Что такое реассортантный вирус а
Вирусы, имеющие сегментированный геном, могут быть аттенуированы путем генной реассортации. Реассортация является формой генетической рекомбинации, наблюдаемой у РНК-вирусов с сегментатированным геномом. Реассортация обнаружена у семейств с 2 (арена- и бирнавирусы), 3 (буньявирусы) 6, 7 или 8 (ортомиксовирусы) или 10, 11 или 12 (реовирусы) геномными сегментами. В клетках инфицированных двумя родственными вирусами внутри каждого семейства может происходить обмен сегментами с образованием жизнеспособных стабильных реассортивов. Они встречаются в природе и являются важным источником генетической вариабельности. Цель получения аттенуированных реассортантов, пригодных для использования в качестве живой вакцины, состоит в том, чтобы заранее полученным и охарактеризованным аттенуированным штаммам придать необходимую антигенность в соответствии с антигенностью актуальных полевых изолятов вируса.
От доноров аттенуации берут гены, кодирующие внутренние белки и ограничивающие репликацию, от актуальных эпидемических (эпизоотических) штаммов заимствуют гены, кодирующие поверхностные белки (гликопротеины). Эту технологию используют длительный период, хотя до сих пор удачной вакцины не было создано. Вирусные реассортанты были получены при рекомбинации вирулентных штаммов вируса гриппа А человека с различными генетически модифицированными штаммами этого вируса. Существует несколько способов для достижения аттенуации вируса гриппа путем реассортации генов. Первый заключается в аттенуации вируса донора генов последовательным пасссированием вируса в куриных эмбрионах. Аттенуированные для человека штаммы могут быть использованы для рекомбинации с эпидемическими штаммами. Этот способ применяли в СССР, Великобритании, Бельгии.
Второй способ принципиально сходен с первым и отличается тем, что аттенуацию осуществляют пассированием вируса при пониженной температуре (25—30°С). Свойство аттенуации передается от холодо-адаптированного донорского штамма полевым изолятам вируса при рекомбинации. Этот метод впервые применили в нашей стране (Г.И. Александрова), затем он получил развитие в США. Полученные таким образом реассортанты при испытаниях на добровольцах оказались стабильными и сохраняли признаки аттенуации и иммуногенность. Третий способ заключается в том, что для реассортации генов в качестве донора аттенуации используют штаммы вируса гриппа птиц, не вирулентные для человека.
Ограниченную репродукцию вируса гриппа птиц в нижнем отделе респираторного тракта обезьян контролировали шесть генов, кодирующих внутренние белки вируса. Аттенуированный фенотип реассортанта вируса гриппа А птица — человек оказался стабильным в течение пяти пассажей на обезьянах. Однако инфекция реассортантом индуцировала незначительную резистентность обезьян к последующему их контрольному заражению вирулентным вирусом гриппа А человека.
Четвертый способ основан на получении температурочувствительных (ts) мутантов вируса с помощью химических агентов. Реассортантные аттенуированные штаммы вируса гриппа получены на основе таких доноров (ts-мутантов). Но осталась нерешенной проблема усиления их вирулентности для человека. Наиболее распространенным в настоящее время остается второй метод аттенуации. Считается, что для обеспечения достаточного уровня аттенуации и ее стабильности необходимо, чтобы реассортантные штаммы получили от донора шесть генов. Молекулярно-генетическим анализом установлено наличие множественных мутаций во всех восьми генах, что свидетельствует о невозможности реверсии ts-признака к дикому типу.
В результате использования таких методов были сконструированы живые реассортантные вакцины против гриппа, включающие два гена, кодирующие поверхностные гликопротеины (НА и NA) современного вирулентного штамма, и шесть генов, кодирующие внутренние белки донора аттенуации.
В условиях широкого эпидемиологически контролируемого наблюдения на группе из 30 000 детей установлена безвредность, высокая иммунологическая и профилактическая эффективность этой вакцины, а также генетическая стабильность холодоадаптированных рекомбинантов.
Живые (реассортантные) вакцины против ротавирусной инфекции человека были созданы на базе культуральных аттенуированных ротавирусов крупного рогатого скота и обезьян. В случае с реассортантным вирусом, приготовленном на базе вируса обезьян, от ротавируса человека был взят только один ген, кодирующий главный протективный белок VP7. Для реассортации брали гены ротавируса человека 1-, 2-й 4-серотипов. Вакцинация реассортантным вирусом вызывала сероконверсию у 70% привитых индивидуумов.
