И ЗАВ ВИРУСА ЯЩУРА: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВАКЦИНИРОВАННОГО И ИНФИЦИРОВАННОГО КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Федеральный центр охраны здоровья животных Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, Владимир, 600901 Поступила в редакцию 29.06.2005 г.

Рекомбинантные белки ЗА, 3В и ЗАВ вируса ящура (ВЯ) получены экспрессией соответствующих генов в Escherichia coli. Очистку белков осуществляли методом металл-хелатной хроматографии. Рекомбинантные белки были использованы в качестве антигенов в непрямом варианте иммунофер-ментного анализа (ИФА) при разработке тест-систем для дифференциации вакцинированных и инфицированных ВЯ животных. Определены рабочие концентрации антигенов, конъюгата анти-IgG крупного рогатого скота (КРС) c пероксидазой, оптимальный состав блокирующего буфера, позитивно-негативный порог реакции. Тестирование около двухсот сывороток крови КРС с различным иммунным статусом показало, что наиболее достоверную дифференциацию животных обеспечивает тест-система с использованием белка ЗА в качестве антигена (ЗА-ИФА). Сравнение разработанных тест-систем с набором "Chekit FMD-3ABC" показало, что все они превосходят коммерческий набор по чувствительности, при этом ЗА-ИФА не уступал ему по специфичности.

Ключевые слова: вирус ящура, неструктурные белки, экспрессия в Escherichia coli, металл-хелатная хроматография, непрямой вариант ИФА, диагностическая чувствительность и специфичность.

RECOMBINANT NON-STRUCTURAL ЗА, ЗВ AND ЗАВ PROTEINS OF FOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS: USE IN INDIRECT ELISA FOR DIFFERENTIATION OF VACCINAIEDAND INFECTED CATTLE, by A. S. Yakovleva*, A. V. Shcherbakov, A. V. Kanshina, N. S. Mudrak, \ T. A. Fomina | (Federal Centre for Animal Health (FGI ARRIAH), Vladimir, 600901 Russia; *e-mail: kovalishin@arriah.ru). Recombinant proteins 3A, ЗВ and 3AB were obtained by expression in Escherichia coli and purified by metal-chelate chromatography. The proteins were used as antigens in indirect ELISA to differentiate vaccinated and infected cattle. While testing 200 sera from cattle 3A-ELISA was more sensitive and specific than ЗВ- and 3AB-ELISA. Compared with "Chekit FMD^ABC", 3A-ELISA showed the same level of specificity and higher level of sensitivity.

Key words: foot-and-mouth disease virus, non-structural proteins, expression in E. coli, metal-chelate affinity chromathography, indirect ELISA, diagnostic sensitivity and specificity.

Ящур, высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных, возглавляет список особо опасных болезней животных, способных вызывать эпизоотии и наносить большой экономический ущерб. Так, экономические потери от ящура на Тайване в 1997 г. составили 378 млн. долларов

Принятые сокращения: ВЯ - вирус ящура; ИФА - иммуно-ферментный анализ; КРС - крупный рогатый скот; 1РТО -изопропил-Р-Б-тиогалактопиранозид; ПААГ - полиакрил-амидный гель; АБТС - 2,2'-азино-бис(3-этил)бензтиазо-лин-6-сульфоновая кислота; ДПИ - дни после инфицирования; №-КТА-агароза - №-нитрилотриуксусная кислота-агароза; АМУ-обратная транскриптаза - обратная транс-криптаза, полученная из вируса миелобластоза птиц.

*Эл. почта: kovalishin@arriah.ru

США [1]. Прямые и косвенные потери Великобритании от эпизоотии ящура в 2001 г. достигли 10 млрд. фунтов стерлингов [2].

Для России постоянно существует опасность проникновения этой болезни из сопредельных азиатских государств, свидетельством чего являются вспышки ящура на территории Российской Федерации в 1995, 2000, 2004 и 2005 гг., вызванные заносом инфекции из Китая [3, 4]. В этой ситуации разработка и совершенствование средств и методов диагностики ящура напрямую связаны с проблемой обеспечения зоосанитарной и экономической безопасности страны.

Возбудитель ящура - безоболочечный РНК-содержащий вирус семейства Picornaviridae, рода

Aphthovirus. Геном вируса кодирует четыре структурных и восемь неструктурных белков. Обе группы белков вызывают выработку антител у животных во время инфекции. Однако у вакцинированных животных обнаруживаются антитела в основном к структурным белкам. Это объясняется тем, что при изготовлении вакцины проводят частичную очистку вируса, в процессе которой большинство неструктурных белков удаляется вместе с клеточным дебрисом.

