Гепатит с мутация и резистентность

При появлении таких резистентных штаммов приводит к селекции и накоплению данных мутантов в организме человека при воздействии препаратов прямого действия. Эти мутации существуют до лечения, но могут образовываться и в процессе лечения. Наиболее сильная устойчивость встречается при неудачном использовании ингибиторов NS5A.
Кроме селекции эти вирусные частицы способны к накоплению, чьи схемы с противовирусными препаратами были не правильно подобраны. У пациентов, кто не отвечает на терапию, часто встречаются не только мутации по NS5A региону, но так, же и по NS3 региону, что в свою очередь приводит к неудаче лечения при использовании ингибиторов NS3 содержащих режимов лечения. В противоположность этому NS5B нуклеотидная устойчивость возникает только в 1% случаев, при редких мутациях и которые, как показало время, сами по себе могут исчезать через 1 месяц после применения противовирусных схем (Svarovskaia, 2014); (Wyles, 2017).
С последним утверждением я не согласен, так как я встречал пациентов, которые уже полгода не принимали терапию после рецидива приема (софосбувира+дакалатасвира или софосбувира+ледипасвира) при этом сохранялась мутации на софосбувир далее (NS5B RAS), интересно, что мутации были при отсутствии мутаций на NS5A ингибиторы (прим. Янченко В.). По моему мнению, это связано с самопроизводством в организме человека мутаций разных видов гепатита С.
Устойчивость к препаратам прямого действия у вируса гепатита С в настоящее время упорно нарастает и показывает слабые стороны современных препаратов против гепатита С. Как показывает практика наиболее устойчивые мутации это в NS5A регионе у генотипов 1а, 1в и 3, и 3а, однако не у всех, кто не ответил на лечение, обнаруживаются мутации. Вирусные частицы устойчивые к ингибиторам вирусной протеазы в регионе NS3/NS4 могут погибнуть в течение месяца, но к протеазе NS5A могут сохраняться годами и размножаться. Как правило, это требует повторного лечения, так как заканчивается рецидивом заболевания.
Согласно данным (Pawlotsky, 2016) если вирус представлен по минимуму около 15% вирусами с мутациями RAS, то у больного будет рецидив болезни после окончания лечения. Для определения мутации используется анализ популяции вирусов или метод Сангера и метод глубокого секвенирования оба метода должны иметь точку отсечения равной 15% или более если метод определяет 1% популяции вирусов это может не сказываться на лечении (Zeuzem,2017).
Если назначается Zepatier (Зепатир) elbasvir / grazoprevir NS5A RAS-тестирование рекомендуется для пациентов с генотипом 1a, не получавших ранее лечения или пациентов, которые уже имели неудачный опыт лечения, но они заходят на elbasvir / grazoprevir. Если RAS присутствует, то следует рассмотреть другой режим.
Препарат Harvoni (Харвони) нельзя назначать в таких случаях первое, если был опыт применения препаратов, и у пациента 1а генотип, без цирроза, и второе, если есть мутация NS5A. Это же касается и пациентов с 1а генотипом и циррозом печени, имеющих опыт лечения NS5A ингибиторами, поэтому RAS-тестирование должно быть предложено пациентам с генотипом 1a, имеющих опыт лечения без цирроза, которым хотят назначить Харвони (ледипасвир/софосбувир). При наличии клинически значимой резистентности следует использовать другую рекомендованную терапию.
Всем пациенты с 3 генотипом не получавших лечение и тех, кто получал лечение при применении 12 недельного курса Эпклузы (софосбувир + велпатасвир) и при наличии мутации Y93H рекомендуется добавить рибавирин или использовать Восеви (софосбувир + велпатасвир + воксилапревир).
При назначении Epclusa (Эпклуза) sofosbuvir/velpatasvir тест NS5A RAS рекомендуется для пациентов инфицированных 3 генотипом вируса гепатита С, не получавших лечения, с циррозом, и пациентам с опытом лечения (с циррозом или без него). При этом назначение Эпклузы планируется на 12 недель приема софосбувира / велпатасвира. Если присутствует Y93H, следует использовать софосбувир / велпатасвир / воксилапревир.
