Характеристика культур клеток вирусы

Популяцию клеток тканей, которая способна развиваться и существовать in vitro (в пробирке), называют культурой клеток.

Впервые методику приготовления культур клеток предложили Дульбекко и Фогт в 1952 г. В настоящее время в практику вирусологических исследований внедрены несколько видов культур клеток:

1)Первичные трансинизированные – популяции клеток, полученные из тканей, взятых непосредственно из организма. Для приготовления первичных культур клеток используют органы (почки, тимус, легкие, тестикулы (яички) эмбрионов или новорожденных животных). Хорошо известна культура куриные фибробласты, эпителий и мышцы куриного эмбриона, образующие слой в толщину клетки на поверхности стекла. Почка эмбриона теленка, поросенка представляет почечный эпителий, выросший и прикрепленный к стеклу. Первичные культуры характеризуют как монослойные и прикрепленные.

В развитии популяции клеток установлено 4 фазы роста: 1)адаптации 2)логарифмического роста 3)стационарная 4)старение.

2)Субкультуры получают из первичных культур снятием со стекла и ресуспензированием в новой питательной среде. Они выдерживают 3-5 переливаний. Субкультуры получены из всех первичных, кроме куриных фибробластов.

3)Полуперевиваемые диплоидные – морфологически однородная стабилизированная популяция клеток, имеющая ограниченный срок жизни с тремя фазами роста, сохраняющая кариотип, свободная от контаминантов и не обладающая онкогенной и туморогенной активностью при трансплантации хомячкам. Впервые диплоидную клеток ВНК-21 (почка хомяка) получили Хейфлик, Мурхед в 1961 г. Полуперевиваемые культуры клеток получены из тканей эмбрионов (почка теленка, свиньи). Полуперевиваемые культуры клеток могут быть жизнеспособными в течение 10-12 дней, если переливать еженедельно – живут 4 недели, выдерживая до 50 переливаний.

4)Перевиваемые культуры клеток – популяции клеток тканей, способные к размножению in vitro неограниченное время. Перевиваемые культуры клеток специально получены в результате селекции единичных клеток эмбриональной ткани и злокачественных опухолей. Известны переливаемые культуры клеток из злокачественных опухолей Hella – карцинома, Hep-3 – лимфоидная карцинома, КВ – карционома. В ветеринарной вирусологии широко применяют переливаемые культуры клеток из эмбриональных тканей – СПЭВ (перевиваемая почка эмбриона свиньи), ППЭС (перевиваемая почка эмбриона свиньи), ППТ (перевиваемая почка теленка), ППО (перевиваемая почка овцы), ТR (трахея коровы), L (мышиные фибробласты), COLS (сердце обезьяны). Современные перевиваемые культуры клеток ПГ80, Т1 (почка теленка), ЛЭВ (легкое эмбриона коровы), WERO (почка зеленой мартышки), КСТ (коронарные сосуды теленка).

5)Суспензионные культуры клеток – популяция клеток, не прикрепленная к стенкам пробирок, находятся в свободном состоянии.

Многие перевиваемые культуры клеток превращены в суспензионные (ВНК21, Hep-2, МДВК). Лучшие накопления суспензионных клеток получают при использовании носителей: сефадекс, силикагель, фитолат. Культуры клеток при длительном использовании консервируют: +4 0 С в течение 1-6 недель; -78 0 С – сухой лед; -196 0 С в жидком азоте. Консервирование включает: снятие клеток, суспензирование в питательной среде с добавлением 10-40 % сыворотки, 10 % ДНСО, антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, мономицин, гентамицин) в дозе 100 мкг/мл и больше. Расфасовку в ампулы и замораживание. Ампулы с замороженными клетками можно транспортировать при 40 0 С, живые 7-8 дней. Для снятия клеток со стекла используют раствор 0,25 % трипсина на фосфатном буфере, раствор Версена (натриевая соль диаминтетрауксусной кислоты на 0,02 % растворе Хенкса). Растворы Хенкса, Эрла содержат соли, глюкозу, индикатор на бидистиллированной воде. Восстанавливают размораживаем, затем вносят питательную среду, которую на другой день меняют.

