Идентификация вируса гриппа а

Выявление вируса гриппа серотипов А и В (Influenza virus A/B), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) определяется генетический материал (РНК) вируса в образце биоматериала.

Синонимы английские

Influenza serotypes A/B, RNA [real-time polymerase chain reaction, RT-PCR, quantitative RT-PCR, qPCR, qRT-PCR].

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Мазок из зева (ротоглотки) и носа, мокроту.

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Рекомендуется употребить большой объем жидкости (воды) за 8-12 часов до сбора мокроты.
• Не принимать пищу, не пить и не полоскать горло в течение 2-3 часов до исследования.
• За 3-4 часа до взятия мазков из ротоглотки (зева) и носа не употреблять пищу, не пить, не чистить зубы, не полоскать рот/горло, не закапывать капли/спреи в нос, не жевать жевательную резинку, не курить. Взятие мазков оптимально выполнять утром, сразу после ночного сна.

Общая информация об исследовании

Influenza virus – это оболочечный вирус, характеризующийся наличием сегментированного негативного РНК-генома и нуклеокапсида в форме спирали. Он относится к семейству Orthomixoviridae. На основании структурных различий нуклеопротеида выделяют 3 серотипа Influenza: A, B и С. Серотип A встречается как людей, так и у животных, в то время как варианты B и C поражают преимущественно людей. Именно серотип А ответственен за подавляющее большинство случаев сезонных (эпидемических) и пандемических вспышек гриппа.

Идентификация вируса гриппа должна быть осуществлена в кратчайшие сроки, что связано с высокой заразностью этого заболевания. Кроме того, эффективность противовирусных препаратов максимальна при их назначении в первые 48 часов после инфицирования, что также диктует необходимость своевременной постановки окончательного диагноза. Среди многих "быстрых" диагностических тестов особое место занимает полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (РТ-ПЦР). Полимеразная цепная реакция в реальном времени (РТ-ПЦР) – это метод молекулярной диагностики, позволяющий выявлять в биологическом материале (например, в мокроте) фрагменты генетического материала (РНК) возбудителя инфекции. Благодаря высокой чувствительности и специфичности метода, а также возможности получить результат в наболее короткие сроки, РТ-ПЦР заменила другие, применяемые ранее, методы диагностики гриппа: выделение вируса в культуре клеток, а также серологические исследования и иммуноферментный анализ.

Многие прямые лабораторные тесты, разработанные для идентификации Influenza, основаны на выявлении белковых компонентов наружной оболочки вируса: гемагглютинина (H) и нейраминидазы (N). Эти белки являются основными факторами, определяющими степень болезнетворности вируса, а также используются для диагностики и классификации выявляемого вируса гриппа. Они обладают выраженной изменчивостью (известно 16 разновидностей N и 9 разновидностей H серотипа Influenza A) (чем вызваны ежегодные сезонные вспышки гриппа), а также создает определенные трудности при идентификации вируса гриппа с помощью этих методов. Структурное разнообразие антигенов H и N приводит к тому, что чувствительность большинства прямых лабораторных тестов (таких как прямая иммунофлюоресценция и ELISA) составляет около 65-75 %. Исследование РТ-ПЦР основано на выявлении консервативной последовательности ДНК, общей для разных штаммов вируса гриппа серотипов А и В, что обуславливает максимальную чувствительность этого теста (98-100 %).

В отличие от других тестов, чувствительность исследования РТ-ПЦР практически не изменяется при взятии материала на фоне начатой терапии противовирусными препаратами. Это связано с тем, что в реакции выявляется не сам вирусный агент, а фрагмент вирусной ДНК. По этой же причине положительный результат исследования не всегда указывает на наличие живого вируса (репликацию) и не всегда означает, что пациент остается заразным для окружающих.

В отличие от других лабораторных тестов (в первую очередь, экспресс-тестов для определения антигена вируса гриппа), результат РТ-ПЦР в меньшей степени зависит от распространенности гриппа среди населения. РТ-ПЦР характеризуется редкими ложноположительными и ложноотрицательными результатами как во время эпидемии, так и в период низкой заболеваемости гриппом.

Идентификация вируса гриппа с помощью РТ-ПЦР возможна в течение более длительного времени от начала заболевания по сравнению с большинством других тестов. Тем не менее взятие отделяемого носо/ротоглотки для исследования с помощью РТ-ПЦР должно быть произведено не позднее чем через 72-96 часов (оптимально в первые 48-72 часа). Это связано с тем, что интенсивная репликация Influenza при поражении верхних дыхательных путей происходит в течение первых 4 суток заболевания. У пациентов с вовлечением нижних отделов дыхательных путей вирусная нагрузка сохраняется высокой более длительный период. Исследование отделяемого носоглотки и мокроты дает лучшие результаты по сравнению с исследованием отделяемого ротоглотки.

