Диагностика низких концентраций вируса

Против нового штамма коронавируса COVID-19, вызвавшего эпидемию во всем мире, пока не разработано ни вакцин, ни лекарственных средств. Эксперты считают, что пройдет не менее полутора лет, прежде чем все клинические испытания будут завершены и разработки будут одобрены и выпущены на рынок.

Единственная возможная мера на данный момент – быстрая диагностика для выявления инфицированных и размещения их на карантин. В этом помогут экспресс-тесты.

Чаще всего тест на коронавирус назначается при необычно протекающих пневмониях, причина которых не установлена, а также при комплексе симптомов: кашель, высокая температура, проблемы с дыханием. При контакте с зараженными проверяют также всех, кто находился рядом с ними.

Где производят экспресс тесты на коронавирус

В Китае и Южной Корее экспресс-тесты проводятся практически всем, при малейшем подозрении. Они объясняют это тем, что у многих болезнь протекает бессимптомно.

Постепенно многие страны разрабатывают собственные тесты на коронавирус: США, Франция, Россия. Особенно эффективные разработки затем передаются в другие страны. Проблема первых экспресс-тестов в их длительности и низкой точности – они могли реагировать на другие штаммы коронавирусов, путая их с COVID-19.

В США первое время столкнулись с проблемами при проведении анализов – многие тест-системы были бракованы, а их количества не хватало на всех нуждающихся. Медицинские компании не сразу получили разрешение на производство своих экспресс-тестов, но теперь на рынок уже вышли новые системы, основанные на данных китайских пациентов.

Россия совместно с японской компанией также разработала экспресс-тесты на коронавирус. В ближайшие недели на российский рынок выйдет усовершенствованная версия теста, созданная ФМБА России. Разработки переданы в 13 стран мира.

Как работает экспресс тест на коронавирус

Для анализа у пациента берут мазки из горла и носа. Также могут взять пробы из верхних и нижних дыхательных путей, мокроту, слюну. Образцы транспортируют в лабораторию, а затем проводят процедуру анализа.

Она основана на методе ПЦР – полимеразной цепной реакции. Это метод молекулярной биологии. Для проведения анализа клетки, присутствующие в пробе, разрушаются, и из них высвобождаются фрагменты генетического материала – ДНК. Отобранную часть копируют и размножают для того, чтобы отследить конкретные фрагменты ДНК коронавируса. Если он найден, значит, в пробе присутствовал вирус. Также можно определить количество возбудителя болезни.

Такой экспресс-тест длится около пяти часов. Также требуется время на доставку проб в лабораторию, так как вне ее провести такое исследование невозможно.

Также существует еще один метод, который пока находится в разработке. Он основан на поиске антител, которые выделяются организмом как реакция на заражение вирусом. Такой анализ существенно ускорит диагностику – можно будет установить, болен человек коронавирусом или нет, за 10 - 20 минут. Южнокорейская компания смогла выявить антитела COVID-19. Похожая разработка есть и у тайваньской компании.

Где купить и сколько стоит экспресс тест на коронавирус

Многих россиян интересует, в какой аптеке можно купить тест на коронавирус. К сожалению, купить экспресс-тесты нельзя. ПЦР анализ может проводиться только в лабораторных условиях с помощью сложного оборудования. Также проведение такого анализа опасно, поэтому не каждая лаборатория имеет разрешение на такую работу. Она должна быть обеспечена средствами для работы с определенным уровнем патогенности микроорганизмов.

Ведутся работы по производству переносных диагностических мини-лабораторий, которые дадут возможность тестировать пациентов в небольших клиниках, и даже в домашних условиях. Возможно, вскоре разработают максимально упрощенные экспресс-тесты по аналогии с тестами на определение уровня сахара в крови.

На данный момент экспресс-тестами на коронавирус оснащены все центры гигиены и эпидемиологии, расположенные в крупных городах. Самостоятельно обратиться в центры Роспотребнадзора для сдачи анализов на коронавирус нельзя – нужно направление от врача. В случае госпитализации или подозрении медиков на COVID-19 врач сам назначит анализ, и его проведут бесплатно.

Частные центры сейчас вообще не занимаются анализами на коронавирус, как платно, так и бесплатно. Максимум, который они могут предложить – анализы на обширные группы вирусов. Они не могут отдельно выявить конкретный штамм COVID-19. Поэтому даже положительный результат такого анализа вовсе не будет означать, что вы заражены COVID-19.

В ближайшие недели ряд частных лабораторий запустит подобные анализы, которые можно сдать по собственному желанию. Они будут выявлять именно коронавирус 2019. Стоимость пока неизвестна, но ориентировочные цифры – до 10 тысяч за один анализ.