При пременении даклатасвира и софосбувира NS5A-тестирование мутации рекомендуется для пациентов с 3 генотипом без опыта лечения, иногда и 1а и 1б генотипе, пациентам с опытом лечения без цирроза при 3 генотипе, если лечение планируется на 12 недель. Если присутствует Y93H, следует использовать схему софосбувир+велпатасвир+воксилапревир, или использовать Maviret (Мавирет) (пибрентасвир/глекапревир) и добавить софосбувир, что с моей точки зрение должно рассматриваться как более эффективная схема. NS5A тестирование рекомендуется для пациентов с 3 генотипом, не получающим лечения, с циррозом, в течение 24 недель. Если присутствует Y93H при 3 генотипе, в лечении бессмысленно включать схему софосбувир + даклатасвир.
Характеристики которые увеличивают риск неудачи имеют прямую зависимость от самих препаратов прямого действия. Таким образом, понимание риска в популяции является необходимым, для оценки возможного не ответа на терапию. До сих пор считается на первом месте уровень фиброза печени и предварительная терапия пег-интерфероном и рибавирином. Однако, определение генотипа, субтипа, и начальной мутации вируса, по моему мнению, должно быть основным для полной характеристики риска неудачи терапии и правильного подбора схемы лечения.
Не могу не сказать о другом мнении – длительность терапии влияет на конечный вирусологический ответ и при удлинении срока терапии возможно перелечивание больных с ХГС имеющих рецидивы на препараты прямого действия. Авторы считают что наиболее часто усиливают терапию тем, что продлевают ее до 24 недель, а так же добавляют рибавирин, что по их мнению должно способствовать элиминации вируса гепатита С после предварительной неудачи терапии препаратами прямого действия (Cooper,2016); Автор так же думал и следовал советам данных исследователей, однако, ни длительность, ни добавление самого рибавирина не приводиди к желаемому результату в отдельных случаях. Однако не было достаточно случаев наблюдения, чтобы говорить о полной не эффективности данных двух- трех подходов для перелечивания. .
Дополнительная терапия, хотя данные очень ограничены мне удалось выяснить, что пациентам с множественными мутациями вируса гепатита С применяют тройную или четверную терапию то есть увеличивают количество классов препаратов прямого действия. В будущем я думаю будут разработаны новая генерация протеазных ингибиторов гепатита С и ингибиторов NS5A с улучшенной активностью.
Сочетание софосбувир+даклатасвир в настоящее время наиболее часто применяемая схема у больных с 3 генотипом. 3-я фаза исследования ALLY -3 показала что у больных 3 генотипом гепатита С стойкий вирусологический ответ при этой схеме был у 89% пациентов кто лечился впервые или после лечения интерфероном и рибавирином. В данном случае рибавирин не применялся.
Когда сравнили то оказалось, что без цирроза, независимо от предварительного лечения 97% вылечились, тогда как с циррозом только 58%. При оценке влияния мутации Y93H, которая связана с низким ответом на лечение при 3 генотипе и применении схемы СОФ+ДАК 67% выздоровели без цирроза с этой мутацией, тогда только 25% с циррозом избавились от гепатита С на схеме СОФ+ДАК (Nelson,2015).
ALLY3+ исследование оценивает длительность 12 и 16 недельных курсов терапии софосбувиром и даклатасвиром с рибавирином. Все больные были с 3 генотипом они делились на не лечившихся ранее с опытом лечения, а эти две группы внутри себя на с продвинутым фиброзом F-3 и циррозом. Общее число ответивших на терапию с SVR было 90%. Выше рецидив был у больных с циррозом - 14%, по сравнению с фиброзом F-3, когда было 100% выздоровевших людей. Восемь пациентов в начале лечения имели мутации лекарственной устойчивости по NS5A, включая Y93H два больных, 5 с A30K и 1 с A30A/K. Только один рецидив был с мутацией Y93H (Leroy,2016).
Элбасвир+Гразопревир - Zepatier (Зепатиер) торговое название он используется для пациентов, имеющих опыт лечения и тех, кто не лечился с 1 и 4 генотипом. Присутствие NS3 мутации не влияет на рецидив болезни. Так же наличие при 1б генотипа мутации NS5A не влияют на конечный ответ терапии. У больных с 1а генотипом вируса и с циррозом, и без него на терапии 12 недель, которые имеют NS5A мутации в итоге получают самый высокий риск рецидива - 42%. Рецидивы возникают, если мутации в позиции 28, 30, 31 и 93) по сравнению с 98% SVR без данных мутаций (Zeuzem 2015). У пациентов имеющих предыдущее лечение с и без цирроза кто получал 12 недель зепатиер без рибавирина были рецидивы в 71% и 3% соответственно (Jacobson 2015).