Выращивают культуры клеток на питательных средах естественных и искусственных, синтетических и полусинтетических.

Естественные питательные среды – это смесь раствора Хенкса, Эрла и сыворотки крови, эмбрионального экстракта (используют редко).

Искусственные полусинтетические – ферментативные гидролизаты, казеиновый гемогидролизат, аминопептид, лактоальбумины (в количестве 2,5-5 %).

Искусственные синтетические: среда 199 (содержит 60 компонентов), среда Игла.

Указанные среды имеют рН 7,2-7,4. Содержат индикатор феноловый красный и имеют красный цвет. При снижении рН желтеют. При повышении приобретают красно-малиновый оттенок.

По назначению питательные все питательные среды для культур клеток подразделяют на ростовые – обеспечивают жизнь, размножение клеток, содержат сыворотку крови (телят, эмбриональную КРС); поддерживающие – обеспечивают существование клеток после заражения вирусом.

Типы взаимодействия вирусов с клеткой.

Известно 7 типов взаимодействия вирусов с клетками.

1)Различные патологические изменения от угнетения функциональной активности до повреждения структур клеток. Впервые повреждение структур клеток обнаружил Хуан, Эндерс в 1943 г. Такое действие вируса они называли цитопатогенным (ЦПД). Современное название – цитопатический эффект ЦПЭ. Сущность ЦПД заключается в угнетении митоза, влиянии на хромосомный аппарат, лизисе клеток, отчего в культурах клеток возникает феномен бляшкообразования. Влияние ЦПД вирусов на митоз макро-, микроскопически проявляется появлением округлых клеток, образованием симпластов (гигантских многоядерных клеток), образование синтициев (конгломератов в цитоплазме с многочисленными ядрами), что происходит в результате массовой гибели клеток. При влиянии на генетический аппарат происходит сморщивание ядра, образование телец-включений.

2)Интерференция – подавление вируса в клетке.

3)Накопление вируса без повреждения клетки. Например, вирус классической чумы свиней.

4)Пролиферация – бурное деление клеток, инфицируемых вирусом. Клетки активно размножаются и содержат в геноме вирус.

5)Изменение метаболизма клеток с накоплением кислых продуктов в клетке. Такой тип взаимодействия у вируса полиомиелита человека. Вспышка полиомиелита в СССР 1951-1952 гг. Был создан институт полиомиелита во Внуково. Сейчас – массовая вакцинация. У животных вирус полиомиелита не циркулирует.

6)Адсорбция эритроцита клетками, которые инфицированы вирусами. Вирус ПГ3 (парагрипп). Обнаруживают данный феномен в реакции гемадсорбции.

7)Агглютинация (склеивание) эритроцитов культуральной жидкостью. Вирус НБ – болезнь Ньюкасла.

ОСНОВЫ ГЕНЕТИКИ ВИРУСОВ

Материальная основа генетической информации вирусов

Вирусами характеризуются двумя свойствами:

1) Наследственность – свойство обеспечивать преемственность поколений.

2) Изменчивость – способность изменять генетический состав.

Материальной основой генетической информации у вирусов является геном – последовательность нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты. Различают цельный геном и фрагментированный, когда каждый фрагмент нуклеиновой кислоты – ген. Количество генов у вирусов от 3 до 30. В составе вирусных генов есть экзоны – смысловые кодирующие фрагменты, и интроны – не кодирующие участки гены.

У большинства вирусов геном гаплоидный (одинарный). У некоторых, например ретровирусы, – диплоидный (двойной).

Вирусы подвержены изменчивости в связи: 1) с высокой численностью образующейся популяции; 2) быстрой сменой поколений; 3) гаплоидностью генома, его малой емкостью (3-30 генов); 4) непрерывностью репродукции.

Все признаки вируса, кодированные в генах, называют маркёрами. Различают видовые маркёры (биологические свойства вида) и внутриштаммовые маркёры.

Основу наследственных изменений у вируса составляют два процесса – мутации и рекомбинации.

Мутации – изменения последовательности нуклеотидов в геноме, ведущие к изменению биологических свойств, которые передаются по наследству.