Стоит иметь в виду, что без симптомов сдавать анализ практически бессмысленно – вирус ищут в клетках эпителия из носоглотки, и отсутствие симптомов означает, что вирус еще не поразил слизистую носа и горла. То есть во время инкубационного периода, который по последним данным уже может превышать 20 дней, с помощью экспресс-теста выявить вирус может и не получиться. При низкой концентрации вируса недостаточно чувствительные тесты попросту его не зафиксируют. Поэтому при отрицательном анализе тест обычно отправляют на проверку, и повторяют.

Россия готовится к тотальному тестированию, новые тест-системы позволяют быстро провести масштабную проверку на вирус. К массовому выпуску приступил один из разработчиков нового продукта, два других начинают производство. Олег Гусев, ведущий научный сотрудник Научно-клинического центра прецизионной и регенеративной медицины Казанского федерального университета и института физико-химических исследований RIKEN (Япония) помог РБК Тренды разобраться в том, как устроено тестирование на коронавирус в России и в мире.

Что предлагает ВОЗ

Глава Всемирной организации здравоохранения Тедрос Гебреисус еще в середине марта призвал страны проводить как можно больше тестов на вирус, который вызывает заболевание SARS-CoV-2, даже людям без симптомов. Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Как говорится в рекомендациях, на сегодня это самый точный и надежный метод диагностики вирусной инфекции. Он позволяет определить даже очень небольшое количество РНК вируса в биологическом материале человека. Это помогает выявить болезнь в инкубационном периоде.

Изобретенный в 1983 году метод и сейчас считается фундаментальным в молекулярной диагностике. Американский ученый, который придумал способ значительного увеличения малых концентраций фрагментов ДНК в биологической пробе, получил за него Нобелевскую премию. Выявление ДНК/РНК методом ПЦР позволяет диагностировать такие заболевания, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие. Метод используют в археологии, криминалистике, генетике.

Как работает ПЦР-тест

Для анализа из физиологических жидкостей извлекают одноцепочечную РНК, моделируют на ее основе двуцепочечную ДНК и многократно дублируют с помощью специального фермента (полимеразы). Увеличение числа копий ДНК называется амплификацией. В результате концентрация определенных фрагментов ДНК/РНК в биологическом образце, изначально минимальная, значительно увеличивается. При исследовании копируется только необходимый для теста участок ДНК. И, конечно, дублирование происходит только в том случае, если искомый участок вирусной ДНК или РНК присутствует в исследуемом биоматериале. В случае с коронавирусом мазок для анализа берут из ротоглотки или носоглотки, поскольку в крови или в кале вирус появляется на более продвинутой стадии болезни.

Тест-система EMG — продукт совместной разработки российских и японских разработчиков, проводившейся с 2016 года, рассказывает Олег Гусев. На данный момент эти тесты включены в систему обязательного медицинского страхования в Японии.

В ближайшее время планируется производить до 2,5 млн. тестов и 1 тыс. портативных лабораторий в неделю. Сами тесты, как и многие реагенты производятся в России. Планируется, что цена на тесты EMG будет в среднем в пять раз меньше, чем на стандартные ПЦР-тесты в Европе.

Российско-японские тесты основаны на методе изотермальной молекулярной диагностики SmartAmp, превосходящем метод ПЦР по скорости работы в восемь раз, а переносная лаборатория позволяет тестировать до 20 пациентов в час, говорит Гусев.

Ключевое отличие теста EMG в том, что многие тесты, которые производятся сейчас, это тесты ИФА (имунноферментный анализ), а не ПЦР. Данные системы определяют антитела, которые организм начинает вырабатывать не ранее, чем через неделю после заражения. Российско-японская разработка позволяет получать результат уже за 30 минут, с точностью, равной почти 100%. Кроме того, тест EMG позволяет определить наличие вируса уже на самых ранних стадиях, в то время как другие системы диагностики короновируса обладают меньшей чувствительностью и не могут выявлять вирус на ранней стадии инфицирования.

Принцип технологии российско-японского теста, по сути, не отличается от классической ПЦР — это наращивание количества целевых фрагментов ДНК и их детекция. Однако в изотермической амплификации, в отличие от классической ПЦР, где необходимы циклы нагрева и охлаждения, все происходит при одной температуре. Это позволяет многократно увеличивать скорость реакции. Метод SmartAmp был изобретен более 15 лет назад (как и LAMP — другая популярная технология изотермальной амплификации, предшествующая SmartAmp). Впервые для инфекционных заболеваний эту технологию применили в 2009 году для быстрого выявления пандемического гриппа (H1N1) в Японии.