Обнаружение антител к неструктурным белкам ВЯ является важным инструментом контроля за заболеванием, т.к. позволяет дифференцировать вакцинированных животных от переболевших и выявлять бессимптомных вирусоносителей среди вакцинированного поголовья. В связи с тем, что Россия проводит политику противояшурной вакцинации скота вдоль своих южных границ, наличие диагностических средств, позволяюших обнаруживать в вакцинированных стадах инфицированных животных, чрезвычайно актуально. В настояшее время на мировом рынке ветеринарных диагностикумов представлено несколько иностранных коммерческих тест-систем для выявления антител к неструктурным белкам ВЯ. Они основаны на использовании в качестве антигенов синтетических пептидов или рекомбинант-ных белков ВЯ, синтезированных в E. coli или в бакуловирусной системе. Отечественных тест-систем до сих пор создано не было.

Многочисленные исследования показали, что из всех неструктурных белков ВЯ наиболее под-ходяшим на роль антигена для дифференцирую-шего теста являются белки ЗА и 3В 12.

Цель данной работы - получение рекомби-нантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса яшура и проверка возможности их использования для дифференциации переболевших и вакцинированных животных.

Выделение вирусной РНК из вируссодержа-шей суспензии осушествляли с использованием 6 М гуанидинизотиоцианата и стекловолокнис-тых фильтров GF/F [13].

Расчет и синтез праймеров. Расчет праймеров проводили на основе нуклеотидной последовательности ВЯ А22 550, представленной в биоинформационной системе GeneBank (Accession X74812). Для амплификации и клонирования генов ЗА, ЗВ и ЗАВ ВЯ были рассчитаны следуюшие праймеры:

Синтез праймеров осуществляла фирма "Син-тол" (Москва).

Обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) проводили в одной пробирке. Реакционная смесь (50 мкл) содержала 5 мкл 10-кратного буфера для Taq-полимеразы ("Promega"), 3 мМ MgCl2, 0.2 мМ dNTPs, по 2.0 ед. AMV-обратной транскриптазы ("Promega") и Taq-полимеразы ("Promega"), по 20 пмоль праймеров, 5 мкл водного раствора вирусной РНК и воду до конечного объема. Реакцию проводили на ДНК-амплификаторе Minicycler PTC-100 ("MJ Research", США). Программа включала 15 мин при 42°С (обратная транскрипция), 2 мин при 94°С (денатурация комплекса РНК-ДНК) и 35 циклов собственно ПЦР при следующем температурном режиме: денатурация - 30 с при 94°С, отжиг праймеров - 30 с при 55°С и элонгация - 40 с при 72°С. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле, содержащем 0.001% бромистого этидия, при силе тока 50 мА.

Молекулярное клонирование продуктов ПЦР осуществляли по общепринятым методикам [14]. Для клонирования использовали экспрессирую-щую плазмиду pQE и штамм М15 E. coli ("Qiagen").

Экспрессия генов рекомбинантных белков.

Культивирование клеток E. coli проводили в орбитальном шейкере при 150 об/мин и 37°С. После достижения плотности культуры клеток А550 = 0.6, добавляли IPTG ("Promega"). Уровень накопления и размер рекомбинантных белков определяли с помощью вертикального электрофореза в 12%-ном ПААГ.

Очистку рекомбинантных белков проводили методом металл-хелатной хроматографии. Осадок клеток E. coli обрабатывали лизирующим буфером (0.01 М Трис-HCl рН 8.0, 6 М гуанидинхло-рид, 0.1 М NaH2PO4), затем центрифугировали 5 мин при 12000 об./мин. К супернатанту добавляли Ni-NTA-агарозу ("Qiagen") и инкубировали при помешивании 15 мин при комнатной температуре. Сорбент с белком дважды промывали лизирующим буфером. Затем сорбированные на ага-розе белки переводили в раствор с помощью элю-ирующего буфера (0.01 М Трис-HCl, рН 8.0, 0.4 М имидазол, 0.1 М NaH2PO4).

Непрямой вариант ИФА проводили по стандартной схеме [15]. В качестве конъюгата анти-IgG КРС с пероксидазой хрена использовали коммерческий препарат производства НИЭМ им. Гамалеи (Москва). Окрашивание реакции проводили внесением субстрата АБТС, количественную оценку интенсивности окрашивания осуществляли на спектрофотометре "Униплан" (Москва) при длине волны 405 нм. В работе использовали 30 сывороток от клинически здорового поголовья КРС, не вакцинированного против ящура; 20 сывороток от коров, одно- или многократно вакци-

5' Vpg-|L | 1А | 1B | 1С | 1D 2A 2B| 2C| 3A| 3В | 3C | 3DH— поли(А) 3'

ЗА (3B, 3AB) BamHI I-1 HindIII

3А (3B, 3AB) BamHI ^^^^ HindIII

Рис. 1. Схема клонирования генов 3А, 3В и 3АВ вируса ящура в плазмиду pQE.