При обследовании пациента с клиническими признаками Influenza-ассоциированной инфекции верхних дыхательных путей следует выполнить анализ отделяемого носо/ротоглотки. При обследовании пациента с признаками Influenza-ассоциированной инфекции нижних дыхательных путей анализ мазков из зева и носа необходимо дополнить исследованием мокроты. Исследование мокроты также должно быть осуществлено при отрицательном результате, который дал анализ отделяемого верхних дыхательных путей у пациента с клиническими признаками гриппа. Следует повторить РТ-ПЦР при отрицательном результате исследования мокроты у пациента с клиническими признаками Influenza-ассоциированной инфекции нижних дыхательных путей.

Для более точной диагностики Influenza рекомендуется сочетание РТ-ПЦР с дополнительными общеклиническими исследованиями. Кроме того, необходимо исключить бактериальную суперинфекцию.

Для чего используется исследование?

Когда назначается исследование?

• острой респираторной вирусной инфекции (внезапное острое начало болезни, лихорадка, боль в горле, боль в мышцах, головная боль, светобоязнь, сухой кашель, боль в грудной клетке, одышка);
• острой энцефалопатии в период эпидемии гриппа (судороги, атаксия, нарушение сознания).

Что означают результаты?

Референсные значения: отрицательно.

Причины положительного результата:

Причины отрицательного результата:

• отсутствие Influenza-ассоциированной инфекции.



• Положительный результат исследования не означает, что пациент остается заразным для окружающих.
• Анализ не позволяет выявлять Influenza серотипа С.

Кто назначает исследование?

Инфекционист, педиатр, врач общей практики, анестезиолог-реаниматолог.

Литература

• Kamps B. S, Hoffmann C, Preiser W. Influenza Report 2006 / B. S. Kamps, С. Hoffmann, W. Preiser W. – Flying Publisher, 2006.
• Wang R, Taubenberger JK. Methods for molecular surveillance of influenza. Expert Rev Anti Infect Ther. 2010 May;8(5):517-27.
• Schuchat A, Bell BP, Redd SC. The science behind preparing and responding to pandemic influenza: the lessons and limits of science. Clin Infect Dis. 2011 Jan 1;52 Suppl 1:S8-12.
• Pregliasco F, Mensi C, Camorali L, Anselmi G. Comparison of RT-PCR with other diagnostic assays for rapid detection of influenza viruses. J Med Virol. 1998 Oct;56(2):168-73.
• WHO Global Influenza Surveillance Network. Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza. – World Health Organization, 2011.

Грипп птиц (классическая чума птиц, экссудативный тиф, браун-швегейская болезнь кур и др.) — острая контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся общим угнетением, отеками, поражением органов дыхания и пищеварения.

Болезнь регистрируется в различных странах мира. В форме классической чумы птиц встречается редко. Чаше проявляется эпизоотическими вспышками в респираторной форме или с преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта.

Вирусы гриппа птиц выделены от кур, индюков, уток, перепелок, фазанов, глухарей, попугаев, цесарок и птиц других видов.

Характеристика возбудителя. Вирус относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Influenzavirus А. Вирионы плеоморфной (различной), чаще округлой формы, диаметром 80—120 нм. Состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, которая образует выступы. Геном представлен односпиральной линейной молекулой минус-РНК, состоящей из восьми фрагментов.

Устойчивость к физико-химическим воздействиям. При низких температурах и в лиофилизированном состоянии вирус сохраняется до двух лет. При температуре 55 °С инактивируется за 1 ч, при 60 °С — за 10 мин, при 65—75 °С — за 2—5 мин. Вирус утрачивает инфекционную активность под воздействием формальдегида, едких щелочей, слабых кислот, хлорсодержащих соединений.

Антигенная структура и активность. Вирионы вируса гриппа кур содержат внутренние антигены — NP, белки М, P1, Р2, Р3 и наружные антигены — гемагглютинин (Н) и нейраминидазу (N). Внутренние антигены индуцируют образование комплементсвязывающих и преципитирующих антител. Наружные антигены обладают гемагглютинирующей активностью и индуцируют нейтрализующие антитела, которые отвечают за напряженность противовирусного иммунитета.

Антигенная вариабельность и родство. Идентифицированы 15 субтипов гемагглютинина и 9 субтипов нейроминидазы с минимальной перекрестной активностью (между субтипами) в серологических реакциях. Внутри субтипа также могут быть вариации.

Антигенное родство изолятов устанавливают в РТГА (для определения сходства по гемагглютинину), в РТНА (для определения сходства по нейроминидазе), в РИД (для определения сходства по гемагглютинину и нейроминидазе).

Культивирование вируса. Все штаммы вируса гриппа птиц в лабораторных условиях размножаются в куриных эмбрионах при заражении в аллантоисную или амниотическую полость. Некоторые штаммы после адаптации размножаются в культурах клеток фибробластов куриного эмбриона, почки обезьян, легких эмбриона человека и других первичных культурах клеток (WI-38, миелобластоза цыплят). Некоторые штаммы образуют бляшки в первичной культуре клеток куриных фибробластов.