Повторные тесты необходимы при любом методе. Отрицательный тест на COVID-19 не гарантирует, что человек не заразится этим вирусом на следующий день. Поэтому, например, в японских лабораториях персонал тестируют каждые несколько дней. Повторный тест нужен и для того, чтобы подтвердить, что человек излечился.

Эта тест-система будет использоваться для диагностики COVID-19 не только в России и Японии. 40 тыс. тестов закупила Австрия, поступили заказы из других стран Европы, Ближнего Востока, и Латинской Америки. Подана заявка в Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) для поставок в эту страну.

На данный момент в России прошли регистрацию еще три теста на коронавирус.

По некоторым данным, в Москве проводится около 700 тестов на коронавирус в сутки. В планах у московских властей увеличить этот показатель до 10 тыс. тестов в сутки, а затем довести его до 25—28 тыс. тестов ежедневно.

Новые разработки за рубежом

Компания Bosch выводит на рынок свой тест на коронавирус, который сначала будет доступен в Германии, а вскоре появится в других странах. В его основе лежит диагностический аппарат Vivalytic, который, по словам изготовителей, станет первым автоматизированным тестом на COVID-19. Тест распознает не только коронавирус, но еще шесть респираторных заболеваний, например, вирусы гриппа А и B. Во время лабораторных испытаний аппарата его точность составила 95%.

Как пишет издание ZME Science, анализ может проводиться прямо в стационаре или медицинском центре — не нужно отправлять образцы в лабораторию и ждать, пока придет ответ. Врачи смогут быстрее идентифицировать и изолировать зараженных, а пациентам не придется пребывать в неизвестности несколько дней. Тест прост в обслуживании и не требует специальной подготовки. Медперсоналу нужно только взять мазок из носа или горла пациента, нанести его на картридж, содержащий реагент, и вставить картридж в анализатор. Каждый аппарат может выполнять до десяти анализов за 24 часа.

Еще более оперативный тест на COVID-19 разработали в Великобритании. Он позволяет выявить COVID-19 всего за 30 минут. Чтобы провести его, достаточно портативного оборудования стоимостью около $120 и набора полосок для мазков из носа и горла по $5 каждая. Одновременно проходить тест могут до шести человек.

FDA в экстренном порядке одобрило сверхбыстрый тест на коронавирус, разработанный калифорнийской компанией Cepheid. С его помощью диагноз можно будет поставить всего за 45 минут. Как отмечает Business Insider, для обработки результатов теста не требуется специальное обучение. Нужен лишь доступ к системе Cepheid GeneXpert — в США их 5 тыс., а по всему миру — 23 тыс.

Начало тотального тестирования людей на COVID-19 во всем мире — хорошая новость как для людей, так и для национальных органов здравоохранения. До сих пор в мире нет четкого представления о том, сколько людей заражены коронавирусом и выявление тех, у кого он уже есть: их госпитализация или отправка на домашний карантин позволит быстрее оценить масштаб угрозы и вовремя принять правильные меры.

Фоновое изображение: Realstock | Shutterstock.com

Что должен включать набор для выявления РНК коронавируса в образцах? Три компонента: реагенты для экстракции РНК, реагенты для обратной транскрипции, то есть перевода РНК в ДНК, и реагенты для ПЦР. Последний компонент состоит из ферментов, буфера и праймеров — олигонуклеотидов, комплементарных каким-либо последовательностям генома коронавируса.

Однако обычно тест-системы включают еще и внутренний контрольный образец — молекулу РНК, защищенную от действия нуклеаз, которую при анализе добавляют в образец на первой стадии — стадии выделения, чтобы она вместе с мишенью проходила все этапы лабораторного исследования и в конце дала свой собственный сигнал, который покажет, что на всех этапах все было хорошо.

У уже зарегистрированного набора ЦСП чувствительность как раз 10 3 в мазках со слизистой (так указано в инструкции к набору, которая имеется в распоряжении редакции). По нашей информации, примерно такой же чувствительности добиваются в разработке НИЦ им. Н.Ф. Гамалеи.

Чем плоха низкая чувствительность? Возможна ситуация, когда пациент явно инфицирован, но концентрация вируса в пробе у него ниже, чем 10 5 . В этом случае результат тестирования будет отрицательным. Тест не выявит начало заболевания, либо слишком рано будет принято решение о том, что выздоравливающий пациент больше не выделяет вирусы и не может никого инфицировать. А он ходит по улице, и он заразен. (По данным китайских исследователей, выделение вируса может продолжаться до 37 дней.)