Глекапревир/Пибрентасвир Maviret (Мавирет) торговое название. В изучении устойчивости глекапревира и пибентасвира использовались клеточные структуры (Ng, 2017), отобраны в генотипах 1а, 1в, 2а, 3а, 4а и 6а репликоны для редуцировании восприимчивости результатов появления мутаций в A156 или D/Q 168. A156 мутация есть наиболее сильная, которая уменьшает эффективность глекапревира в 100 раз. D/Q 168 имеет разный эффект на глекапревир, зависящий от генотипа и субтипа и спецефическим заменой аминокислоты и уменьшает чувствительность к глекапревиром в 30 раз наблюдается при генотипах 1а (D168F/Y), 3a (Q168R), и 6а (D168A/G/H/V/Y). Однако эти мутации редко определяются клинически. Пибентасвир при генотипах 1в, 2в, 4а, 5а и 6а не производит устойчивых штаммов. При пибентасвире характерна всего лишь семикратная резистентность Y93H/N. Присутствие мутации никак не влияло у нециррозных больных при проведении лечения у больных во второй и 3 фазе исследований (Forns, 2017), (Foster 2017), (Asselah 2018), (Zenzem, 2016), (Kwo,2017), все мутации у пациентов с генотипами 1,2,4,5 и 6 и не имеют влияния на исход лечения (Krishnan, 2018). Среди больных кто не принимал лечение с 3 генотипом вируса гепатита С и кто получал лечение в течение 8 недель A30K полиморфизм был определен у 10% из них 22% получили рецидив. Но очень мало данных у пациентов с циррозом и имеющих мутацию A30K и у них ответа на терапию. Все пациенты, имеющие 3 генотип предварительно имеющие Y93H вылечились.
Ledipasvir/Sofosbuvir
Несколько всесторонних анализов пациентов с 1 генотипами с харвони в фазе 2 и 3 стадии испытаний показали влияние мутаций на конечный результат. (Sarrazin 2016, Zeuzem 2017).
В совокупном анализе пациентов с генотипом 1а и 1б кто получал софосбувир и ледипасвир с мутацией в NS5A в начале лечения достигли вирусологичесого ответа на 12 неделе 93,5% (316/338), по сравнению с 98,4% (1741/1770) без мутаций в NS5A (Sarrazin,2016). В этом исследовании наиболее устойчивым был вирус с мутацией NS5A региона 1а генотипа. Для мутаций по NS5 A региону и 1а генотипу стойкий вирусологический ответ был в 92,3%, и без мутации 98,3% соответственно. Незначительно ниже стойкий вирусологический ответ с NS5A при использовании глубокого секвенирования.
Примечательно, что в этом анализе были также определены другие факторы, определяющие риск возникновения рецидивов среди населения, в том числе исходный уровень NS5A RAS высокого уровня (>100-кратная устойчивость с Q30H/R, L31M/V и Y93C/H/N в генотипе 1a) и более короткая продолжительность терапии (8 недель или 12 недель против 24 недель). Частота SVR12 составляла от 97,4% до 100% у пациентов, прошедших лечение, без RAS NS5A или с RAS с 100-кратной резистентностью частота SVR12 снизилась до 64,7% (11/17) при 12-недельной терапии по сравнению со 100% (6/6) при 24-недельной терапии. В этой небольшой группе пациентов добавление рибавирина, по-видимому, не дает такой же выгоды, как продление терапии до 24 недель в этом объединенном анализе. Частота SVR12 составила 81,8% у лиц с> 100-кратной резистентностью к NS5A, которые получали 12 недель ледипасвир / софосбувир с рибавирином. В отличие от этого, в исследовании SIRIUS все 8 пациентов с циррозом, у которых опыт лечения превышал 100-кратную резистентность, получавших в течение 12 недель ледипасвир / софосбувир плюс рибавирин, достигли SVR12.