Гемагтлютинирующие и гемадсорбирующие свойства. Все вирусы гриппа птиц агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, кроликов, лошадей, овец и других животных. В отличие от вируса ньюкаслской болезни штаммы вируса гриппа птиц агглютинируют эритроциты лошади и овцы, что используется для дифференциации выделенных на эмбрионах штаммов вируса гриппа птиц от болезни Ньюкасла,

Гемадсорбирующие свойства проявляются с эритроцитами кур при культивировании вируса в культуре фибробластов куриных эмбрионов.

Экспериментальная инфекция. Она воспроизводится на курах и цыплятах при любом способе заражения субтипами вируса гриппа A (H7N1 и H5N3). Белые мыши заболевают при интраназальном и интрацеребральном заражениях. Экспериментальное заражение вирусами протекает бессимптомно. Экспериментальная инфекция у естественно-восприимчивой птицы зависит от вирулентности вируса, степени адаптации к биологической системе и сопутствующих инфекций.

Клинические признаки. Различные по вирулентности штаммы вируса вызывают разные формы клинического течения болезни. Для классической чумы птиц характерны депрессия, потеря чувствительности, синюшность слизистых и кожных покровов, отек подкожной клетчатки. Летальность может достигать 80 % и выше. При респираторной форме наблюдают сонливость, чихание, хрипы, одышку, выделения из носа и глаз, взъерошенность, отставание в развитии, снижение яйценоскости у взрослой птицы. Летальность в зависимости от вирулентности штамма, восприимчивости птицы, условий содержания может варьировать от 1 до 80 %. При желудочно-кишечной форме болезни основной клинический признак на фоне угнетения, отказа от корма и снижения яйценоскости — диарея. Гибель не превышает 5 %.

Встречается и бессимптомное течение (особенно среди домашних уток).

Патологоанатомические изменения. При вскрытии у птицы в зависимости от форм течения болезни могут наблюдаться кровоизлияния в паренхиматозных органах, скелетных мышцах, пищеварительном тракте, очаги некроза во внутренних органах и ЦНС. Штаммы, обладающие пневмотропным действием, вызывают катаральные воспаления в носовых ходах, синусах, трахеи, легких. В некоторых случаях обнаруживают катарально-геморрагические энтериты, нефриты.

Локализация вируса. Входными воротами для вируса служат в основном верхние дыхательные пути, где вирус проходит первичную репродукцию. Накапливаясь, проникает в кровеносную и лимфоидную системы, откуда вторично попадает в эпителиальные клетки дыхательных путей, паренхиматозные органы, головной мозг, кишечник, эндотелий сосудов (вторичная репродукция).

Источник инфекции — больная птица, которая передает вирус воздушно-капельным путем, а также алиментарным при инфицировании воды и корма фекалиями. Распространять вирус на большие расстояния могут дикие перелетные птицы (лебеди, утки, чайки и др.). В естественных условиях спектр патогенности не однороден и зависит от субтипа. Так, субтип H7N1 вызывает классическую чуму птиц чаще среди семейства куриных, и к нему менее восприимчивы водоплавающие птицы. Дикие утки являются не только переносчиками, но и резервуарами инфекции, вызывая сезонные заболевания среди болотных птиц. Штаммы вируса гриппа индейки патогенны для индеек и кур. Штаммы вируса гриппа кур патогенны для кур и перепелов.

Проблема межвидовой передачи между вирусами гриппа птиц, свиней и человека еще окончательно не разрешена. Дикие водоплавающие птицы являются резервуарами различных субтипов вируса. И в тех популяциях, где они находятся в тесном контакте с людьми, свиньями, могут образовываться за счет генной рекомбинации новые более патогенные штаммы вируса гриппа. Вирус гриппа с формулой H2N2 не выделяется от человека с 1968 г., но изолируется от птиц и в случае реверсии может стать эпидемическим.

Диагностика. Поставить диагноз на грипп птиц можно на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований, имеющих решающее значение.

Взятие и подготовка материала. В лабораторию отправляют патологический материал от больной птицы, взятый в первые 2—3 дня болезни при выраженной клинической картине, или от павшей птицы, или убитой с диагностической целью в острой стадии заболевания.

От больной птицы берут мазки из трахеи и клоаки стерильным ватно-марлевым или поролоновым тампоном, который помещают во флакон с 2 мл физиологического раствора (pH 7,0—7,2) или раствора Хенкса с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 500—1000 ЕД/мл) и доставляют в термосе со льдом. Для ретроспективной серодиагностики в начале болезни и в период выздоровления от больной птицы берут кровь на парные сыворотки. При этом сгусток крови, который остается от первой пробы крови, также отправляют для исследования в качестве вируссодержащего материала.

От павшей или убитой птицы берут кусочки селезенки, головного мозга, трахеи, легких, воздухоносные мешки, синусы, участки кишечника или отправляют свежие трупы (не менее двух-трех).

Лабораторная диагностика. Включает индикацию и выделение вируса, его идентификацию, а также ретроспективную диагностику.

Индикацию вируса проводят экспресс-методами, к которым относятся методы цитоскопии и простого флюрохромирования.