С ложноотрицательными результатами теста разобрались. Теперь о ложноположительных срабатываниях, то есть о специфичности. Любой тест может показывать у некоторого числа здоровых людей заболевание. В спокойной обстановке в этом нет ничего страшного, поскольку можно десять раз перепроверить анализы у каждого пациента. Совсем другое дело — ситуация эпидемии. В этом случае диагностика опять выдает управленческим структурам недостоверную информацию о количестве инфицированных, принимается решение о проведении клинических и лечебных мероприятий в отношении пациентов, которые вообще не болеют. Ресурсы здравоохранения направляются на ложные цели.

Однако это вопрос про праймеры для реакции амплификации. Если праймеры специфичны именно к этому вирусу, то все хорошо, если же праймеры могут отжигаться на нецелевую мишень, то получим ложнопозитивный результат. К сожалению, саму последовательность праймеров многие разработчики — не все — держат в секрете, поэтому редакция не располагает информацией, на гены каких именно белков и на какие участки этих генов они созданы.

С другой стороны, ВОЗ пишет, что в настоящее время известно о циркуляции среди населения четырех сезонных коронавирусов (HCoV-229E, -OC43, -NL63 и -HKU1), которые, как правило, вызывают заболевания верхних дыхательных путей — от легких до средней тяжести. Поэтому испытания теста должны проводиться на как можно более широкой панели, чтобы отсечь ложные срабатывания. Желательно, чтобы образцы были от пациентов, либо в панель должны быть включены вирусы, генетически наиболее близкие этому коронавирусу и достаточно широко распространенные.

Сколько именно неспецифичных срабатываний дает тест, сказать нельзя, но из общих соображений эксперты называют цифру до 10%.

По тест-системам, разрабатываемым другими группами, у редакции достоверной информации нет.

Теперь самый болезненный для общества вопрос: какие структуры могут диагностировать коронавирус SARS-CoV-2 в России? И вопрос, который следует из первого: будут ли использованы разработки тех организаций, которые мы перечислили выше?

Что это значит? Это значит, что СанПин позволяет работать с вирусами из II группы методом ПЦР в условиях III–IV группы. Так, например, работают по всей стране с ВИЧ, который тоже отнесен ко II группе. В том случае, если опасный патоген не собираются наращивать в культуре или инфицировать им лабораторных животных, а исследуют его генетический материал, пробирку с образцом открывают в ламинарном шкафу и добавляют в нее вещество, разрушающее вирус (например, гуанидинизотиоцианат). После этого фактически речь идет не о вирусе, а о его белках, ДНК или РНК.

Тем не менее сейчас круг лабораторий, которые могут диагностировать инфекцию SARS-CoV-2, ограничен Роспотребнадзором.

Понятно, что если коммерческие лаборатории в России захотят проводить тестирование на SARS-CoV-2, то они смогут воспользоваться любой тест-системой, которая получит регистрационное удостоверение. Однако неясно, как в этом случае будет выстраиваться взаимодействие с системой Роспотребнадзора.

Отсутствие конкуренции — это рай?

Когда в мире произошла вспышка атипичной пневмонии, в 2003 году четыре организации в России разработали ПЦР-тесты на выявление возбудителя — коронавируса SARS-CoV. Роспотребнадзор издал приказ о сравнительных испытаниях. Был очень быстро получен вирус, и все разработчики могли испытывать на нем свои системы. Сравнительные испытания проводились в 48 ЦНИИ МО РФ, панели контрольных образцов были зашифрованы. Затем результаты всех тестов вскрыли и сравнили.

Довольно большая разница с тем, что происходит сейчас, не так ли?

Все наши источники сходятся в том, что нужно дать возможность работать с клиническим материалом и применять свои тест-системы и государственным и коммерческим игрокам этого рынка. Но сейчас в условиях распространяющейся эпидемии только структуры Роспотребнадзора (и то не все) имеют эксклюзивное право на получение всех федеральных денег по этой тематике на исследования, разработку вакцин и тестирование препаратов, диагностику всех инфекционных материалов в сети своих организаций.

Как мы написали выше, мы не получили ответа от Роспотребнадзора на наш официальный запрос на информацию. В таком же положении находятся все СМИ в стране. Но мы открыты к сотрудничеству и с удовольствием опубликуем ответы на наши вопросы. Предварительно проверив, разумеется.

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Левченко Наталья Витальевна, Ефременко Виталий Иванович

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Левченко Наталья Витальевна, Ефременко Виталий Иванович

13. Biller, D.H. Vaginal vault prolapsed: identification and surgical options / D.H. Biller, G.W. Davila // Cleve Clin.J.Med. - 2005. - Vol.72, №4. - P. 1-8.