Софосбувир / велпатасвир / воксилапревир играет важную роль в качестве пангенотипического режима для пациентов, которые испытали неудачу в лечении с помощью DAA-терапии. Присутствие NS3, NS5A или NS5B RAS до лечения не влияло на вероятность SVR12, и 12 недель лечения приводили к высоким показателям SVR12 (96%) у пациентов с неответом на DAA. Доказано, что тестирование RAS не влияет на частоту SVR при терапии софосбувиром / велпатасвиром / воксилапревиром (Bourlière, 2017).
Софосбувир/велпатасвир/воксилапревир - схема для перелечивания всех больных кто не ответил на лечение препаратами прямого действия. Интересно присутствие до лечения NS3, NS5A или NS5B предварительно не влияют на стойкий вирусологический ответ и он очень высокий 96% у пациентов имеющих уже опыт лечения (Bourliere, 2017).

Ледипасвир при 1 а генотипе M28/T в 20 раз, Q30R в 100 раз и более, L31M/V оба в 100 и более раз, Y93H/N первое более 1000, второе более 10 000 чем дикий штамм вируса. При 1б генотипе мутация L31V/I более чем в 100 раз и вторая замена более чем в 50 раз. Y93H/N обе больше чем в 100 раз.
Омбитасвир При 1а генотипе M28/T в 1000 раз и более, Q30R в 100 раз и более, L31M/V первое менее чем 3 раза, вторая в 100 и более раз, Y93H/N более 10 000 чем дикий штамм вируса. При 1б генотипе мутация L31V/I менее чем в 10 раз. Y93H/N первая буква в 20 раз, вторая в 50 раз.
Даклатасвир При 1а генотипе M28/T в 100 раз и более, Q30R в 1000 раз и более, L31M/V первое более чем в 100 раз, вторая в 1000 и более раз, Y93H/N более 1000 раз и более 10 000 чем дикий штамм вируса. При 1б генотипе мутация L31V/I менее чем в 10 раз. Y93H/N первая буква в 20 раз, вторая в 50 раз.
Элбасвир При 1а генотипе M28/T в 20 раз и более, Q30R в 100 раз и более, L31M/V первое более чем в 10 раз, вторая в 100 и более раз, Y93H/N более 1000 раз и более 1000 чем дикий штамм вируса. При 1б генотипе мутация L31V/I менее чем в 10 раз. Y93H/N обе в 100 раз.
Велпатасвир При 1а генотипе M28/T в 10 раз и менее, Q30R в 3 раза и менее, L31M/V первая в 20 раз, вторая в 50 раз, Y93H/N более 100 раз и более 1000 чем дикий штамм вируса. При 1б генотипе мутация L31V/I менее чем в 3 раза. Y93H/N обе менее чем в 3 раза.

Ledipasvir/Sofosbuvir нельзя назначать больным c 1a генотипом и мутациями RAS по NS5A Q30H/R, L31M/V, Y93C/H/N. У больных 1в генотипом L31V, Y93H. При 3а генотипе этот препарат назначать нельзя.
Элбасвир и гразопревир нельзя назначать больным c 1a генотипом и мутациями RAS по NS5A L31M/V, Y93C/H/N, Q30H/R, M28A/T. У больных 1в генотипом Y93H.
Софосбувир + даклатасвир и Софосбувир + велпатасвир Y93H с 3 генотипом.

Выводы и обсуждение.

Первое определение генотипа вируса и его субтипа затем мутации вируса наиболее важно в клинической практике оно может помочь правильно выбрать схему лечения и подавить мутантный штамм вируса. Иногда встречаются два генотипа, то есть мутации в каждом из них. Делать анализ на мутации пациентам до лечения.
Использование Мавирета + софосбувир или Восеви для лечения больных кто не ответил на препараты прямого действия.
В мире не было проведено 2 и 3 фазы клинических исследований, тем кто не ответил на лечение препаратами прямого действия, поэтому, рекомендации о пролонгации терапии должны быть более обоснованы и конкретны, а добавление довольно токсичного и слабого рибавирина, по - моему опыту мало эффективное, и оказывает токсический эффект, что может привести к отмене лечения, а иногда и к серьезным осложнениям.
Использование 3 иногда 4 компонентную терапию у данных пациентов с RAS, кто не ответил на предварительное лечение препаратами нового поколения.
У автора обзора свое виденье данной проблемы он использует с эффективностью 100% разные схемы перелечивания и разработал профилактические методы рецидива болезни по индивидуальным особенностям людей с использованием мониторинга селекции вируса гепатита С и его кинетики в процессе терапии и даже 3а генотип и Y93H и цирроз не являются не излечимой проблемой как видим мы в начале обзора.
Др.Янченко В.И. тел. +38 099 124 74 29, +38 067 713 87 89

Определение мутаций устойчивости вируса гепатита В к противовирусным препаратам

Лекарственная устойчивость (резистентность) – природная или приобретенная способность возбудителя болезни сохранять жизнедеятельность при воздействии на него лекарственных средств. Как правило, лечение ХГВ проводится с применением аналогов нуклеозидов/нуклеотидов – ингибиторов РНК-зависимой ДНКполимеразы (обратной транскриптазы), которая кодируется Р-геном ВГВ. Противовирусный препарат встраивается в вирусный геном в процессе обратной транскрипции, и конкурентно ингибирует вирусную репликацию, т. о. эти лекарственные препараты эффективно снижают вирусную нагрузку у больных ХГВ. При возникновении некоторых точечных мутаций в Р-гене ВГВ аналоги нуклеозидов/нуклеотидов теряют способность встраиваться в растущую цепь ДНК вследствие конформационного изменения локуса связывания обратной транскриптазы. Мутации лекарственной устойчивости подразделяются на:

• основные (первичные) – мутации, снижающие чувствительность к противовирусному препарату;
• компенсаторные (вторичные) – мутации, которые компенсируют функциональные дефекты активности полимеразы, связанные с появлением первичной мутации.

Мутации устойчивости определяются по номеру позиции аминокислоты в домене обратной транскриптазы, причем аминокислота дикого типа указывается слева от номера аминокислоты, вариант мутации устойчивости – справа. Например, M204I – замена метионина, аминокислоты дикого типа, в 204 положении домена обратной транскриптазы на аминокислоту изолейцин, наличие которой в данной позиции ассоциировано с возникновением мутации лекарственной устойчивости.