Термочувствительные реассортанты вирусов гриппа человек/лошадь (H3N8) создавали защиту у вакцинированных лошадей независимо от антител к ГА. Реассортация является феноменом, редко встречеющимся в природных условиях. Она ответственна, например, за антигенный шифт вируса гриппа. У КРС найдены реассортанты вируса катаральной лихорадки овец. В опытах in vitro установлено, что реассортация двух штаммов с пониженной вирулентностью приводила к появлению высоковирулентного вируса.
doi: 10.18527/2500-2236-2016-3-1-42-48
Получена: 2016-06-08 Принята к печати: 2016-07-02 Опубликована: 2016-08-16
Ю. А. Дешева 1,2# , T. А. Смолоногина 1 , Г. О. Ландграф 2 , Л. Г. Руденко 1
# Для корреспонденции: Ю.A. Дешева, e-mail: [email protected]
Холодоадаптированный реассортантный штамм вируса гриппа А/17/серебристая чайка/Сарма/2006/887 (H6N1) получен на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) методом генетической реассортации в куриных эмбрионах. Структура генома реассортанта была проанализирована методом ПЦР в реальном времени с последующим анализом кривых плавления высокого разрешения (high resolution melting, HRM-анализ) при использовании интеркалирующего флуоресцентного красителя EvaGreen. Анализ кривых плавления ДНК копий РНК фрагментов (PB2, PB1, PA, NP, М, NS) показал, что реассортантный вирус гриппа А/17/серебристая чайка/Сарма/2006/887 (H6N1) унаследовал гены внутренних и неструктурных белков от донора аттенуации. По антигенным свойствам реассортант соответствовал вирусу гриппа птиц А/серебристая чайка/Сарма/51с/2006 (H6N1). Изучение фенотипических свойств реассортанта показало, что вирус А/17/серебристая чайка/Сарма/2006/887 (H6N1) характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью в куриных эмбрионах и аттенуирован для мышей при интраназальном введении. Данный реассортант может быть рекомендован кандидатом в вакцинные штаммы для живой гриппозной вакцины для людей.
The cold-adapted reassortant influenza virus А/17/herring gull/Sarma/2006/887 (H6N1) was developed in chicken embryos by genetic reassortment based on the A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) master donor virus. The genome composition of the obtained reassortant was analyzed by means of real time PCR with the high resolution melting (HRM-analysis) using an intercalating fluorescent dye EvaGreen. Analysis of the DNA copies melting curves of RNA gene fragments (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) showed that the reassortant influenza virus А/17/herring gull/2006/887(H6N1) contained the internal proteins coding genes from the master donor virus and the surface antigens coding genes from the A/herring gull/Sarma/51c/2006 (H6N1) avian influenza virus. The study of phenotypic properties showed that the А/17/herring gull/Sarma/2006/887 (H6N1) is temperature sensitive (ts) and cold-adapted (ca) in chicken embryos and attenuated in mice when administered intranasally. This reassortant can be recommended as a live influenza vaccine candidate for humans.
Вирус гриппа подтипа H6N1, который активно выделяется в последнее время от диких и домашних птиц, относится к семейству Orthomyxoviridae и роду Influenzavirus А. До настоящего времени не было отмечено тяжелых случаев инфицирования человека вирусами данного подтипа. Однако серологические наблюдения, проводимые в Южном Китае, выявили наличие антител к вирусам гриппа подтипа H6 у 13% жителей различных провинций [1]. Филогенетический анализ вирусов гриппа А свидетельствует, что близкородственные гены, кодирующие внутренние белки, встречаются у вирусов гриппа А различных подтипов и между вирусами гриппа птиц и человека возможна реассортация [2]. Также установлено, что некоторые из сегментов генов NP и NA высокопатогенных вирусов H5N1 происходят от вируса H6 диких уток [3, 4]. Таким образом, вирус гриппа птиц подтипа H6N1 является потенциально опасным для людей, что вызывает необходимость разработки соответствующего вакцинного штамма для защиты людей от возможной инфекции. Один из вакцинных кандидатов для живой гриппозной вакцины (ЖГВ) – вирус A/чирок/Гонконг/97/AA (H6N1) – был получен на основе донора аттенуации А/Энн Арбор/6/60 (H2N2) (Flumist®, США) с использованием вируса гриппа птиц подтипа H6N1, выделенного в 1997 году [5]. Однако данный вакцинный вирус очень слабо репродуцировался в респираторном тракте вакцинируемых и проявил низкую иммуногенную активность. Современные живые гриппозные вакцины представляют собой аттенуированные реассортантные штаммы с формулой генома 6:2. Гены, кодирующие гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального штамма, а шесть генов, кодирующих негликозилированные белки, – от холодоадаптированного (ХА) донора аттенуации.