14. Lang, J.H. Estrogen levels and estrogen receptors in patients with stress urinary incontinence and pelvis organ prolapsed / J.H. Lang, L. Zhu, Z.J. Sun, J. Chen // Int. J. Gynecol.Obstet. - 2003. -Vol.80. - P 35-39.

15. Mouritsen, L. Classification and evaluation of prolapsed / L. Mouritsen // Best. Pract. Res. Clin. Ob-stet.Gynaecol. - 2005. - Vol.19. - P. 895-911.

16. Mouritsen, L. Symptoms, bother and POPQ in women referred with pelvic organ prolapsed / L. Mouritsen, J.P Larsen // Int. Urogynecol. J. Pelvic Floor Dysfunct. - 2003. - Vol.14. - P. 122-127.

17. Neuman, M. Advanced mesh implants for vaginal pelvic floor reconstruction: report of 150 Prolift operations / M. Neuman, M. Friedman // Abstract International Urogynecologi-

cal Association Congress, Cancun June 2006.

18. Perioperative outcomes of tension free vaginal mesh procedures following introduction to a teaching servis / M. Alperin, R. Ellison, G. Sutkin, PA. Moalli [et al.] // Abstract AUGS meeting 2007 in: Journal of Pelvic Medicine & Surgery. - 2007. -Vol.13, №.5. - P 308.

19. Reisenauer, C. Anatomical conditions for pelvic floor reconstruction with polypropylene implant and its application for the treatment of vaginal prolapsed / C. Reisenauer, A. Krischniak, U. Drews,

D. Wallwiener // European Journal of Obstetrics & Gynecology and reproductive Biology. -2007. -Vol.131. - P. 214-225.

20. Transvaginal mesh repair of pelvic organ prolapsed: short term outcomes from a prospective multicenter study / D. Altman, T. Vairynen, M. Ellstrom Engh, C. Falconer [et al.] // Abstract International Continence Society congress, Rotterdam, 2007.

ПРИМЕНЕНИЕ СЕТЧАТЫХ ЭНДОПРОТЕЗОВ

В ЛЕЧЕНИИ ПРОЛАПСА ГЕНИТАЛИЙ

С.А. ГАСПАРЯН, Е.П. АФАНАСОВА,

Проведен анализ результатов оперативного лечения с 2007 по 2009 год 85 больных женщин с простыми и осложненными формами пролапса гениталий с использованием синтетических материалов фирм -производителей АМС, Джонсон и Джонсон с целью определения эффективности хирургического лечения. Показана высокая эффективность реконструктивных пластических хирургических вмешательств с использованием синтетических сетчатых эндопротезов в лечении генитального пролапса, а также относительно низкая частота послеоперационных осложнений. Вопрос о преимуществах и недостатках использования синтетических эндопротезов различных фирм требует дальнейшего изучения.

Ключевые слова: системы РгоШ, Peridgi и Apodgi для реконструкции тазового дна, недифференцированная дисплазия соединительной ткани, интра- и послеоперационные осложнения

EXPERIENCE OF GENITALS PROLAPSE TREATMENT

USING RETICULAR ENDOPROSTHESES

GASPARYAN S.A., AFANASOVA E.P.,

Analysis of the results of 85 women treatment using AMS and Jonson & Jonson synthetic materials was made to study the effectiveness of surgical correction of simple and complicated forms of genitals prolapse. The data obtained showed the high efficiency of reconstructive plastic surgery in treatment of genitals prolapse using synthetic reticular endoprostheses, relatively low frequency of postoperative complications. Advantages and disadvantages of different synthetic endoprostheses require further accumulation of experience.

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ, СОДЕРЖАЩИХ ПАТОГЕН В НИЗКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ

Н.В. Левченко1, В.И. Ефременко2 Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт 2Ставропольская государственная медицинская академия

Левченко Наталья Витальевна, младший научный сотрудник Ставропольского научно-исследовательского противочумного института,

тел.: 89283217618; e-mail: [email protected].

Ефременко Виталий Иванович, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, заведующий кафедрой биологической химии СтГМА, тел.: 89624402261.