При цитоскопии в мазках-отпечатках со слизистых дыхательных путей, окрашенных одним из методов (по Романовскому, Пигаревскому, Быковскому), в цитоплазме клеток обнаруживают тельца-включения фиолетового (окраска по Романовскому) или ярко-красного (окраска по Пигаревскому, Быковскому) цвета.

Метод простого флюрохромирования позволяет обнаруживать в мазках-отпечатках, содержащих вирус гриппа (с применением раствора акридинового оранжевого 1:10 000), в люминесцентном микроскопе четко очерченные гранулы красного или оранжевого цвета, расположенные в цитоплазме клеток.

Выделение вируса проводят путем заражения куриных эмбрионов, культуры клеток, а также ставят биопробу на цыплятах.

Заражают 9—10-дневные куриные эмбрионы (не менее пяти на одну пробу), которым инокулируют исследуемую суспензию в амниотическую или аллантоисную полость общепринятым методом. Инкубируют яйца в течение 72 ч. Экстраэмбриональную жидкость каждого эмбриона на обнаружение вирусного гемагглютинина исследуют раздельно в капельной РГА с 1%-ной взвесью эритроците кур. При отрицательной РГА проводят еще 3—5 слепых пассажей, используя для заражения КЭ эмбриональную жидкость предыдущего пассажа. Проба считается отрицательной, если в 3—5 слепых пассажах не будет положительной РГА и патогенного действия вируса (гибель КЭ).

Культуру клеток заражают реже, чем КЭ. Для этого используют первичную культуру клеток куриных фибробластов. ЦПД обычно обнаруживают через 24—48 ч, хотя наибольший инфекционный титр вируса (10 5 —10 7 ЭИД₅₀/мл) наблюдается после 2—5 пассажей. Культуральную вируссодержащую жидкость исследуют в РГА и РГАд.

Биопробу на цыплятах проводят, если первые два метода выделения вируса требуют подтверждения. Инокулируют испытуемую суспензию 2—3-месячным цыплятам любым способом (подкожно, внутримышечно, на конъюнктиву и т. д.). Гибель наступает в зависимости от вирулентности и дозы вируса через 36—72 ч.

Идентификация вируса. РТГА — наиболее простой и высокодостоверный метод идентификации вируса. Реакцию проводят с диагностическим набором, содержащим 15 эталонных штаммспецифических сывороток. Для дифференциальной диагностики с болезнью Ньюкасла параллельно ставят реакцию с эталонной специфической сывороткой против болезни Ньюкасла.

РТГА ставят микро — или макрометодом по общепринятой методике. Сыворотки, используемые в реакции, освобождают от термолабильных ингибиторов, прогревая при 60 °С в течение 30 мин, от термостабильных ингибиторов, пропуская через специфическую сыворотку, CO₂ или добавляя кусочки сухого льда. РТГА считают положительной, если сыворотка полностью тормозит гемагглютинирующую активность выделенного вируса.

РТГАд ставят по общепринятой методике в культуре клеток куриных фибробластов. Используют набор эталонных штаммспецифических сывороток (предварительно освобожденных от ингибиторов) и эритроциты кур. Исследуемый вирус считается идентифицированным в РТГАд, если эталонная сыворотка блокирует гемадсорбцию.

РСК используют для определения родоспецифичности выделенного вируса, когда в РТГА не удается установить родственных связей между выделенным (эпизоотическим) и эталонным штаммами вируса гриппа по специфическим сывороткам к ним. В этом случае РСК ставят с эталонными специфическими сыворотками против вирусов гриппа родов А, В, С и устанавливают родовую принадлежность штамма.

PH применяют при некоторых неясных и спорных случаях, поэтому в диагностике используются редко.

РИФ относится к экспресс-методам диагностики. Используют прямой и непрямой варианты, для которых мазки-отпечатки готовят ex tempore от убитой больной или свежепавшей птицы и далее применяют соответственный вариант реакции по общепринятой методике.

К наиболее современным методам идентификации вируса гриппа птиц относится ИФА на основе моноклональных антител к гемагглютинину и внутренним вирусным белкам NP и М, а также ПЦР с двумя типами праймеров на основе неструктурного белка и гемагглютинина.

Ретроспективная диагностика. Основывается на обнаружении антигемагглютинирующих и комплементсвязывающих антител в парных сыворотках. Для этой цели используют серологические реакции.

РТГА. Парные сыворотки исследуют одновременно. Первую пробу хранят при 4 °С или в замороженном виде. Перед реакцией сыворотки освобождают от термолабильных и термостабильных ингибиторов. Реакцию проводят с диагностическим набором, содержащим 15 эталонных штаммов вируса.

Реакцию считают положительной, если титр антител во второй пробе не менее чем в 4 раза превышает титр антител к тому же субтипу вируса в первой пробе.

РСК ставят или с нативной внруссодержащей аллантоисной жидкостью, которую предварительно осветляют центрифугированием, или с диагностическим набором, содержащим эталонные вирусные антигены. Используют как классическую методику, так и микрометод в модификации В. В. Ритовой.