По механизму действия мутации происходят в результате делеции (выпадения одного или нескольких нуклеотидов), трансверсии (взаимозамены пуриновых и пиримидиновых оснований нуклеиновой кислоты в результате действия каких-то ферментов), транзиции (замена одного пуринового или пиримидинового основания на другое, например цитозин меняется на урацил).

По локализации изменения в геноме бывают точечными в одном или двух нуклеотидах; обширными (аберрации) – замена значительного участка генома.

По обратимости известны необратимые, прямые мутации; образующиеся мутанты начинают широко распространяться, могут даже вытеснить дикие виды, полевые виды, от которых они произошли; обратимые мутации (истинные реверсии) – когда происходит восстановление поврежденного генома.

По происхождению мутации бывают спонтанные в результате перегруппировки оснований нуклеиновой кислоты, из-за ошибок ферментов ДНК- и РНК-полимеразы; индуцированные – происходят под действием химических, физических и биологических факторов. Индуцированные мутации используют для получения вакцинных штаммов вируса. Химическими мутагенами считают азотистые основания, алкилирующие соединения, азотистую кислоту, гидроксиламин. К физическим мутагенам относят УФЛ, повышение температуры, изменения рН. К биологическим мутагенам относят пребывание вируса в организме слабо восприимчивого или не восприимчивого животного, в культурах клеток из гетерогенных тканей, в КЭ. В результате многочисленных пассажей происходит изменение генного состава, а мутанты стабильно и окончательно теряют вирулентность.

Рекомбинация, или обмен генами между вирусами, может быть межгенная (обмен целыми генами), а также внутригенной (обмен участками генов).

Рекомбинацию вирусов называют гибридизация.

Она проявляется множественной реактивацией – восстановлением поврежденного генома путем добавления его генами с помощью обмена.

Кросс-реактивация – восстановление активности инактивированного (убитого) вируса неповрежденным геномом другого вируса, а также в результате взаимодействия геномов двух убитых вирусов.

Пересортировка генов, когда вирусы с фрагментированным геномом образуют группировки генов, обеспечивающих повышенную жизнеспособность вируса, – их называют реассортанты.

Гетерозиготность. При совместной репродукции разных видов вируса образуются объекты, содержащие полный собственный геном и часть генома другого вируса, иди полностью геном другого вируса, – такие вирусы называют гетерозиготными.

Комплементация – объединение генов синтеза ранних вирусных белков у поврежденных вирусов. В результате дефективные вирусы, не способные к репродукции по одиночке, начинают проходить полный цикл репродукции.

Негенетическая реактивация, когда вирус с денатурированными белками способен к репродукции за счет активности ферментов другого вируса.

Вирусам свойственны и не генетические взаимодействия:

1.Фенотипическое смешивание – при совместной репродукции разных видов образуются вирусы с собственным геномом, но белками других вирусов. По антигенным свойствам такие вирусы соответствуют виду и другим видам.

2.Интерфирирубщее взаимодействие обозначает состояние невосприимчивости клетки к вторичному заражению; обусловлено угнетением адсорбции и трансляции.

ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ИММУНИТЕТ. ПРОТИВОВИРУСНЫЕ СРЕДСТВА. ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЕ ПРЕПАРАТЫ.

Противовирусное действие показателей естественной резистентности (ЕР)

Неспецифическая противовирусная резистентность обусловлена отсутствием в клетках организма рецепторов для взаимодействия с вирусом и условий, необходимых для культивирования вирусов в клетках, а также ингибиторов вирусов (угнетения вирусов).

Репродукции вирусов препятствуют общефизиологические показатели: кожно-слизистый барьер (механическая преграда), муциновый слой слизистых (препятствует адсорбции), повышение температуры тела (инактивирует вирионы, а также подавляет репродукцию внутри клеток), снижение рН внутри клеток (препятствует репродукции), выделение вируса почками, кишечником снижает его титр в организме.

Клеточные факторы имеют ограниченное противовирусное действие.

Клетки СМФ (системы мононуклеарных фагоцитов) распознают чужеродность вируса.