Проблема возникновения новых и возвращающихся инфекционных болезней, поражающих население государств, расположенных на различных континентах, до настоящего времени не теряет своей актуальности. К таким инфекциям относится грипп птиц, который в начале ХХ! века приобрел способность вызывать заболевания человека при контакте с больной птицей [1, 2,

5, 6, 9]. В 2009 году в 15 странах выявлено свыше 400 случаев тяжелых заболеваний человека с высокой летальностью, вызванной гриппом птиц H5N1, однако в нашей стране заболевание людей этой инфекцией не зарегистрировано [4]. Вместе с тем, начиная с 2005 года, в различных регионах России на путях миграции перелетных птиц отмечались быстро распространяющиеся эпизоотии среди дикой и домашней птицы, вызванные вирусом высокопатогенного гриппа птиц серотипа H5N1, что потребовало принятия эффективных противоэпидемических мер по защите от данного заболевания не только домашней птицы, но и людей [7]. Грипп птиц - высоко контагиозная энтеральная инфекция, способная инфицировать все виды пернатых с поражением у них паренхиматозных органов. Основными распространителями в природе вирусов гриппа птиц, в том числе высокопатогенных, считаются дикие мигрирующие утки, проявляющие к данному возбудителю относительную устойчивость и распространяющие инфекцию через фекальные массы в водоемы. В водоемах вирус сохраняется длительное время особенно при низкой температуре воды, при контакте с которой происходит заражение здоровой птицы [6]. При этом концентрация вируса гриппа птиц в воде водоемов зачастую бывает настолько низкой, что все известные лабораторные методы исследования не позволяют обнаружить его присутствия.

Цель исследования: разработка новых лабораторных диагностических систем, обеспечивающих выявление возбудителя гриппа птиц в объектах окружающей среды с низкой концентрацией патогена.

Материал и методы. Вирус гриппа птиц, депонированный в государственную коллекцию вирусов как Grebe / Novosibizsk / 29 / 05 (H5N1), выращенный роллерным способом в культуре клеток СПЭв и инактивированный p-пропиолактоном, а также иммунную асцитическую жидкость мышей, иммунизированных данным вирусом, получали из ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН в рамках совместно выполняемой научной темы. Специфические иммуноглобулины класса G (IgG) выделяли из асцитической жидкости фракционированием каприловой кислотой, затем ковалентно иммобилизировали на поверхность гранулированных магнитных иммуносорбентов, полученных нами на основе алюмосиликата с магнитным порошком и полиглюкином, активированных натрием перхлоратом за счет наличия в структуре сорбентов альдегидных групп. Данный сорбент имел удельную поверхность 66 м2/г, объем пор - 1,24 см3/г и их радиус - 38 нм и прочно связывал иммуноглобулины (IgG) против вируса гриппа птиц.

Статистическую обработку полученных результатов проводили, оценивая дисперсию, стандартное отклонение, доверительный интервал выборки из результатов эксперимента, с использованием компьютерной

программы Microsoft Office Excel, 2007.

Результаты и обсуждение. Традиционными методами выявить возбудитель гриппа птиц в водных объектах окружающей среды затруднительно в связи с тем, что его концентрация в водоеме значительно ниже порога чувствительности известных методов диагностики. Для обеспечения селективного концентрирования вируса гриппа птиц из проб большого объема водной среды использованы твердофазные магнитные иммуносорбенты (МИС). В предварительных исследованиях была показана возможность таких сорбентов концентрировать на своей поверхности инактивированный вирус гриппа птиц, находящийся в 5000 мл водопроводной воды, содержащей 10 нг и выше патогена. После концентрирования на МИС вирус специфически обнаруживали с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) и ОТ-ПЦР [3]. Вместе с тем в открытых водоемах из-за очень низкой концентрации вируса в воде возникает необходимость его концентрирования в пробах, объем которых может достигать несколько сотен литров воды. С этой целью нами была сконструирована установка для микробиологического (вирусологического) мониторинга, на которую получен патент РФ на полезную модель [8].

Исследуемые опытные и контрольные взвеси в объеме 10 мкл наносили на предметное стекло и микроскопировали. Прибором, регистрирующим уровень свечения магнитных гранул, служил люми-

несцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8, оборудованный фотометрической насадкой ФМЭЛ-14. К насадке подсоединяли источник тока УБПВ-1 и вольтметр цифровой универсальный В7-76. Рабочее напряжение составляло 800-900 В, увеличение объектива х40 и окуляра х10. Применялись возбуждающие светофильтры БС-8-2, СЗС-7-2, ФС-1-6. Диаметр зонда фотометрической насадки, с площади которого выявляли уровень свечения МИС, составлял 0,5 мм. После обнаружения в поле зрения гранул сорбента закрывали полевую диафрагму и снимали цифровые показания уровня свечения 10-15 гранул на вольтметре. Определяли среднеарифметические значения величины флуоресценции опытных, контрольных гранул и пространства между ними - фона. Интенсивность флуоресценции МИС (М) представляла собой разницу между среднеарифметическими показателями уровня свечения гранул и фона: (М)=М гранул -М фона. За положительные принимались результаты, при которых уровень флуоресценции опытных гранул в 2 и более раз превышал аналогичный показатель контрольных.