РРГ (реакцию радиального гемолиза) широко используют в настоящее время для иммунологического мониторинга в целях изучения иммунного фона и оценки поствакцинального иммунитета. При использовании эталонных вирусных антигенов удается получить четкие зоны радиального гемолиза с гомологичными антителами в исследуемых сыворотках.

ИФА проводят по твердофазному варианту, и в качестве антигена для сенсибилизации лунок диагностических планшет используют внутренний белок (NP) вируса гриппа А. Титры антител в ИФА в 5 и более раз выше, чем в РСК.

Дифференциальная диагностика. Грипп следует дифференцировать от ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита и ларинготрахеита, а также гемофилеза и миксоплазмоза.

Иммунитет и специфическая профилактика. Основная трудность профилактики гриппа заключается в изменчивости наружных белков вирусов, что приводит к ежегодному появлению новых циркулирующих эпизоотических штаммов, отличных от вакцинных. Поэтому ранняя, своевременная и эффективная диагностика новых штаммов — актуальная задача ветеринарии. Для этого используется радиоиммунный анализ (РИА).

Для профилактики гриппа птиц, вызываемого вирусом H7N1 (классическая чума птиц), применяют отечественные живые вакцины из аттенуированных штаммов Ру и Р5; для профилактики болезни, вызываемой подтипами H1—Н8, отечественные биофабрики выпускают инактивированную β-пропиолактоновую гидроокисьалюминиевую вакцину. За рубежом применяют живую нейраминидазо-N-специфическую вакцину (Англия), масляноэмульсионную вакцину для цыплят-броллеров и кур-несушек (США). Разработан метод получения рекомбинантного вируса гриппа птиц, экспрессирующего вирусные белки, что может использоваться в качестве живой вакцины для домашней птицы.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Грипп - одно из самых распространенных в мире заболеваний. Вирус гриппа можно идентифицировать с помощью тестов на реакцию антител, но они нуждаются в регулярном обновлении, так как возбудитель быстро мутирует, образуя новые штаммы.

Вирус гриппа - частая причина возникновения заболеваний дыхательных путей, приводящих к значительной нетрудоспособности и смертности в мировом масштабе. Возбудитель передается воздушно-капельным путем. Симптомы варьируют от легкого респираторного заболевания у здоровых людей, которые поправляются после нескольких дней соблюдения постельного режима, до тяжелых состояний, требующих госпитализации. У лиц, принадлежащих к группам риска, может развиться жизнеугрожающая первичная вирусная или вторичная бактериальная пневмония. Особенно уязвимы маленькие дети, старики и люди, страдающие другими сердечно-легочными заболеваниями.

Распространенность

По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно гриппом болеют от 5 до 15% населения. Точных данных на этот счет нет, поскольку природный резервуар вируса - страны Юго-Восточной Азии, во многих из которых статистический учет находится на невысоком уровне.

Если выражать это в абсолютных цифрах, то число случаев гриппа оценивается в 3-5 млн в год, от 250 до 500 тыс. заболевших умирают.

Идентификация вируса гриппа

Врач обычно диагностирует грипп, основываясь на типичных симптомах, к которым относятся лихорадка, озноб, головная и мышечная боль, кашель.

Специфические тесты дороги и занимают много времени, поэтому они обычно используются только для идентификации вируса при вспышке заболевания.

Для выявления специфических антигенов вируса в клинических пробах существует множество методов, в частности твердофазный имму-ноферментный анализ (тИФА, или ELISA). Для проведения теста образец носовой слизи наносится на твердый носитель, адсорбирующий антигены. Затем добавляются специфические антитела к вирусам гриппа, связанные со специфическими реагентами, которые вызывают окрашивание поверхности сорбента только в том случае, если в образце присутствуют соответствующие антигены. Другие тесты позволяют выявить пораженные вирусом клетки или обнаружить участки генов вируса.

Как вирус изменяется со временем

За изменчивость отвечают два типа белков на поверхности вируса - гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA).

Гемагглютинин присоединяет вирус к клетке-носителю, в то время как нейраминидаза разрушает это присоединение, позволяя вирусу перемещаться от клетки к клетке. Оба белка являются антигенными - то есть организм при инфицировании вирусом производит к ним антитела.

Эпидемии мирового масштаба или пандемии гриппа возникают через большие промежутки времени. Пандемии становятся следствием радикальных изменений, возникающих, когда гены различных типов вирусов гриппа А смешиваются в одной клетке носителя.

В результате этого смешения появляется новый вирус гриппа с другим объединением поверхностных протеинов, против которого существующие антитела неэффективны.

Анализ данных наблюдений

Так как вирус гриппа непрерывно изменяется, важно отслеживать антигенную структуру циркулирующих штаммов. Мониторинг проводится в специализированных лабораториях, которые принимают образцы мокроты от больных гриппом, посланные из клинических лабораторий. Для получения необходимых количеств, пригодных для анализа, вирусы первоначально размножают в клеточной культуре или яичном белке.

Тип гемагглютинина определяют, используя реакцию торможения гемагглютинации.