нированных против ящура; а также сыворотки от животных, экспериментально зараженных ВЯ се-ротипов А, О и Азия-1, взятые в разные сроки после заражения (5, 7 и 21 день после инфицирования, ДПИ): 34 сыворотки 5ДПИ, 74 сыворотки 7ДПИ и 17 сывороток 21ДПИ.

Статистическая обработка результатов. Диагностическую чувствительность (Дчув) и специфичность (Дспец) вычисляли по формулам, рекомендованным Международным Эпизоотическим Бюро [16]: Дчув = (ИП/(ИП + ЛО)) х 100%; Дспец = (ИО/(ИО + ЛП)) х 100%, где ИП - истин-ноположительный результат, ЛО - ложноотри-цательный результат, ИО - истинноотрицатель-ный результат, ЛП - ложноположительный результат.

Для получения рекомбинантных неструктурных белков был использован штамм А22 550 Вя. ДНК-копии генов 3Ä, 3В и 3ÄB вируса получали методом ОТ-ПЦР, при амплификации использовали праймеры, в структуру которых были заложены сайты рестрикции BamHI и HindIII. Для амплификации гена 3Ä использовали праймеры 3AF и

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

АНДРИАНОВА Е.П., БОРИСОВ В.В., КРЕМЕНЧУГСКАЯ С.Р., ЛУГОВСКАЯ Н.Н., МАЙОРОВА Т.К., РАВИН Н.В., СКРЯБИН К.Г., ФОЛИМОНОВ А.С., ЭЛЬДАРОВ М.А. — 2011 г.

БОГАЧЕК М.В., ИВАНИСЕНКО В.А., ИВАНОВА А.В., КАЧКО А.В., ЛОКТЕВ В.Б., ПРОТОПОПОВА Е.В., ТЕРНОВОЙ В.А., ШВАЛОВ А.Н. — 2007 г.

ТАО ЦЗЭН, ЦУНИ ЧЖЭН, ЧАОЦЗЯН ГУ, ЧЖЕНЬХУЭЙ СЮЙ, ЧЖУНСИ МО, ЮН ЛИ — 2009 г.

РЕКОСЛАВСКАЯ Н.И., САЛЯЕВ Р.К., СТОЛБИКОВ А.С., ХЭММОНД Р.В., ЩЕЛКУНОВ С.Н. — 2009 г.

БЕЛКИ

Структура и молекулярная масса РНК-геномов вирусов животных

Таблица 4.

В зараженной клетке вирусный геном кодирует синтез двух групп белков: 1) структурных, которые входят в со­став вирусных частиц потомства, и 2) неструктурных, которые обслуживают процесс внутриклеточной репродукции вируса на разных его этапах, но в состав вирусных частиц не входят.

Количество структурных белков в составе вирусной частицы варьирует в широких пределах в зависимости от сложности организации вириона. Наибо­лее просто организованный вирус табачной мозаики со­держит всего один небольшой белок с молекулярной массой 17-18·10 3 , некоторые фаги содержат 2-3 белка, просто организованные вирусы животных — 3-4 белка. Сложно устроенные вирусы, такие как вирусы оспы, содержат более 30 структурных белков.

Структурные белки делятся на 2 группы:

1) капсидные белки, образующие капсид, т. е. футляр для нуклеиновой кислоты вируса (от лат. capsa — вме­стилище), и входящие в состав капсида геномные белки и ферменты;

2) суперкапсидные белки, входящие в состав суперкапсида, т. е. наружной вирусной оболочки.

Просто организованные вирусы, представляющие собой нуклеокапсид, содержат только капсидные белки. Сложно организованные вирусы содержат капсидные и суперкап­сидные белки.

Капсидные белки. Первоначальное представление о том, что капсидные белки являются всего лишь инерт­ной оболочкой для вирусной нуклеиновой кислоты, сложи­лось на основании изучения наиболее просто организо­ванного вируса табачной мозаики, частица которого со­стоит из одной молекулы РНК и одного типа белка, образующего чехол для РНК.

У ряда сложно организованных вирусов в составе кап­сида имеются ферменты, осуществляющие транскрипцию и репликацию вирусного генома — РНК и ДНК (РНК и ДНК-полимеразы), а также ферменты, модифицирую­щие концы иРНК. Если ферменты и геномные белки представлены единичными молекулами, то капсидные бел­ки представлены множественными молекулами. Эти белки и формируют капсидную оболочку, в которую у сложно организованных вирусов вставлены молекулы белков с дру­гими функциями.

Основным принципом строения капсидной оболочки вирусов является принцип субъединичности, т. е. построе­ние капсидной оболочки из субъединиц — капсомеров, обра­зованных идентичными полипептидными цепями. Правильно построенные белковые субъединицы — капсомеры возникают благодаря способности вирусных капсидных белков к самосборке. Самосборка объясняется тем, что упорядоченная структура — капсид имеет наименьшую свободную энергию по сравнению с неупорядоченными белковыми молекулами. Сборка капсидной оболочки из субъединиц запрограммирована в первичной структуре белка и происходит самопроизвольно или при взаимодействии с нуклеиновой кислотой.