В результате трехкратного испытания данного способа установлена возможность обнаружения низких концентраций антигенов вируса гриппа птиц в воде, которые концентрировались на поверхности МИС с последующим их выявлением методом КИФА. При этом отношение уровня флуоресценции опытных гранул МИС к контрольным составляло 2,1-2,3. Проведенные исследования показали возможность индикации вируса гриппа птиц с использованием МИС в КИФА, включая пробы внешней среды (вода) с очень низкой концентрацией патогена.

Дисперсия случайной выборки из результатов эксперимента по определению чувствительности МИС + КИФА (девять результатов с чувствительностью 10 нг/ мл, один - 5 нг/мл) составила 2,5, стандартное отклонение - 1,5811, доверительный интервал - 3,5764.

Наличие вируса гриппа птиц Н5Ж на МИС было подтверждено также в опытных пробах, в отличие от контрольных, при использовании ИФА и ОТ-ПЦР в соответствии с описанными нами ранее методическими приемами [3].

Дисперсия случайной выборки из результатов эксперимента по определению чувствительности МИС + ИФА (восемь результатов с чувствительностью 10 нг/ мл, два - 5 нг/мл) составила 4,4444, стандартное отклонение - 2,1082, доверительный интервал - 4,7687.

Дисперсия случайной выборки из результатов эксперимента по определению чувствительности МИС + ОТ-ПЦР (восемь результатов с чувствительностью 10 нг/мл, два - 5 нг/мл) составила 4,4444, стандартное отклонение - 2,1082, доверительный интервал -4,7687.

Заключение. Эффективный вирусологический мониторинг вируса гриппа птиц в водных объектах окружающей среды возможен лишь при сочетанном использовании магнитных иммуносорбентов и инди-

кационных методов количественного иммунофлуо-ресцентного анализа, иммуноферментного анализа, обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией, одновременно сочетающих в себе способность осуществлять динамическое, селективное концентрирование патогена из загрязненных проб большого объема с высокой чувствительностью и специфичностью определения патогена.

1. Бектемиров, Т.А. Птичий грипп и возможная пандемия / Т.А. Бектемиров // Биопрепараты.

- 2005. - № 17. - С. 14-16.

2. Гендон, Ю.З. Эпизоотии гриппа птиц и борьба с ними / Ю.З. Гендон // Журн. микробиол. - 2006.

3. Ефременко, В.И. Экспериментальные данные по выявлению вируса гриппа птиц с помощью магнитных иммуносорбентов / В.И. Ефременко, Д.К. Львов, П.Г. Дерябин [и др.] // Вопросы вирусологии. - № 3. - 2008. - С. 43-45.

4. Крылов, П.С. Аминокислотные замены в гемаг-глютинине вируса гриппа подтипа H5, влияющие на антигенную специфичность и вирулентность вируса / П.С. Крылов, И.А. Руднева, Т.А. Тимофеева [и др.] // Вопр. вирусол. - 2009. -Т.54, № 5. - С. 14-19.

5. Липатов, А.С. Эволюция вирусов гриппа птиц H5N1 с 1997 по 2004 г. в Южной и ЮгоВосточной Азии / А.С. Липатов, Ю.А. Смирнов, Н.В. Каверин, РГ. Вебстер // Вопросы вирусологии. - 2005. - № 4. - С. 11-17.

6. Львов, Д.К. Популяционные взаимодействия в биологической системе: вирус гриппа А-дикие и домашние животные - человек; причины и последствия проникновения на территорию России высокопатогенного вируса гриппа A / H5N1 / Д.К. Львов // Журн. микробиол. - 2006.

7. Онищенко, Г.Г. Ситуации заболеваемости гриппом птиц в мире и в Российской Федерации. Совершенствование надзора и контроля за гриппом при подготовке к возможной пандемии / Г.Г. Онищенко // Журн. микробиол. -2006. - № 5. - С. 4-17.

8. Пат. 64784 РФ, МПК G01N 33/553, C12M 1/00. Установка для микробиологического мониторинга объектов водной среды / В.И. Ефременко, А.Л. Столяров, Э.М. Игуменов, А.М. Игуменов, Е.Н. Афанасьев, А.В. Таран, И.В. Жарникова, Н.В. Левченко, Т.В. Жарникова, С.А. Курчева (РФ). - № 2006144331; Заявлено 12.12.2006; Опубл. 10.07.2007 г. Бюл. №

9. Peiris, J.S. Avian influenza virus (H5N1): a threat to human health / J.S. Peiris, M.D. de Jong, Y Guan // Clin. Microbiol. Rev. - 2007. - Vol. 20. - P. 243267.