ЕК (естественные киллеры) могут лизировать клетки, содержащие вирус. Активность ЕК приводит к понижению титра вируса в организме, однако главная функция ЕК – уничтожение опухолевых клеток, разрушение метастаз в организме (цитолиз – разрушение клеток).

Гуморальные факторы ЕР имеют существенной профилактическое значением при вирусных инфекциях.

Главный фактор – система ИФН, которая включает синтез и содержание интерферонов в организме, α-интерферон активно уничтожает вирионы за пределами клетки. Интерферон также подавляет синтез компонентов вирусов клетки.

Фракция комплемента С₃ усиливает нейтрализацию вирионов Jg (антителами), лизирует клетки, содержащие вирус, т.е. снижает активность репродукции, – они превращаются в вирионы, которые нейтрализуются ИФН и Jg.

Фракция комплемента С₁ инактивирует вирионы ретровирусов.

Механизм противовирусного иммунитета

Каждый вирус представляет сложную смесь антигенов белковой природы, способная вызвать иммунный ответ. Вирусы – хорошие антигены. Против них активно образуются Jg.

В составе вируса содержатся как Т-зависимые антигены, нуждающиеся в распознании с помощью Т-хелперов, так и Т-независимые, способные запускать механизм синтеза Jg и активизировать В-лимфоциты.

Противовирусный иммунитет начинается с распознания антигенов вируса вспомогательными клетками иммунной системы (клеток АПК (вспомогательные, антиген-презентирующие клетки): макрофаги, клетки Лангерганса кожи и поджелудочной железы, вуалевые (интердигидальные) клетки лимфоузлов, дендритные клетки костного мозга. Вспомогательные клетки в ответ на антигенное раздражение секретируют медиаторы, в первую очередь интерлейкин-1 (ИЛ-1). Он активизирует пролиферацию (размножение) и дифференциацию Т-клеток, начинают образовываться Т-хелперы, которые необходимы для распознавания Т-зависимых антигенов, и Т_ц-клетки (цитотоксические клетки), способные лизировать клетки, содержащие вирусы. Тц-клетки очень активные при отторжении ткани, а их высокий титр при вирусных заболеваниях может вызвать повреждение внутренних органов. Пролиферацию Тц-клеток активируют интерлейкин-2 и интерферон. ИЛ-1 активизирует В-клетки, которые секретируют Jg.

Против вирусов образуются Jg A, Jg G, Jg M. Jg нейтрализуют вирионы, участвуют в цитолизе клеток-мишеней совместно с С₃-интерфероном.

При вирусных заболеваниях образуются Т-эффекторы, медиаторы которых в частности ИЛ-2 и другие, тоже нейтрализуют вирионы.

Имеет место образование Т_гзт, а также Т-супрессоров (Тs), высокая активность которых формирует ИДС (иммунно-дефицитное состояние), например, при ВИЧ.

При вирусных заболеваниях очень мало образуется Jg E, которые при взаимодействии с тучными клетками образуют медиаторы воспаления.

Jg A работают на поверхности слизистых, нейтрализуют вирионы, резко понижают титр вируса в организме. Jg G и Jg M циркулируют в крови и нейтрализуют вирионы.

Иммунопатологическое действие вирусов

Противовирусный иммунитет может приводить к неблагоприятным последствиям, которые характеризуются как иммунопатологическое действие вирусов. Такой иммунный ответ вызывают возбудители. Такое действие может проявляться:

1) Накоплением иммунных комплексов (ИК, ЦИК – циркулирующий иммунный комплекс), большие количества которых накапливаются в органах, содержащих мембраны, а именно в почечных гломерулах, на синовиальных оболочках суставов, в хориоидальных сплетениях (паутинная сосудистая оболочка мозга), на стенках сосудов. Скопления ИКов, с которыми не могут справиться фагоциты, приводят к воспалению мест скопления ИКов – гломерулонефритам, арахноидитам (последствие чумы собак после длительной вирусемии), артритам.

2) Повреждением клеток тканей Т_ц-лимфоцитами. Чаще всего Т_ц-клетки повреждают печень. Клинически – гепатит, цирроз печени.