Принцип субъединичности в строении вирусного капси­да является универсальным свойством капсидных белков и имеет огромное значение для вирусов. Благодаря этому свойству достигается огромная экономия генетического материала. Если бы капсидная оболочка была построена из разных белков, то на кодирование ее потребовалась бы основная часть генетической информации, заложенной в вирусном геноме. В действительности на кодирование, например, одной полипептидной цепи вируса табачной мозаики, расходуется менее 10 % генома. Далее, в меха­низме самосборки заложена возможность контроля за полноценностью вирусных полипептидов: дефектные и чу­жеродные полипептидные цепи при таком способе сборки вирионов будут автоматически отбрасываться.

Описанная способность к самосборке в пробирке и в зараженной клетке характерна только для простых виру­сов. Сборка сложно организованных вирусов является го­раздо более сложным многоступенчатым процессом, хотя отдельные ее этапы, например формирование капсидов и нуклеокапсидов, также основаны на самосборке.

Суперкапсидные белки. Гликопротеиды. Суперкапсидные белки, или пепломеры, располагаются в липопротеидной оболочке (суперкапсиде или пеплосе) сложно устроенных вирусов. Они либо пронизывают насквозь липидный бислой как, например, гликопротеиды альфа-вирусов (вируса леса Семлики), либо не доходят до внутренней поверхности. Эти белки являются типичны­ми внутримембранными белками и имеют много общего с клеточными мембранными белками. Как и последние, суперкапсидные белки обычно гликозилированы. Углевод­ные цепочки прикреплены к молекуле полипептида в опре­деленных участках. Гликозилирование осуществляют кле­точные ферменты, поэтому один и тот же вирус, проду­цируемый разными видами клеток, может иметь разные углеводные остатки: может варьировать как состав угле­водов, так и длина углеводной цепочки и место прикреп­ления ее к полипептидному ocтoвy.

Гликопротеиды являются амфипатическими молекула­ми: они состоят из наружной, гидрофильной части, кото­рая содержит на конце аминогруппу (N-конец), и погру­женной в липидный бислой, гидрофобной части, которая содержит на погруженном конце гидроксильную группу

Основной функцией гликопротеидов является взаимо­действие со специфическими рецепторами клеточной поверхности. Благодаря этим белкам осуществляется рас­познавание специфических клеточных рецепторов и прикрепление к ним вирусной частицы, т.е. адсорбция вируса на клетке. Поэтому гликопротеиды, выполняющие эту функцию, называют вирусными прикрепительными белка­ми.

Другой функцией гликопротеидов является участие в слиянии вирусной и клеточной мембран, т.е. в событии, ведущем к проникновению вирусных частиц в клетку. Ви­русные белки слияния ответственны за такие процессы, как гемолиз и слияние плазматических мембран соседних кле­ток, приводящие к образованию гигантских клеток, синцитиев и симпластов.

Просто организованные вирусы животных содержат прикрепительные белки в составе капсида. У сложно организованных вирусов эти белки входят в состав суперкапсида и представлены множественными молекулами.

Неструктурные белки изучены гораздо хуже, чем структурные, поскольку их выделяют не из очищенных препаратов вирусов, а из зараженных клеток, и возникают трудности в их идентификации и очи­стке от клеточных белков.

К неструктурным белкам относятся:

1) предшественники вирусных белков, которые отлича­ются от других неструктурных белков нестабильностью в зараженной клетке в результате быстрого нарезания на структурные белки;

2) ферменты синтеза РНК и ДНК (РНК и ДНК-полимеразы), обеспечивающие транскрипцию и реплика­цию вирусного генома;

4) ферменты, модифицирующие вирусные белки, на­пример протеиназы и протеинкиназы.

Однако многие неструктурные белки при ряде вирус­ных инфекций еще не идентифицированы и функции их не определены.

Типы структурных и неструктурных белков просто и сложно устроенных вирусов и их функции показаны на схеме 1.

Вирусология как наука. Её задачи и связь с другими биологическими науками.

Вирусология (virus – яд животного происхождения, logos - наука) – наука, которая изучает мельчайшие патогенные микроорганизмы - вирусы.

Общая вирусология изучает природу и происхождение, классификацию, строение и химический состав, генетику вирусов, механизмы взаимодействия вируса и клетки, вопросы противовирусного иммунитета.

Частная вирусология изучает отдельные вирусы, патогенные для человека и животного, особенности профилактики, диагностики, ликвидации.