Информация о наличии мутаций лекарственной устойчивости в геноме ВГВ необходима при выборе препаратов противовирусной терапии у пациентов, ранее получавших аналоги нуклезидов/нуклеотидов.

Показания к обследованию

Исследование предназначено для больных ХГВ в определенных случаях перед началом противовирусной терапии и во время приема противовирусных препаратов (Табл. 8).

Критерии назначения исследований для определения устойчивости ВГВ к противовирусным препаратам

Стадия ПВТ	Характеристика пациента	Назначение исследования
До начала ПВТ	Пациент лечения ранее не получал	Нет
	Ранее прерванное лечение	Да
	Неудачное лечение	Да
Во время приема ПВП	Первичная резистентность (12 неделя ПВТ)	Да*
	Вирусологичесий рецидив	Да

*Если пациент сохраняет приверженность к лечению.

Материал для исследования Плазма крови.

Методы лабораторных исследований

В клинической диагностике определение мутаций устойчивости вируса гепатита В к противовирусным препаратам включает ПЦР-амплификацию ревертазного домена Р-гена ВГВ и последующий анализ специфичных нуклеотидных последовательностей методами:

• прямого секвенирования амплифицированного фрагмента. Данный метод способен выявлять мутации устойчивости, если доля популяции вируса с мутацией составляет более 20%. Метод позволяет идентифицировать все мутации, включая дополнительные потенциальные компенсаторные и новые неизвестные;

Особенности интерпретации результатов

В результате проведенного исследования врач получает информацию по каждой аминокислотной позиции, ассоциированной с мутацией лекарственной устойчивости, и клиническую интерпретацию результатов исследования:

• ВГВ может быть устойчив к определенному противовирусному препарату, т. е. в ревертазном домене Р-гена ВГВ выявлены основные мутации устойчивости к этому препарату;
• ВГВ может быть чувствителен к противовирусному препарату, т. е. мутации устойчивости не обнаружены;
• у ВГВ возможно возникновение устойчивости к противовирусному препарату, т. е. выявлены только компенсаторные (вторичные) мутации устойчивости к этому препарату, основных мутаций не обнаружено.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Copyright ФБУН Центральный НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, 1998 - 2020

! Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Обнаружение мутаций резистентности к исходным данным новым антивирусам прямого действия (DAAs) у пациентов с хроническим инфицированием без HCV HCV может быть важным для их управления и прогнозирования результатов. В этом исследовании мы исследовали присутствие мутаций, которые, как сообщалось ранее, были связаны с резистентностью к DAAs в областях полимеразы HCV (NS5B) и HCV (NS3) в сыворотке пациентов, не получавших лечение.

РНК HCV у 152 наивных пациентов (84% итальянцев и 16% иммигрантов из разных стран), инфицированных различными генотипами HCV (21,1a, 21, 1b, 2, 2a, 60, 2c, 22, 3a, 25, 4d и 1, 4k) оценивали для анализа последовательности. Амплификацию и секвенирование фрагментов в областях NS5B (nt 8256-8640) и NS3 (nt 3420-3960) генома HCV проводили соответственно у 152 и 28 пациентов. Полиморфизм C316N / H в области NS5B, связанный с резистентностью к sofosbuvir, был обнаружен в 9 из 21 (43%) проанализированных последовательностей от инфицированных генотипом 1b пациентов. Естественно встречающиеся мутации V36L и M175L в области протеазы NS3 наблюдались у 100% пациентов, инфицированных подтипом 2c и 4.

Соответствующая доля пациентов с наивысшим генотипом 1b лечения, оцененная в этом исследовании, укрывала полиморфизм N316 и может плохо реагировать на лечение сфосбувиром. Поскольку sofosbuvir был одобрен для лечения хронической инфекции HCV в США и Европе, включая Италию, для этого препарата следует рассмотреть предварительное лечение полиморфизма N316 у пациентов с генотипом 1b наивно.