3) Формирование ИДС в результате высокой активности Т-супрессоров – имеет место при многих вирусных заболеваниях, выздоровевшие – чувствительны к бактериальным инфекциям.

Цель химиотерапии вирусных болезней – создать препараты химического синтеза, подавляющие репродукцию, не повреждающие клетки и весь организм в целом.

Известные противовирусные средства оказывают на клетки токсическое действие. Известно 4 группы препаратов, подавляющих:

1) начальную стадию репродукции (адсорбцию)

2)средняя стадия (синтез компонентов)

3)заключительную стадию (сборку и выход вирусов)

4)репродукцию на разных стадиях

К ингибиторам начальных стадий относят: ремантадин (против гриппа, НБ, кори, краснухи), амантадин (грипп, краснуха, корь, НБ)

Ингибиторы синтеза вирусных компонентов (средняя стадия): азидотимидин (ВИЧ, онкогенные вирусы), ацикловир (герпес), рабавирин (грипп, ПГ-3), тамифлю (грипп), гамапрен (герпес-вирусная инфекция кошек – инфекционный ринотрахеит кошек).

Ингибиторы сборки и выхода: метисазан (оспа свиней, мазь применяется местно), гордокс (ВИЧ, онкогенные вирусы), контрикал (ВИЧ, онкогенные вирусы), апротинин (ВИЧ, онкогенные вирусы).

Препараты разных стадий репродукции: мегасин (герпес), хелипин (герпес), идуксуридин (герпес), хелепин (герпес), оксолин (грипп), арбидол (грипп), инговерин (грипп, ПМБ-вирусы, аденовирусы), фоспренил (ПМБ-вирусы, парвовирусы, кальцивирусы).

В химиотерапии применяют иммуностимулирующие препараты и их индукторы, а чаще всего с них начинают.

К иммуномодулирующим препаратамотносят средства химической природы или биологического происхождения, способные модулировать (угнетать) или стимулировать иммунные реакции.

По происхождению они бывают гомологичные и гетерологичные.

К гомологичным относят вещества, вырабатываемые в организме, - их называют цитокины, обладают иммуностимулирующим действием. К ним относят интерфероны, интерлейкины, миелопептиды, вещества тимуса.

К гетерологичным иммуномодуляторам относят химические вещества: аскорбиновая кислота, левомизол (антигельминтное средство для человека; для кошек – смертельно), левокадин, гамавит (содержит нуклеинат натрия), циклоспарин А (ведущий отечественный иммунодепрессант, продуценты его – микроорганизмы, применяют перед пересадкой органов и тканей человеку).

По механизму действия иммуномодуляторы делят на вещества, влияющие на:

1)СМФ (система мононуклеарных фагоцитов) и продуцирование интерферона (α-интерфероны – нейтрофилы, γ-интерфероны – лейкоциты): гамавит, риботан

2)на Т- и В-систему: тимолин, тимоктин, продигиозан

3)Иммуномодуляторы – индукторы интерферона и активаторы Т-системы: аскорбиновая кислота, гентамицин

Цель занятия

Изучить различные виды культур, их номенклатуру. Изучить материальное обеспечение при производстве клеточных культур.

Оборудование и материалы

Растворы Хенкса. Эрла, питательная среда 199, Игла, гидролизат лактальбумина, матрасы, флаконы, стеклянная посуда, готовые культуры клеток, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме

Объяснение преподавателя

Выращивание культур клеток для получения различных биологических про­дуктов, проведения научно-исследовательских или диагностических работ явля­ется революционизирующим моментом XX в. Признание идеи о том, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, датируется первым десятилетием XX в. После того как стало известно, что подобные процессы реальны, наступил вто­рой этап работ – выращивание клеток и репродукция в них вирусов. Третий и четвертый этапы начинаются с появлением возможности вставить в клетки экзогенно полученные гены и получить их экспрессию и подтверждения возмож­ности выращивания из одиночной клетки целой популяции (гибридом что знаменуют собой возможность получения трансгенных систем и клонирования организмов. В настоящее время ни одна вирусологическая лаборатория не может обойтись без культуры клеток. Культуры клеток имеют следующие преимущества перед лабораторными животными и куриными эмбрионами:

- можно добиться заражения практически всех культур клеток, что позволяет получать вируссодержащий материал с наивысшей концентрацией вируса при наименьшем содержании белкового балласта;

- поскольку можно получить культуры клеток любого вида животного, снимаются видовые ограничения культивирования вирусов;

- возможно вмешательство в инфекционный процесс в любой момент, не нарушая целостности живой системы;

- можно непрерывно контролировать ход инфекционного процесса;

- возможно получение готовой суспензии вируса в виде культуральной жидкости;

- соблюдается полная стерильность культуральном жидкости в отношении грибов и бактерий;

- предельно просты техника заражения и получение вируссодержащего материала;

Культуры клеток – наиболее совершенная из лабораторных система для культивирования вирусов. В вирусологической практике культуры клеток чаще всего используют для первичного обнаружения вирусов и их выделения из патологического материала, накопления вируса при изготовлении вакцин и диагностикумов, поддержания вирусных штаммов в лаборатории, титрования вирусов и как тест-объект в реакции нейтрализации.

Для успешного выделения вируса необходимо соблюдать следующие требования:

используемая культура клеток должна быть чувствительной к предполагаемому вирусу. Чувствительность ее повышается, если клетки получены от молодых животных (лучше эмбрионов).

ТИПЫ КУЛЬТУР КЛЕТОК

Культура клеток – это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro).

Методика культивирования клеток особенно успешно стала развиваться после 40-х годов текущего столетия. Этому способствовали следующие обстоятельства: открытие антибиотиков, предотвращающих бактериальное заражение культур клеток, открытие Хуангом (1943) и Эндерсом (1949) способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток (цитопатический эффект) – удобный метод индикации вирусов в культурах клеток, и, наконец, Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и получения однослойных культур клеток.

В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток.

Первично-трипсинизированные культуры клеток – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой (рис. 27). Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако лучше это удается сделать из эмбриональных органов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для этих целей используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных.

Рисунок 27 - Первичная культура клеток легких эмбриона овцы (по Троценко Н.И. и др.)

Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают их на кусочки (1-4 мм) и обрабатывают ферментами: трипсином, панкреатином, коллагеназой и другими (чаще трипсином). Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37 °С.

Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делиться. В развитии культур клеток различают несколько фаз: адаптации, логарифмического роста, стационарную и старения (гибель клеток). Размножаясь, клетки размещаются на поверхности стекла и при полном покрытии его в один слой контактируют друг с другом и прекращают делиться (контактная ингибиция). На стекле формируется слой толщиной в одну клетку (поэтому эти культуры клеток называют однослойными или монослойными).

Обычно монослой формируется через 3–5 дней. Скорость его формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов.

Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7–21 дня (в зависимости от вида клеток и состава питательной среды).

Интенсивность размножения клеток и состояние монослоя контролируют визуально под малым увеличением микроскопа (объектив х10). Лучше для этой цели использовать инвертированный микроскоп.

Для культивирования вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался монослой).

Субкультуры.В вирусологической практике часто используют субкультуры, которые получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, ресуспендирования в новой питательной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2–3 сут формируется монослой.

Практически субкультуру можно получить из всех первичных культур клеток. (Хуже субкультивируются куриные фибробласты.) Субкультуры по чувствительности к вирусам не уступают первичным культурам клеток, кроме того, они более экономичны, и есть возможность выявления контаминации клеток вирусами. Субкультуры получают от 2–5 пассажей (перевивок) и очень редко до 8–10. Последующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели.

Если клеточные культуры прошли более 10 пассажей, они уже на стадии перехода к перевиваемым культурам клеток.

Перевиваемые культуры клеток– это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды).

Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Обычно работа по получению новых клеточных линий продолжается несколько месяцев. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых культур клеток – результат генетической изменчивости клеток или селекции единичных клеток, присутствующих в первичной исходной культуре.

Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных клеток он диплоидный), стабильны в условиях роста in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство ограничивает использование перевиваемых культур клеток для культивирования вирусов при производстве вакцин.