При этом анализе жидкость, содержащая вирус, добавляется к различным антителам, специфичным к определенным типам НА, включая тот тип вируса, который циркулировал предыдущей зимой, и тот, против которого проводится вакцинация в этом году. Также добавляются эритроциты. Если тип НА не распознан антителами, красные кровяные клетки прилипают к НА-шипам вирусов (гемагглютинация).

Это означает, что исследуемый вирус содержит измененный гемагглютинин. Другие тесты используются для анализа ежегодных изменений в гене, кодирующем НА-белок определенных типов вирусов гриппа.

Количество и типы вирусов гриппа, циркулирующих в популяции, детально отслеживаются от начала октября до конца июня следующего года в Северном полушарии. Уровень заболеваемости, связанной с гриппозной инфекцией, определяется измерением различных величин, таких как количество консультаций врачей общей практики по поводу гриппоподобных заболеваний, уровень заболеваемости школьников, потребность в больничных койках и еженедельный уровень смертности от респираторных заболеваний. Все это анализируется совместно с информацией об антигенной структуре вирусов гриппа, выделенных в лабораториях. Целью анализа является как можно более ранняя идентификация начала активности гриппа, чтобы этот вирус мог быть проанализирован и сравнен с вирусами предыдущей зимы и тем штаммом, который был использован для имеющейся вакцины.

Производство вакцины

Каждую зиму циркулируют различные типы вирусов гриппа, поэтому ежегодно приходится создавать новую вакцину.

Она обычно содержит три компонента: два подвида гриппа А и один - гриппа В.

Дважды в год (в феврале и сентябре) Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) выпускает рекомендации, какие штаммы использовать в производстве вакцин для Северного и Южного полушария. Информация о том, какой штамм будет доминировать в течение зимы, и данные, указывающие на возможность возникновения новых разновидностей, тщательно анализируются. Это необходимо для достижения максимального соответствия между вакцинальным и циркулирующим штаммами, от которого зависит эффективность вакцины. Для подготовки и тестирования новой вакцины может понадобиться от 6 до 9 месяцев. Вирусы для создания противогриппозной вакцины первоначально выращиваются в яичном белке, затем, перед тем как превратить в вакцину, их убивают и очищают. Несмотря на то что некоторые медики советуют не прививаться от гриппа без крайней необходимости, вакцинация остается главным средством предупреждения эпидемий.

Медицинский эксперт статьи

Вирус гриппа А - вирион, который имеет сферическую форму и диаметр 80-120 нм, его молекулярная масса 250 МД. Геном вируса представлен однонитевой фрагментированной (8 фрагментов) негативной РНК с общей м. м. 5 МД. Тип симметрии нуклеокапсида спиральный. Вирус гриппа имеет суперкапсид (мембрану), содержащий два гликопротеида - гемагглютинин и нейраминидазу, которые выступают над мембраной в виде различных шипов. Гемагглютинин имеет структуру тримера с м. м. 225 кД; м. м. каждого мономера 75 кД. Мономер состоит из меньшей субъединицы с м. м. 25 кД (НА2) и большей - с м. м. 50 кД (НА1).

Основные функции гемагглютинина:

• распознает клеточный рецептор - мукопептид, имеющий N-ацетилнейрами-новую (сиаловую) кислоту;
• обеспечивает слияние мембраны вириона с мембраной клетки и мембранами ее лизосом, т. е. отвечает за проникновение вириона в клетку;
• определяет пандемичность вируса (смена гемагглютинина - причина пандемий, его изменчивость - эпидемий гриппа);
• обладает наибольшими протективными свойствами, отвечая за формирование иммунитета.

У вирусов гриппа А человека, млекопитающих и птиц обнаружено 13 различающихся по антигену типов гемагглютинина, которым присвоена сквозная нумерация (отН1доН13).

Нейраминидаза (N) является тетрамером с м. м. 200-250 кД, каждый мономер имеет м. м. 50-60 кД. Ее функции:

• обеспечение диссеминации вирионов путем отщепления нейраминовой кислоты от вновь синтезированных вирионов и мембраны клетки;
• совместно с гемагглютинином определение пандемических и эпидемических свойств вируса.

У вируса гриппа А обнаружено 10 различных вариантов нейраминидазы (N1-N10).

Нуклеокапсид вириона состоит из 8 фрагментов вРНК и капсидных белков, образующих спиралевидный тяж. На З'-концах всех 8 фрагментов вРНК имеются одинаковые последовательности из 12 нуклеотидов. 5'-концы каждого фрагмента также имеют одинаковые последовательности из 13 нуклеотидов. 5'- и 3'-концы частично комплементарны друг другу. Это обстоятельство, очевидно, позволяет осуществлять регуляцию транскрипции и репликации фрагментов. Каждый из фрагментов транскрибируется и реплицируется самостоятельно. С каждым из них прочно связаны четыре капсидных белка: нуклеопротеид (NP), он выполняет структурную и регуляторную роль; белок РВ1 - транскриптаза; РВ2 - эндонуклеаза и РА - репликаза. Белки РВ1 и РВ2 обладают основными (щелочными) свойствами, а РА - кислотными. Белки РВ1, РВ2 и РА образуют полимер. Нуклеокапсид окружен матриксным белком (М1-белком), который играет ведущую роль в морфогенезе вириона и защищает вирионную РНК. Белки М2 (кодирует одна из рамок считывания 7-го фрагмента), NS1 и NS2 (кодируются восьмым фрагментом вРНК, который имеет, как и седьмой фрагмент вРНК, две рамки считывания) синтезируются в ходе репродукции вируса, но в его структуру не входят.