Вирус гепатита С (HCV) является глобальной проблемой здравоохранения. Примерно 3% населения мира инфицировано HCV, ведущей причиной цирроза печени, декомпенсацией печени, развитием гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) и трансплантацией печени во всем мире [1]. HCV характеризуется высокой генетической гетерогенностью и классифицируется по 7 генотипам и многочисленным подтипам [2]. Некоторые подтипы являются повсеместными, а другие распространены в определенных регионах [3]. В Италии распространенность HCV снижается. Недавние исследования, проведенные среди населения в северной и южной частях Италии, свидетельствуют о распространенности против HCV в диапазоне от 2,6 до 5,7 6. Однако среди исследователей распространено мнение, что в настоящее время в Италии распространенность хронических носителей HCV составляет около 1-1,5%. Наиболее частыми генотипами, циркулирующими в общей популяции, являются 1b, 2c и, в меньшей степени, 3a, в то время как распространенность генотипа 4 увеличилась в последние годы в южных регионах 8. Pegylated-Interferon plus ribavirin (peg-IFN-RBV) был стандартным методом лечения хронического гепатита С в течение многих лет, хотя он имел некоторые недостатки, такие как субоптимальный ответ на терапию у некоторых подмножеств пациентов (генотип 1 и 4 инфекции, расширенный фиброз печени) и побочные эффекты, часто приводящие к плохой переносимости и противопоказанию к лечению [9]. Недавно были разработаны новые препараты против HCV, называемые противовирусными агентами прямого действия (DAA). DAAs нацелены на различные области генома HCV и могут быть выделены в ингибиторах протеазы NS3 / 4A (PI), NS5A-ингибиторах, нуклеозидах NS5B (NPI) и ингибиторах нуклеозидной полимеразы (NNPI). Boceprevir и Telaprevir, первые поколения NS3 PI, были одобрены в 2011 году в США Управлением по контролю за продуктами и лекарствами и Европейским агентством по лекарственным средствам (EDA) для лечения хронического гепатита C. Эти препараты, однако, вводились в комбинации с peg-IFN и рибавирин были затруднены низкой эффективностью против не-1 генотипов, серьезных побочных реакций и низкого генетического барьера на резистентность. В дополнение к ИП первого поколения два новых NS3 PIs (Simeprevir и Faldaprevir) один ингибитор NS5A (Dataclasvir) и один NS5B NPI (Sofosbuvir) были недавно (FDA, EMA, 2014), одобренные для лечения хронического гепатита C [10] , Последние DAAs увеличивают частоту ответов, позволяют сократить и упростить схемы лечения и имеют более высокий генетический барьер на устойчивость [11]. Однако эффективность новых DAA может зависеть от развития мутаций, резистентных к лекарственным средствам. Из-за большого разнообразия последовательностей, высокой скорости репликации и низкой достоверности РНК-полимеразы HCV, многочисленные варианты, определяемые как квазивиды, существуют in vivo у инфицированного HCV пациента [12]. Некоторые из этих вариантов могут переносить аминокислотные замены, которые определяют изменения конформации сайта связывания с лекарственным средством, что вызывает резистентность во время терапии [13, 14]. Эти заместители на лекарственную устойчивость, которые обычно появляются после нескольких дней лечения DAAs и несут ответственность за неудачу лечения (особенно с препаратами первого поколения) [15, 16] или гипоспортивность лечения, также могут быть обнаружены у пациентов, 17-23]. Сообщалось, что эти естественно устойчивые варианты происходят на переменных частотах и ​​зависят от генотипа / подтипа. Фактически, частота мутаций естественного сопротивления для первого поколения NS3 PI ниже в генотипе 1b по сравнению с пациентами генотипа 1a [19]. В нескольких исследованиях были исследованы мутации резистентности к NS3 PI у пациентов, не получавших лечение, у пациентов с не-1 генотипом, но только один из них обнаружил две основные мутации (V158M для генотипа 2c и D168E для генотипа 4) у значительного числа инфицированных пациентов с генотипами 2c и 4 [23]. Напротив, многие замены, связанные с резистентностью к NS3 PI, были зарегистрированы для генотипа 1 [24]. Мутация S282T в области полимеразы NS5B, идентифицированная in vitro [25] и in vivo у 2b инфицированных пациентов, которые проваливали терапию во время клинического испытания [26, 27], является единственной мутацией, которая до сих пор, безусловно, была связана с резистентностью к sofosbuvir. Действительно, несколько других подстановок NS5B также были предложены как ответственные за неудачу лечения sofosbuvir [28]. В частности, базовый полиморфизм NS5B в положении 316 потенциально связан с уменьшением скорости ответа на sofosbuvir у пациентов с генотипом 1b [29]. Цель этого исследования состояла в том, чтобы исследовать наличие резистентных к DAAs вариантов в областях сероновой протеазы NS5B-полимеразы и NS3, анализируя пациентов с хроническим гепатитом C, которые не получали никаких DAA.

Это исследование включало 152 DAA-наивных пациентов, хронически инфицированных генотипом HCV 1a (n = 21), 1b (n = 21), 2a (n = 2), 2c (n = 60), 3a (n = 22), 4d ( n = 25) и 4 k (n = 1) 8, и анализировали для области NS5B (nt 8256-8640) с использованием праймеров и условий амплификации, о которых сообщалось в другом месте [4, 6-8]. Для 28 (11, 1b, 11, 2c и 6, 4d) из этих 152 пациентов область HCV-NS3 (3420-3960) также амплифицировали с помощью вложенной ПЦР с использованием в первых круглых праймерах и условиях амплификации, о которых сообщалось ранее [30]. Во втором раунде использовались новые разработанные праймеры и другая программа термического цикла, в то время как все другие условия амплификации (буфер, концентрация праймеров и т. Д.) Были такими же, как и в первом раунде ПЦР (таблица 1). Для секвенирования использовался автоматизированный секвенсор ДНК (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA). Нуклеотидные последовательности собирали с использованием программного обеспечения Chromas и выровняли с использованием пакета ClustalW. Таблицы 1Primers, используемые для амплификации гена HCA NS3 протеазы