Связь с другими науками: с бактериологией (микробиологией) - бактериологические методы (микроскопия, серологические методы, фильтрация, стерилизация); цитологией - методы цитологии при изучении взаимодействия вируса с клеткой и его структуры; с медициной и ветеринарией: патанатомией и патфизиологией – изучение патологических изменений в организме хозяина; с химией белков, физической химией (заимствует методы, принятые в этих науках).

Этапы развития вирусологии.

I период: с древнейших времен до 1892г.

Вирусологии как самостоятельной науки еще не существовало, и изучали болезни бактериологи:

Пастер - борьба с бешенством. Э.Дженнер в к. 18 в. - вакцинация от оспы.

II период: формирование вирусологии как науки с 1892 по 1950 г.

Был получен метод выделения вирусов.

III период: с 1950 г. - появление электронного микроскопа, что позволило изучать взаимодействие вируса с

клеткой на клеточном уровне.

Отличие вирусов от других инфекционных агентов.

1. Структура (архитектура) вирусных частиц – вирион.

2. В вирионе генетический материал - либо ДНК, либо РНК.

3. Отсутствие рибосом (синтез белка) и мезосом (энергетические системы).

4. Паразитизм генетический.

5. Репродуцируют только в живой клетке.

6. Способ размножения – разобщенный во времени и пространстве (дизъюнктивный) – в одной клетке могут

синтезироваться отдельно вирусный белок и нуклеиновые кислоты, далее происходит сборка и

Основные свойства вирусов.

1. Очень малые размеры. Измеряются в нанометрах (1 нм=10 -9 м= 10 -3 мкм): мелкие, средние, крупные.

Масса в дальтонах (1 дальтон (Да) = масса 1 атома водорода = 1,67*10 -24 г).

2. Имеют корпускулярную (в виде частиц – carpuscula - частица) структуру и определенную для каждого

вида морфологию. Основные формы вирусов: палочковидные, сферические (шаровидные),

кубоидальные; головчатые (в виде сперматозоида) (бактериофаги); нитевидные.

3. Нуклеиновая кислота и белки - основные компоненты вирусов.

4. Содержат только ДНК или РНК (вирусы растений содержат всегда РНК).

5. Строгие (облигатные) внутриклеточные паразиты.

6. Нет способности к бинарному делению, почкованию и т.д.

7. Обладают наследственностью и изменчивостью (как и другие живые организмы!).

8. Многие вирусы обладают способностью кристаллизоваться (кристаллы вируса табачной мозаики обнаружил Д.И. Ивановский в клетках растений).

Химический состав вирусов.

Белки и ДНК или РНК. Белки 49 - 89%; нуклеиновые кислоты 3,5 - 40%.

Большая часть белка (+липиды и углеводы) образуют оболочку вируса. Небольшая часть белка связана с нуклеиновой кислотой.

Вирусные белки – полипептиды из аминокислот.

Из нуклеиновой кислоты и белка реконструируется полный вирион (вирусная частица).

Нуклеиновая кислота окружена двумя или одной белковыми оболочками – капсидами.

Капсид состоит из многих одиночных белковых молекул, расположенных в определенном порядке – капсомеров.

Ассоциация нуклеиновой кислоты и капсомера – нуклеокапсид.

Многие вирусы кроме нуклеокапсида имеют дополнительные внешние оболочки – пеплосыпредставлены множеством пепломеров, состоящих из белков и липидов – под микроскопом как выросты и шипы. Крупные и средние вирусы могут содержать липиды, углеводы и другие органические и неорганические вещества.

Структурные и неструктурные вирусные белки.

Структурные белки – входят в состав зрелых внеклеточных вирионов, имеют функции: защита от внешних воздействий, взаимодействие с мембраной чувствительной клетки, взаимодействие с вирусной нуклеиновой кислотой и др. В зависимости от расположения в вирионе различают структурные белки капсидные, суперкапсидной оболочки, матриксные, вирусных сердцевин.

Неструктурные белки – кодируются вирусным геномом, но не входят в вирион (предшественники вирусных белков, вирусные ферменты, ингибиторы клеточного биосинтеза и разрушения клеток др.)

Дата добавления: 2018-05-02 ; просмотров: 1147 ;

Номер инновационного патента: 25095

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ15/3А - продуцент рекомбинантного неструктурного белка 3А вируса ящура.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии при разработке
методов дифференциальной диагностики ящура, а также в вирусологии для изучения биологических свойств вирусов.
Штамм Escherichia coli В834/рЕТ15/3А продуцент рекомбинантного неструктурного белка 3А вируса ящура получали путем трансформации экспрессионной плазмиды рЕТ15 несущий ген 3А неструктурного белка вируса ящура. Изучение антигенных и биохимических свойств рекомбинантного 3А неструктурного белка вируса ящура проводили с использованием непрямого варианта иммуноферментного анализа, денатури-рующего электрофореза в 15% полиакриламидном геле и иммуноблота.
Для получения максимального уровня полезного продукта применяется жидкая среда 2xYT (пептон - 16 г; дрожжевой экстракт - 10 г; NaCl - 5 г; рН-7,2-7,4 доводим 5 М NaOH; дистиллированная вода до 1 литра), инкубирование при 37°C, в течение 18-24 часов до OD600=0,8. После добавляют 0,1 мМ изопропил-β, D-тиогалактопиранозид и инкубируют при 30°C в течение 2 часов. Максимальный концентрация рекомбинантного неструктурного антигена 3А вируса ящура составляет 1 мг/мл.
Молекулярная масса рекомбинантного неструктурного белка 3А вируса ящура синтезируемый штаммом составляет 30 кДа.