Перевиваемые культуры клеток можно получать как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Среди них наиболее широко используют следующие линии клеток: HeLa (из раковой опухоли шейки матки женщины); Нер-2 (из карциономы гортани человека); KB (из раковой опухоли полости рта); ВНК-21 (почка новорожденного хомячка); ППЭС (перевиваемая почка эмбриона свиньи); ППТ (перевиваемая почка теленка); ППО (перевиваемая почка овцы); TR (из слизистой трахеи коровы); L (мышиные фибробласты); СОЦ (из сердца обезьяны циномольгус) и др.

Перевиваемые клетки имеют преимущества перед первичными: их приготовление значительно проще, экономятся труд и материальные средства; эти культуры заранее можно проверить на наличие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспечивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные, представляющие смешанную популяцию клеток. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры.

Однако перевиваемые клетки имеют и недостатки: они склонны к малигнизации, т. е. злокачественное перерождение независимо отпроисхождения и снижения чувствительности к вирусам у них происходит быстрее, чем у первичных, поэтому необходимо применять клональные линии перевиваемых клеток.

Поддерживают перевиваемые клетки путем периодических пересевов. Чаще используют бесцентрифужный метод. Для очередного пересева отбирают 2–3-дневную культуру с хорошим монослоем, сливают питательную среду, а клеточный монослой покрывают подогретым до 35-37 °С 0,02%-ным раствором версена. Диспергирующее действие версена объясняется связыванием им двухвалентных катионов (Mg ++ , Ca ++ ), которые способствуют прикреплению клеток к стеклу и обеспечивают целостность клеточной культуры. Под действием версена клетки округляются, отделяются от стекла.

Через 10–15 мин после округления клеток версен сливают, оставляя небольшое количество его (в 1-литровом матрасе – 5 –10 мл, в 0,1-литровом – 2–3 мл), и выдерживают еще 5–10 мин, периодически омывая клетки версеном, затем добавляют небольшое количество питательной среды. После встряхивания подсчитывают клетки в камере Горяева, исходную клеточную взвесь разводят ростовой питательной средой до необходимой концентрации (80–200 тыс. в 1 мл) и разливают при помешивании в пробирки или матрасы, закрывают резиновыми пробками и культивируют в термостате при 37 °С в течение 3–4 дней до образования сплошного монослоя. Обычно клетки в камере Горяева не подсчитывают, а пересевают с коэффициентом от 1:2 до 1:6 в зависимости от вида клеток. Состав питательной среды также зависит от вида клеток, но чаще при культивировании перевиваемых клеток используют среды Игла, 199 или смеси этих сред с гидролизатом лактальбумина.

Важно отметить, что при поддержании перевиваемых клеток путем их систематического пересева в лаборатории оставляют не менее одного матраса без пересева на случай непригодности последнего пассажа.

Диплоидные культуры клеток

Международный комитет по клеточным культурам дал следующее определение диплоидным клеткам: это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами роста, сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации хомячкам.

Диплоидные культуры клеток, так же как и перевиваемые, получают из первичных культур клеток. Кариотип клеток очень лабилен и при обычных методах культивирования клеток он изменяется в первые дни. Поэтому потребовались специальные методы обработки ткани, высокого качества питательные среды, фетальная сыворотка для длительного поддерживания клеток in vitro в диплоидном состоянии. Эту задачу впервые успешно решили американские ученые Хейфлик и Мурхед (1961).

Диплоидные клетки получены из различных тканей эмбриона человека (легкие, почки, кожно-мышечная ткань, сердце и др.) и животных (почка эмбриона крупного рогатого скота, свиней, ВНК-21 – почка хомяка и др.).

Диплоидные клетки в отличие от перевиваемых имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50±10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Однако диплоидные клетки могут быть использованы в течение длительного времени, так как при каждом пассаже часть клеток можно заморозить (минус 196 °С) и при необходимости восстановить.

Диплоидные клетки имеют преимущества перед перевиваемыми и первичными клетками: 10–12 дней они могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособны в течение 4 нед.; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам.

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.