[1], [2], [3], [4], [5]

Жизненный цикл вируса гриппа А

Вирус гриппа абсорбируется на мембране клетки происходит благодаря взаимодействию его гемагглютинина с мукопептидом. Затем вирус проникает в клетку с помощью одного из двух механизмов:

• слияние мембраны вириона с мембраной клетки или
• по пути окаймленная ямка - окаймленный пузырек - эндосома - лизосома - слияние мембраны вириона с мембраной лизосомы - выход нуклеокапсида в цитозоль клетки.

Второй этап "раздевания" вириона (разрушение матриксного белка) происходит на пути к ядру. Особенность жизненного цикла вируса гриппа заключается в том, что для транскрипции его вРНК необходима затравка. Дело в том, что вирус не может сам синтезировать "шапочку", или кэп (англ. cap) - особый участок на 5'-конце мРНК, состоящий из метилированного гуанина и 10- 13 прилежащих нуклеотидов, который необходим для распознавания мРНК рибосомой. Поэтому он с помощью своего белка РВ2 откусывает шапочку от клеточной мРНК, а так как синтез мРНК в клетках происходит только в ядре, вирусная РНК должна обязательно проникнуть сначала в ядро. Она проникает в него в виде рибонуклеопротеида, состоящего из 8 фрагментов РНК, связанных с белками NP, PB1, РВ2 и РА. Теперь жизнь клетки полностью подчиняется интересам вируса, его репродукции.

В ядре на вРНК синтезируются три типа вирус-специфических РНК: 1) позитивные комплементарные РНК (мРНК), используемые в качестве матриц для синтеза вирусных белков; они содержат на 5'-конце шапочку, отщепленную от 5'-конца клеточной мРНК, а на З'-конце - поли-А-последовательность; 2) полноразмерная комплементарная РНК (кРНК), которая служит матрицей Для синтеза вирионных РНК (вРНК); на 5'-конце кРНК шапочки нет, на З'-конце отсутствует поли-А-последовательность; 3) негативная вирионная РНК (вРНК), являющаяся геномом для вновь синтезированных вирионов.

Немедленно, еще до завершения синтеза, вРНК и кРНК вступают в ассоциацию с капсидными белками, которые поступают в ядро из цитозоля. Однако в состав вирионов включаются только рибонуклеопротеиды, связанные с вРНК. Рибонуклеопротеиды, содержащие кРНК, не только не попадают в состав вирионов, но даже не покидают ядро клетки. Вирусные мРНК поступают в цитозоль, где и транслируются. Вновь синтезированные молекулы вРНК после ассоциации с капсидными белками мигрируют из ядра в цитозоль.

[6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]

Белки NP, PB1, РВ2, РА и М синтезируются на свободных полирибосомах. Белки NP, PB1, РВ2 и РА после синтеза из цитозоля возвращаются в ядро, где и связываются с вновь синтезированной вРНК, а затем в виде нуклеокапсида возвращаются в цитозоль. Белок матриксный после синтеза движется к внутренней поверхности клеточной мембраны, вытесняя из нее в этом участке клеточные белки. Белки Н и N синтезируются на рибосомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума, транспортируются по ним, подвергаясь гликозилированию, и устанавливаются на внешней поверхности клеточной мембраны, образуя шипы как раз напротив белка М, расположенного на ее внутренней поверхности. Белок Н подвергается в ходе процессинга разрезанию на НА1 и НА2.

Заключительный этап морфогенеза вириона контролируется М-белком. С ним взаимодействует нуклеокапсид; он, проходя через мембрану клетки, покрывается вначале М-белком, а затем клеточным липидным слоем и суперкапсидными гликопротеидами Н и N. Жизненный цикл вируса занимает 6-8 ч и завершается отпочковыванием вновь синтезированных вирионов, которые способны атаковать другие клетки ткани.

Устойчивость вируса во внешней среде невелика. Он легко разрушается при нагревании (при 56 °С в течение 5-10 мин), под действием солнечного и УФ-света и легко обезвреживается дезинфицирующими веществами.