Текст

(51) 12 15/42 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ методов дифференциальной диагностики ящура, а также в вирусологии для изучения биологических свойств вирусов. Штамм В 834/рЕТ 15/3 А продуцент рекомбинантного неструктурного белка 3 А вируса ящура получали путем трансформации экспрессионной плазмиды рЕТ 15 несущий ген 3 А неструктурного белка вируса ящура. Изучение антигенных и биохимических свойств рекомбинантного 3 А неструктурного белка вируса ящура проводили с использованием непрямого варианта иммуноферментного анализа, денатурирующего электрофореза в 15 полиакриламидном геле и иммуноблота. Для получения максимального уровня полезного продукта применяется жидкая среда 2 (пептон 16 г дрожжевой экстракт - 10 г- 5 г рН-7,27,4 доводим 5 Мдистиллированная вода до 1 литра), инкубирование при 37, в течение 18-24 часов до 6000,8. После добавляют 0,1 мМ изопропил-, -тиогалактопиранозид и инкубируют при 30 в течение 2 часов. Максимальный концентрация рекомбинантного неструктурного антигена 3 А вируса ящура составляет 1 мг/мл. Молекулярная масса рекомбинантного неструктурного белка 3 А вируса ящура синтезируемый штаммом составляет 30 кДа.(72) Мукантаев Канатбек Найзабекович Турсунов Канат Лазарев Василий Николаевич Левицкий Сергей Алексеевич Харлампиева Дарья Дмитриевна Кущева Надежда Александровна Балтин Кайрат Канатович Муканов Касым Касенович Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан В 834/РЕТ 15/3 А ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО НЕСТРУКТУРНОГО БЕЛКА 3 А ВИРУСА ЯЩУРА(57) Штамм микроорганизмаВ 834/рЕТ 15/3 А - продуцент рекомбинантного неструктурного белка 3 А вируса ящура. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии при разработке Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии при разработке методов диагностики ящура. Важнейшим аспектом предотвращения эпидемии ящура среди животных и его дальнейшего распространения является дифференциальная диагностика вакцинированных животных от скрытых вирусоносителей. Известно,что серологическими методами на основе структурных,капсидных белков вируса провести дифференцирование вакцинированных животных от больных не возможно, так как обе группы имеют нейтрализующие антитела в сыворотке крови. Вместе с тем, вирус ящура имеет неструктурные белки характерные только для живых вирусных частиц, следовательно наличие в сыворотке антител к данному антигену характерно только для больных животных. Тесты, основанные на использовании неструктурных белков, имеют дополнительное преимущество антитела к структурным белкам, не специфичны по серотипам неструктурные белки вируса преимущественно сохраняют различие между серотипами вируса ящура. Известен штамм 53,продуцирующий неструктурный белок 3 АВС вируса ящура типа О 1(М., Е. . 3//., 1997, 142, . 2021-2033). Авторами для получения рекомбинантного неструктурного белка использовалась рЕХ-плазмида. Данная конструкция в . 53 экспрессировала рекомбинантный неструктурный белок 3 АВС вируса ящура типа О 1. Известна вакцина против вируса ящура содержащая активное вещество на основе пептидов с последовательностью из, по меньшей мере, восьми аминокислот, соответствующей части последовательности из области неструктурированного белка вируса ящура, которая была отобрана благодаря иммунореактивности со специфичными к вирусу ящура антителами или благодаря иммунореактивности со специфичными к вирусу ящура Тлимфоцитами. Пептиды получены путем проведения синтеза на модифицированном робототехническом синтезаторе пептидов. Задачей изобретения является получение штамма, продуцента рекомбинантного неструктурного белка вируса ящура. Штамм получали следующим образом. Поиск нуклеотидной последовательности неструктурных белков для использования в диагностической иммуноферментной тест-системе для диагностики ящура проводили с использованием баз данныхи. Анализ первичных структур проводился с использованием пакета программ 9.0. Для получения штамма продуцента использовали штамм Е.5, плазмидный вектор -. Клетки Е.выращивали на жидкой и плотной питательных средах . В качестве матрицы для проведения ПЦР использовали к ДНК вируса ящура штамма А. Плазмидную ДНК выделяли из штамма . 5 методом щелочного лизиса. 0.1 л среды(1 бакто-триптона, 0.5 дрожжевого экстракта. 