Ранее нами уже были получены и изучены вакцинные штаммы, содержащие поверхностные антигены апатогенных вирусов гриппа птиц подтипов А(H5N2), А(H7N3) и А(H9N2), на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) (Лен/17), который лицензирован в Российской Федерации для подготовки вакцинных штаммов ЖГВ для иммунизации взрослых и детей от 3-х лет 9. Вакцинные штаммы сероподтипов H5N2 и H7N3 были проверены в клинических исследованиях и показали высокую иммуногенную активность, вызывая сероконверсии у 54.8% и 72% привитых после двукратной иммунизации, соответственно. Цель настоящего исследования состояла в получении вакцинного кандидата подтипа H6N1 на основе донора Лен/17, содержащего поверхностные антигены вируса А/серебристая чайка/Сарма/51с/2006 (H6N1), и в изучении его свойств in vitro и на лабораторных животных.
Традиционно анализ состава генома кандидатов в вакцинные штаммы, полученных методами классической генетической реассортации, осуществляется методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и последующим рестрикционным анализом продуктов амплификации [10] или мультиплексной ПЦР [11] и последующим полным секвенированием всех генов реассортанта. Для быстрого анализа состава генома потенциальных вакцинных кандидатов применяют также ПЦР в реальном времени с использованием гидролизируемых олигонуклеотидных зондов [12] и пиросеквенирования [13]. Для упрощения процедуры скрининга вакцинных кандидатов мы предлагаем использовать ПЦР в режиме реального времени с анализом кривых плавления высокого разрешения (HRM-анализ). Данный метод позволяет экономить время по сравнению с визуализацией результатов в агарозном геле при ПЦР-анализе и снижает риск контаминации ампликонами. Кроме того, данный метод является сравнительно недорогим, так как не требует использования дорогостоящих флуоресцентных олигонуклеотидных зондов.
Вирусы
ОТ-ПЦР в реальном времени с HRM-анализом
Для генотипирования вирусную РНК выделяли из 80 мкл вирусосодержащей аллантоисной жидкости с помощью набора QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Нидерланды). Полученные образцы РНК хранились при температуре -20°С. ОТ проводили с использованием ревертазы мышиного вируса лейкемии Молони (M-MulV Reverse Transcriptase, СибЭнзим) и случайных гексамеров. ПЦР в реальном времени проводили с использованием термоциклера CFX96 (Bio-Rad, США) с праймерами, разработанными для генов внутренних и неструктурных белков донора аттенуации Лен/17 [10]. Дополнительно для генов РВ1 и РА с помощью программы Primer3 [15] были разработаны следующие пары праймеров: PB1-F781 (5’ TACTTTGTCGAAACACTAGCGA 3’), PB1-R952 (5’ TCCATTTGGTATTGTCTCCAG 3’); PA-F47 (5’ GCTTCAATCCGATGATTGTCGAGC 3’), PA-R206 (5’ ATTGACTCGCCTTGCTCATT 3’). Реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержащем 10 мкл реакционной смеси SsoFast™ EvaGreen® Supermix (Bio-Rad, США), 0.5 мкM каждого праймера, 4 мкл кДНК и воды, свободной от РНКаз, согласно рекомендациям производителя. Плавление продуктов ПЦР осуществляли при температуре от 65°С до 95°С с инкрементом в 0.5°С. HRM-анализ кривых плавления проводили с использованием компьютерного программного обеспечения Precision Melt Analysis Software, Version 1.1 (Bio-Rad, США).