a Ранее опубликованные праймеры (Vallet S [30])

b Грунты, выбранные путем выравнивания последовательностей из банка данных Los Alamos

c Условия амплификации во второй ПЦР для генотипа 1b были: 2 ‘при 94 ° C, а затем 30 циклов при 94 ° C для 30 °, 60 ° C для 30 ° и 72 ° C для 45 °, плюс удлинение при 72 ° ° С для 7 ‘

d Условия амплификации во второй ПЦР для генотипа 2c были: 2’a 94 ° C, а затем 30 циклов при 94 ° C для 30 °, 62 ° C для 30 ° и 72 ° C для 45 °, плюс удлинение при 72 ° ° С для 7 ‘

e Условия амплификации во второй ПЦР для генотипа 4 были: 2’a 94 ° C, а затем 30 циклов при 94 ° C для 30 °, 60 ° C для 40 ° и 72 ° C для 45 °, плюс удлинение при 72 ° ° С для 7 ‘

Было проанализировано 152 пациента (81 мужчина и 55 женщин, медианный возраст 47, диапазон 20-90 лет). Около 84% (127/152) этих пациентов были итальянского происхождения, а остальные 25 пациентов были иммигрантами из разных стран. Из сыворотки этих пациентов были получены 152 NS5B и 28 NS3 последовательностей. Все аминокислотные замены в полимеразной зоне NS5B и NS3-протеазы, потенциально связанные с резистентностью к DAAs у пациентов с HCV-инфицированным лечением, в этом исследовании, показаны в таблицах 2 и 3 соответственно. Фрагмент полимеразы NS5B всех проанализированных генотипов не показал, что мутация, известная как вызывающая высокий уровень резистентности к sofosbuvir in vitro (S282T), а также другие мутации, недавно считавшиеся ответственными за неудачу лечения sofosbuvir в клинических испытаниях (V321I / A, L320F / C ) [22]. Принимая во внимание, что полиморфизм C316N / H, потенциально связанный с уменьшенной частотой ответа на sofosbuvir в хронически инфицированных пациентах генотипа 1b HCV [23], был обнаружен в 9 из 21 (43%) проанализированных последовательностей 1b (полиморфизмы C316N и C316H были обнаружены в 8 и у 1 пациента, соответственно). Никакие замены, дающие устойчивость как для первого поколения, так и для новых NS3 PI (Simeprevir и Faldaprevir), наблюдались в области NS3 последовательностей генотипа 1b. Вместо этого замены V36L и M175L знают, что индуцируют пониженную восприимчивость исключительно к PI первого поколения при инфекциях генотипа 1, естественно присутствуют в NS3-области генотипа 2c и 4d-последовательностей. Таблицы 2Аминокислотные замены в области полимеразы HC5 NS5B, связанные с резистентностью к DAAsa в пациенты, не получающие лечение

противовирусные агенты прямого действия

Rb, Region; Pc, Position aa; Dd, Dominant aa; Я, Мутант аа; (Дональдсон, [29], Лам, [25], Тонг, [28])

* Процент последовательностей с заменами

• Доминирующий остаток находится в 100% проанализированных последовательностей для каждого генотипа

Аминокислотные замены в области протеазы HCV NS3, связанные с резистентностью к DAAsa у пациентов, не получавших лечение

противовирусные агенты прямого действия

Rb, Region; Pc, Position aa; Dd, Dominant aa; Я, Мутант аа; (Lopez-Labrador, 2008; Lentz, 2010; Kieffer [15], Halfon [13], Kuntzen [19])

* Процент последовательностей с заменами

• Доминирующий остаток находится в 100% проанализированных последовательностей для каждого генотипа

f Замена найдена связана с резистентностью в генотипе 1b

Наконец, в области NS3 наших проанализированных генотипов (табл. 4, 5 и 6) были обнаружены несколько полиморфизмов, не связанных с резистентностью к DAAs и уже сообщенных другими [18]. Таблицы 4Полиморфные сайты в области HCA 1b NS3-протеазы, обнаруженные в этом изучение

a Остаточные остатки сообщаются как в последовательности HCV-1a дикого типа

Число пациентов с мутантными штаммами ВГС указано в скобках

Полиморфные сайты, не связанные с резистентностью к DAAs в HCV 2c NS3-протеазе

a Остаточные остатки сообщаются как в последовательности HCV-1a дикого типа

Число пациентов с мутантными штаммами ВГС указано в скобках

Полиморфные сайты в протеазе NS3 HCV-4, не связанные с резистентностью, обнаружены в этом исследовании