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА ВИРУСА ГРИППА

ПТИЦ В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ,

В НИЗКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ

Н.В. ЛЕВЧЕНКО, В.И. ЕФРЕМЕНКО

Разработаны диагностические тест-системы, обеспечивающие выявление вируса гриппа птиц в воде открытых водоемов, при контакте с которой происходит заражение здоровой птицы. При этом концентрация вируса в воде водоемов зачастую бывает настолько низкой, что все известные лабораторные методы исследования не позволяют обнаружить его присутствие.

Разработанные диагностические тест-системы позволяют с высокой специфичностью обнаруживать вирус гриппа птиц, присутствующий в 200 литрах воды в количестве 50 нг.

Ключевые слова: вирус гриппа птиц, магнитные иммуносорбенты, иммунобиологические и геннодиагностические системы

AVIAN INFLUENZA VIRUS EXPRESS DIAGNOSTICS

IN THE ENVIRONMENTAL SAMPLES WITH LOW

CONCENTRATION OF THE PATHOGEN

LEVCHENKO N.V., EFREMENKO V.I.

The authors have developed the diagnostic test-systems to detect avian influenza virus in the open water reservoirs if it contains the pathogen the healthy birds get infected by contact with open water. The virus concentration in an open water reservoirs frequently is so low that all known methods usually used do not allow detecting the presence of the virus.

These test systems are the magnetic immunosorbents which are selectively concentrated virus on its surface due to antigen-antibody reaction. Avian influenza virus isolation was performed by pumping of several hundred liters of liquid volume through the sorbents of the installation “AQUADIAMAG”.

Later the virus is detected by specific immunoglobulins labeled by flyuorestseinizotiotsiats during the quantitative immunofluorescent analysis, or labeled by enzyme - in ELISA and polymerase chain reaction with reverse transcription.

The above diagnostic test system allows a high specificity detection of 50 ng of avian influenza virus in 200 liters of water.

Key words: avian influenza virus, Magnetic immunosorbents, immunobiological and genetic diagnostic systems

ТАКТИКА АКТИВНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ТРОМБОЭМБОЛИЧЕСКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ ПРИ ЭНДОПРОТЕЗИРОВАНИИ КРУПНЫХ СУСТАВОВ

А.В. Алабут Ростовский государственный медицинский университет

Частота симптомных тромбоэмболических осложнений при эндопротезировании тазобедренного сустава на фоне тромбопрофи-лактики составляет, по разным данным, от 1,3% до 3,4%, при эндопротезировании коленного сустава - от 1,7% до 2,8% [1]. Частота фатальных тромбоэмболий колеблется от 1% до 2,3%, нефатальные тромбозы развиваются в 7,9-15,2% случаев [4]. При эндопротезировании тазобедренного сустава среднее время до развития тромбоза глубоких вен ориентировочно составляет 21 день, до развития тромбоэмболии легочной артерии -34 дня [5]. При эндопротезировании коленного сустава среднее время до развития тромбоза глубоких вен - 20 дней, среднее время до развития тромбоэмболии легочной артерии значительно меньше - в среднем составляет 12 дней.

Алабут Анна Владимировна, травматолог-ортопед, кандидат медицинских наук, заведующая отделением ортопедии и реконструктивно-пластической хирургии Ростовского государственного медицинского университета, тел.: (863)2985182, 89185585182; e-mail: [email protected].

Риск летальных исходов от тромбоэмболических осложнений после эндопротезирования тазобедренного сустава сохраняется достаточно высоким (4-20%) в течение шести месяцев [2]. Основные факторы риска смерти: пожилой возраст, мужской пол, низкая оценка физического статуса по шкале ASA (Американское общество анестезиологов) перед операцией, сердечно-сосудистые заболевания - являются довольно частыми в группе больных, которым показано эндопротезирование суставов нижних конечностей.

Цель исследования: разработка активной перио-перационной тактики ведения больных, направленной на уменьшение летальности от тромбоэмболических осложнений.

Материал и методы. Проведен анализ лечения 104 больных, которым выполнялось эндопротезирование коленного сустава, и 121 больного, которому выполняли замещение тазобедренного сустава. С целью активного выявления патологии сосудистого русла всем больным в предоперационном периоде выполняли триплексное исследование вен и ультразвуковое исследование артерий нижних конечностей. При выявлении патологии вен и артерий осуществлялись