Секвенирование по Сэнгеру
Для частичного секвенирования были получены ДНК-копии сегментов РНК PB2, PB1, PA, NP и NA с помощью набора OneStep RT-PCR Kit (Qiagen, Нидерланды). После электрофореза в 1.5% агарозном геле ДНК-копий и очистки посредством QIAquick PCR purification Kit (Qiagen, Нидерланды) секвенирование было выполнено с помощью набора реактивов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, США) на ДНК-анализаторе ABI 3730xl. Обработку электрофореграмм нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета программ 3730 Data Collection v3.0 software (Applied Biosystems, США). Частичные нуклеотидные последовательности генов РВ2, РВ1 и NP депонированы в базе данных GISAID EpiFlu под номерами PB2 EPI774106, PB1 EPI774107 и NP EPI774105.
Определение принадлежности генов, кодирующих поверхностные антигены
Происхождение НА было подтверждено в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) со специфической крысиной антисывороткой. Происхождение гена NA реассортанта было определено в одноступенчатой ОТ-ПЦР с праймерами NA-F101 (5’ GATTAGCTCAACCCAGAAAC 3’) и NA-R605 (5’AGAAAAAGGAAAAGTAGTAAATCA 3’) с последующим секвенированием полученного фрагмента.
Изучение прививочных свойств реассортантного вируса на мышах
Статистический анализ
Реассортантный кандидат в вакцинные штаммы был получен методом классической генетической реассортации вируса гриппа птиц H6N1/дт и ХА донора аттенуации Лен/17, как описано в [17], и назван Лен17/Н6. В РТГА со специфической крысиной антисывороткой было подтверждено происхождение гена НА реассортанта Лен17/Н6 от вируса гриппа птиц H6N1/дт. Путем секвенирования фрагмента гена NA было показано, что ген NA реассортанта также происходит от вируса H6N1/дт.
Происхождение остальных генов реассортанта определяли методом ПЦР в реальном времени с последующим HRM-анализом с применением интеркалирующего флуоресцентного красителя EvaGreen. ПЦР в реальном времени с использованием неспецифических ДНК-связывающих красителей обычно включает анализ кривых плавления продуктов ПЦР. Для этого температура в пробах постепенно увеличивается, что приводит к высвобождению флуорофора из денатурированной двухцепочечной ДНК. Скорость изменения флуоресценции позволяет выявить пик, который соответствует температуре плавления комплексов двухцепочечной ДНК. Праймеры-димеры обычно плавятся при более низкой температуре благодаря их меньшему размеру, что дает возможность дискриминации амплифицированного фрагмента ПЦР от праймеров-димеров и других неспецифических продуктов.
Анализ кривых плавления высокого разрешения, предложенный в [18], позволяет генерировать профили кривых плавления, которые достаточно специфичны и чувствительны для разделения нуклеиновых кислот на основании незначительных различий в них, что делает возможным сканирование мутаций, анализ метилирования и генотипирование [19]. HRM-анализ может использоваться для характеристики образцов на основании их CG-состава и комплементарности последовательностей ДНК. Возрастающий интерес к упрощению анализа однонуклеотидных полиморфизмов приводит к активному развитию HRM-технологии. Для проведения анализа кривых плавления высокого разрешения рекомендуют использовать интеркалирующие красители третьего поколения, такие как EvaGreen, LCGreen и SYTO9 [20]. Эти красители малотоксичны, не вызывают ингибирования течения ПЦР и могут использоваться в ПЦР в реальном времени в более высоких концентрациях по сравнению с SybrGreen, что позволяет достичь более полного насыщения ими двухцепочечной ДНК и уменьшить динамическое перераспределение красителя в неденатурированные области ДНК при ее плавлении. HRM-анализ начинает вводиться в практику при изучении вирусов гриппа, например, для детекции и количественного анализа вируса [21], а также для скрининга появляющихся в популяции новых штаммов [22].
Верификацию полученных данных проводили при помощи классического метода ОТ-ПЦР с последующим рестрикционным анализом, как описано в [10]. На Рис. 2 видно, что ДНК-фрагменты генов PB2, NP, M и NS донорского штамма и вакцинного кандидата разрезаются рестриктазами на фрагменты, что соответствует наличию в них нуклеотидных замещений, характерных для донора аттенуации (PB2 и NS), или вирусов подтипа H2N2 (NP и M), в то время как амплификаты вируса гриппа птиц не режутся. Полученные результаты подтверждают данные HRM-анализа и свидетельствуют, что процесс плавления продуктов ПЦР не нарушает структуры дуплекса, что делает возможным дополнительный анализ амплификатов другими методами. В то же время на Рис. 2 видно отсутствие амплификации фрагментов РВ1 и РА вируса H6N1/дт с праймерами, специфичными для генов донора аттенуации Лен/17, вследствие выраженных различий между вирусами подтипов H2N2 и H6N1. В связи с этим для генов РВ1 и РА были разработаны новые праймеры с целью амплификации более коротких участков (781-952 и 47-206, соответственно). Амплификация фрагментов генов РВ1 и РА вируса H6N1/дт с новыми праймерами прошла успешно, что было подтверждено секвенированием полученных фрагментов. Рис. 3 показывает, что при HRM-анализе, выполненном с помощью программы Precision Melt Analysis, имеется отчетливое различие кривых плавления для фрагментов генов донора аттенуации Лен/17 и Лен/дт, отличающихся всего на одну нуклеотидную замену.