1 1 заражали штаммом, несущим плазмиду и растили до оптической плотности 600 0.7 - 0.8,затем добавляли хлорамфеникол до конечной концентрации 170 мкг/мл и инкубировали 14-18 часов при 37 и интенсивном покачивании. Клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием,ресуспендировали в 10 мл буфера (50 мМ глюкозы,25 мМ трис -18, 10 мМ ЭДТА, 5 мг/мл лизоцима). Инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Добавляли 20 мл раствора,содержащего 0.2 Н , 1 . Инкубировали 10 минут на льду. Добавляли 15 мл 5 М ацетата калия, инкубировали 10 минут на льду,центрифугировали 20 минут 20 тыс.об/мин. К супернатанту добавляли 0.6 объема изопропанола и после 15 минут инкубации при комнатной температуре осаждали ДНК центрифугированием 30 минут 12 тыс. об/мин. Осадок промывали 70 этанолом и растворяли в буфере ТЕ. Плазмидную ДНК очищали изопикническим центрифугированием в градиенте плотности 1 в присутствии бромистого этидия в вертикальном роторе -80 центрифуги 7-55 (, США). Разделение фрагментов ДНК проводили согласно Маниатису, методом электрофореза в горизонтальных агарозных гелях с концентрацией агарозы от 1 до 3. Электрофорез проводили при комнатной температуре в трис-ацетатном буфере(0.04 М трис-ацетат 8.1, 0.002 М ЭДТА) с содержанием 0.5 мкг/мл бромистого этидия, при напряженности электрического поля 10 В/см в течение 30-60 мин. Препаративное разделение фрагментов ДНК проводилось в 0.8 агарозном геле. Фрагменты выделяли из геля методом электроэлюции. Полученный раствор ДНК экстрагировали смесью фенол-хлороформ и хлороформом, после чего преципитировали этанолом. Эффективность элюции контролировали методом электрофореза в агарозном геле. Для лигирования фрагментов ДНК использовали ДНК-лигазу фага Т 4. Состав буфера 250 мМ трис 1 рН 7.2. 25 мМ КС 1, 5 мМ 12, Ю мМ ДТТ,1 мМ трихлорида гексааминокобальта. Реакция лигирования заканчивалась после инкубации в течение 45 минут при комнатной температуре. Гидролиз плазмидной ДНК проводили с использованием эндонуклеаз рестрикции ,ив соответствующих буферных и температурных условиях согласно рекомендациям производителей. Для трансформации клеток лабораторных штаммов .5 использовали метод. Эффективность трансформации составляла 10-510 трансформантов на 1 мкг суперскрученной ДНК плазмиды -. При клонировании фрагментов ДНК в плазмидных векторах для поиска рекомбинантов использовали методы контрселекции 25095 на средах с антибиотиками и метод скрининга рекомбинантов с использованиеми -. Первичную структуру ДНК определяли по методус использованием наборовна автоматических анализаторах ДНК 3100( , США). Синтез дезоксиолигонуклеотидов производили фосфоамидитным способом на автоматическом синтезаторе -700. Полученной экспрессионной плазмидой трансформировали компетентные клетки Е.штамма 834(3),трансформантов высевали на селективную среду с ампициллином (100 мкг/мл). Выросшими колониями инокулировали 100 мл среды 2 (Ар 100 мкг/мл), культивировали до 600 0. 8 при 37. Затем индуцировали экспрессию гена добавлением до концентраций 0.1 мМ, 0.25 мМ, 0.5 мМ и 1 мМ. После добавления индуктора температуру культивирования снижали до 28 и культивировали индуцированную культуру 4-5 часов. После этого клетки собирали центрифугированием (3000 15 минут), промывали небольшим объемом охлажденногои разрушали ультразвуком с помощью дезинтегратора УЗДН-2(Россия),следуя рекомендациям производителя прибора. Полученный лизат осветляли центрифугированием (40 000 45 минут). Штамм микроорганизма 834/5/3 продуцент рекомбинантного неструктурного белка 3 А вируса ящура депонирован и хранится в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан (010000,г. Астана, ул. Ч. Валиханова, 43) под регистрационным номером - 0283 и характеризуется следующими свойствами. Морфологическая характеристика. Штамм микроорганизма 834/5/3 представляют собой прямые грамотрицательные палочки размером 1,1-1,52,0-6,0 мкм, концы палочек закруглены, спор и капсул не образуют. Культуральные свойства. Клетки культивируют в среде 2, в течение 24 часов при 37 в анаэробных условиях. На твердых питательных средах бактериальные клетки образуют крупные,выпуклые,круглой правильной формы,полупрозрачные колонии мягкой консистенции. В жидкой питательной среде клетки образуют равномерное