a Остатки сообщаются как в последовательности HCV-1a дикого типа

b Число пациентов с мутантными штаммами HCV указано в скобках

В этом исследовании сообщается о результатах секвенирования HCV у 152 пациентов, не получавших лечение, хронически инфицированных различными генотипами HCV. У этих пациентов мы оценивали наличие известных мутаций резистентной резистентности, фокусирующихся на областях NS5B-полимеразы и NS3-протеазы. Аминокислотные замены, такие как V36L и M175L, связанные с резистентностью к ВГС-генотипу 1 in vivo и in vitro, естественно наблюдались у 100% наших пациентов, инфицированных генотипом 2c и 4d. Влияние этого последнего исследования на терапию неясно. Действительно, boceprevir и telaprevir показали меньшую эффективность против генотипа 2 и почти не имели эффективности против других не-1 генотипов, включая генотип 4. Мы не можем исключать, что заявленная низкая эффективность boceprevir и telaprevir против генотипа 2 и 4 зависит от наличия эти естественные полиморфизмы, обнаруженные нами и другими [23]. Мутации в области NS3 редко обнаруживаются у наивных пациентов. К сожалению, по техническим причинам анализ последовательности области NS3 в этом исследовании ограничивался только 28 образцами сыворотки. Однако эти описательные частотные данные могут быть полезны для дальнейших исследований, которые анализируют этот участок РНК ВГС в прогнозе результатов противовирусной терапии HCV. Что касается наличия мутаций устойчивости к sofosbuvir для предварительной обработки, вариант S282T не был обнаружен ни у одного из наших пациентов, независимо от генотипа. Это согласуется с литературными данными о том, что варианты S282T в основном обнаружены in vitro [25]. Вероятно, наш отрицательный результат, связанный с обнаружением этой мутации, может быть также обусловлен пределами метода секвенирования, используемого в этом исследовании. Действительно, метод Сенгера может потенциально исказить совокупность вирусных квазивидов, укрытых инфицированным HCV пациентом [27]. Фактически, в недавнем исследовании вариант S282T был обнаружен путем глубокого секвенирования при 0,05% вирусных последовательностей на исходном уровне у инфицированного генотипом 2b субъекта, который рецидивировал после 12 недель монотерапии SOF [27]. Кроме того, другие наименования S282 (S282R / G / C) были идентифицированы у наивных субъектов [31].

Недавно были обнаружены новые (возникающие при лечении) мутации NS5B (L159F, L320F и V321A) у пациентов с HCV-инфекцией, у которых не было лечения sofosbuvir [29]. Важно отметить, что базовый полиморфизм в положении 316 был связан с неудачей лечения софосвивиром у инфицированных генотипом 1b пациентов [29]. Сообщалось, что мутация C316 расположена закрытой для каталитической триады полимеразы NS5B, и изменения в этом положении могут предотвратить связывание софосвивира [29]. Мы нашли замену 316 N / H в 43% последовательностей генотипа 1b. Такое же положение, как и положения 320 и 321, было высококонсервативным (100%) в других проанализированных генотипах. Определение базовых мутаций резистентности к Daas может иметь важное значение для управления пациентами и итоговому предвидения. В связи с этим обнаружение 316 N / H полиморфизма у 43% наших 1b наивных инфицированных пациентов представляет собой наиболее подходящий вывод этого исследования, поскольку эти пациенты могут плохо реагировать на терапию sofosbuvir. Действительно, недавнее исследование показало, что исходные полиморфизмы в положении 316 потенциально связаны с уменьшением частоты ответов у субъектов генотипа 1В HCV [29]. В заключение, тестирование перед обработкой полиморфизма C316N на генотип 1b HCV, по-видимому, указывается для наивных пациентов, рассматриваемых для лечения, включая sofosbuvir.

Вирус гепатита С

Противовирусные агенты прямого действия

Ингибиторы нуклеозидной полимеразы NS5B

Ингибиторы ненуклеозидной полимеразы NS5B

Неструктурный регион 3

Неструктурная область 5B

Все авторы не объявляют конфликта интересов.

AR C концепция исследования и разработка, анализ и интерпретация данных, а также критический пересмотр рукописи для важного интеллектуального контента; AC молекулярный анализ, интерпретация данных, написание рукописи и критический пересмотр рукописи на важный интеллектуальный контент; ES интерпретация данных, внесение в письменной форме рукописи и критический пересмотр рукописи на важный интеллектуальный контент; RB интерпретация данных и критический пересмотр рукописи для важного интеллектуального контента; ME, а также критический пересмотр рукописи для важного интеллектуального контента. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись для публикации.

Это исследование финансировалось Министерством здравоохранения Италии (Национальный центр профилактики и контроля заболеваний, Fasc. 3 M58).