Таким образом подтверждено, что реассортант Лен17/Н6 приобрел 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки от донора Лен/17. Поиск гомологичных последовательностей в GenBank, проведенный с помощью компьютерной программы BLAST [23], показал, что ген РВ1 вируса H6N1/дт наиболее близок гену вируса гриппа птиц A/утка/Цзянси/5945/2008 (H6N1) (GenBank, KP287703.1), а ген PА – гену вируса A/утка/Гуйчжоу /2492/2007 (H6N1) (GenBank, CY109657.1) (99% гомологии). Сравнение последовательностей гена PB1 донора аттенуации Лен/17, реассортанта Лен17/H6 и вируса дикого типа H6N1/дт показало, что как донор аттенуации, так и реассортант отличаются от вируса дикого типа по положению 819 (Т вместо А), которое находится в специфическом сайте расщепления и позволяет различить данные гены с помощью традиционного рестрикционного анализа (Рис. 3). В то же время в гене РА в положении 107 присутствует нуклеотид С не только у реассортанта и донора аттенуации, но и у вируса H6N1/дт, а также у вируса гриппа птиц A/утка/Гуйчжоу/2492/2007 (H6N1). Поскольку указанный нуклеотид также входит в специфический сайт расщепления, то в данном случае определить происхождение генов с помощью традиционного рестрикционного анализа становится невозможным. Данные результаты подтверждают ограниченные возможности используемого рестрикционного анализа при генотипировании вакцинных штаммов вирусов гриппа птиц и свидетельствуют о необходимости применения новых методов скрининга вакцинных кандидатов.
При изучении репродукции вакцинного кандидата Лен17/H6 в куриных эмбрионах при различной температуре было показано, что данный вирус, так же как и донорский штамм Лен/17, проявляет свойства температурочувствительности и ХА, в отличие от штамма H6N1/дт. Разница титров вакцинного кандидата при оптимальной (33˚С) и повышенной (39˚С) температуре составила 7.0 log10ЭИД50/мл, отличие в показателях репродукции при пониженной и оптимальной температуре не превышало 3.0 log10 ЭИД50/мл (Табл. 1).
Вирус
Характеристика препарата
Репродукция в куриных эмбрионах, log10 ЭИД50/мл
Репродукция в дыхательных путях мышей на третьи сутки, log10 ЭИД50/мл, n=4
| Классы МПК: | C12N7/00 Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их A61K39/145 Orthomyxoviridae, например вирус гриппа | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Автор(ы): | Дешева Юлия Андреевна (RU) , Смолоногина Татьяна Анатольевна (RU) , Руденко Лариса Георгиевна (RU) , Киселева Ирина Васильевна (RU) , Ларионова Наталья Валентиновна (RU) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Патентообладатель(и): | Учреждение Российской Академии медицинских наук научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН (НИИЭМ СЗО РАМН) (RU) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Приоритеты: |
| Таблица 1 | ||||||
| Антигемагглютинирующие антитела к вирусам A(H1N1), A(H3N2) и A(H7N1) в сыворотках волонтеров после прививки сезонной тривалентной ЖГВ | ||||||
| Группы | A(H1N1) | A(H3N2) | A(H7N7) | |||
| % сероконверсий | СГТ- | % сероконверсий | СГТ- | % сероконверсий | СГТ- | |
| ЖГВ | 30 | 13,8 | 40 | 21,6 | 0 | 5,0 |
| Плацебо | 0 | 9,1 | 5 | 11,7 | 0 | 5,0 |
Показано также, что реассортантный вирус не проявляет перекрестного реагирования с вирусом птичьего гриппа А/утка/Потсдам/1402-6/86 (H5N2) (см. таблицу 2).