помутнение. Образуют индол, не образует сероводород. Продуктивность штамма. Для получения максимального уровня полезного продукта применяется жидкая среда 2 (пептон - 16 г дрожжевой экстракт - 10 г 1 - 5 г рН-7,2-7,4 доводим 5 Мдистиллированная вода до 1 литра), инкубирование при 37, в течение 18-24 часов до 6000,8. После добавляют 0,1 мМ изопропил-, -тиогалактопиранозид и инкубируют при 30 в течение 2 часов. Максимальный концентрация рекомбинантного неструктурного антигена 3 А вируса ящура составляет 1 мг/мл. Характеристика полезного продукта. Молекулярная масса рекомбинантного неструктурного белка 3 А вируса ящура синтезируемый штаммом составляет 30 кДа. Методы оценки специфичности МКА Продукция неструктурного белка вируса ящура определяется электрофорезом в СДС полиакриламидном геле ( 4 // . - 1970. - . 27. -. 680685). Специфичность полученных антигенов определяется в иммуноферментном анализе. Контаминация. Контаминантов в клетках включая, бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружено. Криоконсервация. Криоконсервация с использованием 2, 20 глицерина, 10 сахарозы, 10 поливинилпиролидона, концентрация клеток 109 КОЭ/мл. Для лиофилизации используют защитную среду обезжиренное молоко в соотношении 11,концентрация клеток 109 КОЭ/мл. Лиофильно высушенные образцы,при температуре хранение 4, минус 20, 40 и 80 в течение 10 лет. Криоконсервированные образцы,при температуре хранение при -80, в течение 10 лет. Среда 2 (4) на скошенном агаре(пересев 1 р./3 мес.) и под вазелиновым маслом в высоком столбике (пересев 1 р./г.) Условия размораживания. Замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню при 37 С. После размораживания суспензию клеток переносят в стерильную пробирку, содержащую 10 мл жидкой среды 2 (пептон - 16 г дрожжевой экстракт - 10 г 1 - 5 г рН-7,2-7,4 доводим 5 Мдистиллированная вода до 1 литра) и инкубируют при 37, в течение 18-24 часов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 85. Леофильно высушенные образцы разводят в 1 мл стерильного физиологического раствора и пересевают в стерильную жидкую среду 2(пептон - 16 г дрожжевой экстракт - 10 г- 5 г рН-7,2-7,4 доводим 5 Мдистиллированная вода до 1 литра) и инкубируют при 37, в течение 18-24 часов. Штамм микроорганизма 834/15/3 - продуцент рекомбинантного неструктурного белка 3 А вируса ящура используют следующим образом. Пример 1. Компетентные клетки Е.штамма 834/15/3 культивируют в 1000 мл среды 2(пептон - 16 г дрожжевой экстракт - 10 г 1 - 5 г рН-7,2-7,4 доводим 5 Мдистиллированная вода до 1 литра, ампициллин - 100 мкг/мл), при температуре 37 до 600 0.8. Затем индуцируют экспрессию гена добавлениемв концентраций 0,1 мМ. После добавления индуктора клетки культивируют при 30 и в течение 8 часов. Клетки Е. , содержавшие наработанный химерный рекомбинантный белок, осаждают центрифугироваием при 3000 в течение 20 минут,3 25095 осадок промывают 1/3 объема физраствора,центрифугируют при 3000 20 минут и ресуспендируют в 10-30 мл буфера для металлаффинной хроматографии(25 мМ натрийфосфатный буфер 7.4, 400 мМ , 20 имидазол). Клетки разрушают ультразвуком (22,4 раза по 20 секунд), нерастворимую фракцию отделяют центрифугированием при 50000 в течение 45 минут. Нерастворимую фракцию(осадок) ресуспендируют в 10 мл 25 мМ буфера для металл-аффинной хроматографии с 8 М мочевиной,инкубируют 1 час на магнитной мешалке, затем центрифугируют при 50000 в течение 45 минут. Полученный таким образом осветленный лизат фильтруют через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0.45 мкм) и подвергают металл-аффинной хроматографии. Рекомбинантный белок очищают на колонке использованием хроматографической системы(, США). Элюцию проводят буфером (25 мМ натрий-фосфатный буфер 7.4,400 мМ , 20 имидазол, 8 М мочевина). Ренатурацию рекомбинантного белка проводят с помощью диализа против 300-кратного объема 25 мМ натрий-фосфатного буфера 7.25 с 300 мМ. Ренатурированный белок анализируют денатурирующим электрофорезом в 15 ПААГ. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм микроорганизма В 834/рЕТ 15/3 А - продуцент рекомбинантного неструктурного белка 3 А вируса ящура высокочувствительный и специфичный реагент для разработки методов дифференциальной диагностики ящура сельскохозяйственных животных.