Таким образом, представленный реассортантный штамм обладает антигенной специфичностью гемагглютинина вируса А/лошадь/Прага/1/56(Н7N7), что исключает перекрестное реагирование с гемагглютининами циркулирующих сезонных вирусов А(Н1N1) и A(H3N2), а также с гемагглютининами вирусов гриппа птиц подтипа Н5.
Наличие нейраминидазы вируса гриппа птиц N1 делает возможным применение указанного штамма для выявления перекрестно-реагирующих антител в данной нейраминидазе у лиц, перенесших инфекцию или прошедших вакцинацию гриппозными вакцинами.
Репродуктивная активность штамма в куриных эмбрионах составляет 8,8 Ig ЭИД 50 / 0,2 мл.
Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов Учреждения Российской Академии Медицинских Наук Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под № ГКВ № 2473. Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.
ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛУЧЕННОГО ШТАММА.
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33°С в течение 36 часов - 8,8 Ig ЭИД 50 / 0,2 мл.
Гемагглютинирующая активность - 1:512.
Паспорт на вакцинный штамм RN1/09-swine A(H7N1) прилагается.
вируса гриппа RN1/09-swine А(Н7N1)
1. Название штамма - RN1/09-swine A(H7N1) [А/лошадь/Прага/1/1956(Н7)-А/17/Калифорния/09/38(N1)]
2. Серия - серия 1
3. Метод получения - реассортация
4. Характеристика родительских вирусов:
а) вирус гриппа лошади - А/лошадь/Прага/1/1956(Н7N7);
б) вакцинный штамм А/17/Калифорния/09/38(Н1N1) на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/1957(H2N2)
5. Количество пассажей - 6 в процессе рекомбинации; 3 накопительных пассажа в системе развивающихся куриных эмбрионов
6. Характеристика штамма до лиофилизации:
а) оптимальные условия репродукции - 33°С, 48 часов;
б) гемагглютинирующая активность 1:512;
в) инфекционная активность 8,8 Ig ЭИД 50 / 0,2 мл;
г) чувствительность к ингибиторам: ингибиторорезистентный;
д) структура генома реассортанта:
- гены от вируса гриппа лошади: НА;
- гены от вакцинного штамма - РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS и NA
7. Характеристика штамма после лиофилизации:
а) дата лиофилизации: 24.12.2009;
б) объем материала в ампуле: 1 мл;
в) инфекционная активность - 6,05 Ig ЭИД 50 / 0,2 мл;
д) гемагглютинирующая активность - 1:160
8. Антигенная специфичность:
а) гемагглютинина - идентичен вирусу А/лошадь/Прага/1/1956(Н7N7) по данным РТГА с крысиной антисывороткой и ПЦР-рестриктазного анализа ДНК-копий гена;
б) нейраминидазы - идентична вирусу А/17/Калифорния/09/38(Н1N1) по данным ПЦР-рестриктазного анализа ДНК-копий гена
9. Бактериологический контроль лиофилизированного материала: дата проведения - 13.01.2010 - стерилен.
Назначение полученного штамма - качественное и количественное определение антител к NA штамма А/Калифорния/07/09(Н1N1) пандемического вируса гриппа в сыворотках крови.
1. Штамм может применяться для выявления антинейраминидазных антител в тесте ингибирования сиалидазной активности NA, а также иммуноферментного анализа (ИФА) в сыворотках лабораторных животных после инокуляции вирусом гриппа.
Методика такого выявления основана на определении титра антинейраминидазных ингибирующих антител, представляющих собой величину, обратную последнему разведению тестируемой сыворотки, в котором еще наблюдается блокирование сиалидазной активности NA диагностического штамма RN1/09-swine A(H7N1). Сиалидазная активность NA определяется по отношению к натуральному субстрату (фетуин) с последующим узнаванием демаскированных полисахаридов пероксидазно-меченным лектином.
При проведении твердофазовой ИФА диагностический штамм RN1/09-swine A(H7N1) может применяться в качестве подложки для сорбции на 96-луночных планшетах, куда позднее вносятся падающие разведения тестируемых сывороток и пероксидазно-меченный коньюгат, специфичный к определяемому классу иммуноглобулинов. Титры антинейраминидазных антител определяется в десятичных логарифмах величины, обратной последнему разведению тестируемой сыворотки, в котором наблюдается двукратное превышение над средним значением оптической плотности лунок отрицательного контроля.
Пример выполнения эксперимента.
Мышам линии СВА вводили интраназально однократно реассортантный штамм А/17/Калифорния/09/38(Н1N1) в дозе 10 6 ЭИД 50 /0,05 мл. Сыворотки крови иммунизированных мышей были получены через 14 дней после иммунизации. Показано, что в сыворотках иммунизированных мышей определялись специфические антитела к гемагглютинину и нейраминидазе штамма А/Калифорния/07/09(Н1N1) (см. таблицу 3). В контрольной группе интактных животных специфические антитела к вирусу А/Калифорния/07/09(Н1N1) выявлены не были.
| Таблица 3 | ||
| Приросты антител в сыворотках мышей через 14 дней после однократного введения вакцинного штамма А/17/Калифорния/09/38(Н1N1) | ||
| Группы | Антитела к НА | Антитела к NA |
| РТГА (СГТ) | Фетуиновый тест (СГТ) | ИФА(Ig) |
| Вакцина | 17,4 | 31,7(р |
Было проведено сравнение результатов ИФА, полученных с использованием в качестве подложки очищенного реассортантного вируса RN1/09-swine A(H7N1) (100 ГАЕ) или очищенной нейраминидазы вируса гриппа А/Калифорния/07/09(Н1N1) (1 мкг/мл). На фиг.2 представлена достоверная корреляция для обоих видов антигена (Тау Кендалла 0,538; р 10 . По оси ординат представлены титры сывороточных IgG к цельному реассортантному штамму RN1/09-swine A(H7N1), также выраженные в log 10 .
2. Штамм может применяться для выявления антинейраминидазных антител в тесте ингибирования сиалидазной активности NA и ИФА в сыворотках привитых и переболевших лиц.
У обследуемых волонтеров отбираются пробы крови из пальца до и после вакцинации. Полученные после центрифугирования сыворотки крови хранятся при
Пример выполнения эксперимента.
С целью клинического изучения моновалентной ЖГВ А/17/Калифорния/09/38(Н1N1) волонтерам вводили препарат двукратно интраназально с интервалом в 21 день в дозе не менее 10 7 ЭИД 50 /0,5 мл. Сыворотки крови были собраны до прививки, после первой вакцинации и ревакцинации. Антитела к нейраминидазе определяли в фетуиновом тесте и ИФА. Показано увеличение после двукратной прививки средних титров антител к нейраминидазе вируса гриппа по данным двух тестов (см. таблицу 4). Наиболее выраженные приросты антител к нейраминидазе выявлены у переболевших лиц.
| Таблица 4 | |||||
| Формирование сывороточных антител к нейраминидазе у волонтеров, привитых моновалентной ЖГВ А/17/Калифорния/09/38(Н1N1) | |||||
| Группы | Число в группе | Фетуин-лектиновый тест, СГТ у лиц с сероконверсиями (61%) | ИФА(Log10) | ||
| До прививки | После прививки | До прививки | После прививки | ||
| ЖГВ двукратно | 31 | 12,4 | 22,3 | 2,2±0,3 | 2,5±0,3 |
| Переболевшие | 5 | н/д | 177,7 | н/д | 3,4±0,3 |
| Плацебо | 10 | 12,2 | 12,2 | 2,4±0,5 | 2,4±0,4 |
Результаты экспериментов четко демонстрируют пригодность заявляемого реассортантного штамма для выявления антител к нейраминидазе N1 вируса гриппа свиного происхождения, благодаря чему этот штамм может быть использован для диагностики, для изучении иммуногенности гриппозной вакцины, для анализа фоновых значений антинейраминидазных антител в популяции в целом в условиях циркуляции пандемического вируса гриппа A(H1N1).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Штамм вируса гриппа, депонированный в Государственной коллекции вирусов Учреждения Российской Академии Медицинских Наук Института Вирусологии РАМН им. Д.И.Ивановского под № ГКВ 2473, используемый для определения антител к нейраминидазе N1 вируса гриппа свиного происхождения.
Читайте также:
- Пассивная иммунизация против бешенства
- Что делать если в школе гепатит а
- Могут ли быть красные глаза при гепатите
- У телят ротавирус чем лечить
- Днк цитомегаловируса количественное в плазме менее 500