[14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23]

Патогенез и симптомы гриппа А

Инкубационный период при гриппе короткий - 1-2 сут. Вирус размножается в эпителиальных клетках слизистой оболочки дыхательных путей с преимущественной локализацией в области трахеи, что клинически проявляется в виде сухого мучительного кашля с болями по ходу трахеи. Продукты распада пораженных клеток попадают в кровь, вызывают сильную интоксикацию и повышение температуры тела до 38-39 °С. Повышение проницаемости сосудов, обусловленное повреждением клеток эндотелия, может стать причиной патологических изменений в различных органах: точечных кровоизлияний в трахее, бронхах, а иногда и отека мозга с летальным исходом. Вирус гриппа оказывает угнетающее действие на кроветворение и иммунную систему. Все это может приводить к вторичным вирусным и бактериальным инфекциям, которые осложняют течение болезни.

Постинфекционный иммунитет

Прежние представления о том, что после перенесенного гриппа остается слабый и кратковременный иммунитет, опровергнуты после возвращения вируса H1N1 в 1977 г. Этот вирус вызывал заболевание главным образом у людей не старше 20 лет, т. е. у тех, кто не болел им раньше, до 1957 г. Следовательно, постинфекционный иммунитет достаточно напряженный и продолжительный, но имеет выраженный типоспецифический характер.

Главная роль в формировании приобретенного иммунитета принадлежит вирус-нейтрализующим антителам, блокирующим гемагглютинин и нейраминидазу, а также секреторным иммуноглобулинам IgAs.

Эпидемиология гриппа А

Источник инфекции - человек, больной или носитель, редко животные (домашние и дикие птицы, свиньи). Заражение от людей происходит воздушно-капельным путем, инкубационный период очень короткий (1-2 сут.), поэтому эпидемия распространяется очень быстро и может при отсутствии коллективного иммунитета перерасти в пандемию. Иммунитет - основной регулятор эпидемий гриппа. По мере нарастания коллективного иммунитета эпидемия идет на убыль. Вместе с тем вследствие формирования иммунитета происходит отбор штаммов вируса с измененной антигенной структурой, прежде всего гемагглютинина и нейраминидазы; эти вирусы продолжают вызывать вспышки до тех пор, пока и к ним не появятся антитела. Такой антигенный дрейф и поддерживает непрерываемость эпидемии. Однако у вируса гриппа А обнаружена еще одна форма изменчивости, получившая название шифта, или сдвига. Она связана с полной сменой одного типа гемагглютинина (реже - и нейраминидазы) на другой.

Все пандемии гриппа были вызваны вирусами гриппа А, претерпевшими шифт. Пандемия 1918 г. была вызвана вирусом с фенотипом H1N1 (погибло около 20 млн человек), пандемия 1957 г. - вирусом h3N2 (переболело более половины населения мира), 1968 г. - вирусом H3N2.

Для объяснения причин резкой смены типов вирусов гриппа А предложены две основные гипотезы. Согласно гипотезе А. А. Смородинцева, вирус, исчерпавший свои эпидемические возможности, не исчезает, а продолжает циркулировать в коллективе без заметных вспышек или длительно персистировать в организме человека. Через 10-20 лет, когда появится новое поколение людей, не имеющих иммунитета к этому вирусу, он становится причиной новых эпидемий. В пользу этой гипотезы говорит тот факт, что вирус гриппа А с фенотипом H1N1, исчезнувший в 1957 г., когда его вытеснил вирус h3N2, вновь появился после 20-летнего отсутствия в 1977 г.

По другой гипотезе, развиваемой и поддерживаемой многими авторами, новые типы вируса гриппа А возникают вследствие реассоциации геномов между вирусами гриппа человека и птиц, между вирусами гриппа птиц, между вирусами гриппа птиц и млекопитающих (свиньи), чему способствует сегментарная структура вирусного генома (8 фрагментов).

Таким образом, у вируса гриппа А есть два пути изменения генома.

Точечные мутации, обусловливающие антигенный дрейф. Им подвержены, прежде всего, гены гемагглютинина и нейраминидазы, особенно у вируса H3N2. Благодаря этому вирус H3N2 за период с 1982 по 1998 г. вызвал 8 эпидемий и сохраняет эпидемическое значение до сих пор.

Реассоциация генов между вирусами гриппа человека и вирусами гриппа птиц и свиней. Считается, что именно реассоциация геномов вирусов гриппа А с геномами вируса гриппа птиц и свиней - главная причина возникновения пандемических вариантов этого вируса. Антигенный дрейф позволяет вирусу преодолевать существующий у людей иммунитет. Антигенный шифт создает новую эпидемическую ситуацию: к новому вирусу у большинства людей иммунитета нет, и возникает пандемия гриппа. Возможность такой реассоциации геномов вирусов гриппа А доказана экспериментально.

Установлено, что эпидемии гриппа у людей вызывают вирусы типа А только 3 или 4 фенотипов: H1N1 (H0N1); h3N2; H3N2.

Однако существенную угрозу для человека предсталяет и куриный (птичий) вирус. Вспышки куриного гриппа наблюдались неоднократно, в частности куриный вирус H5N1 вызвал миллионную эпизоотию среди домашних и диких птиц с 80- 90 %-ной летальностью. От кур заражались и люди; так в 1997 г. от кур заразилось 18 человек, треть из них погибла. Особенно крупная вспышка наблюдалась в январе-марте 2004 г. Она охватила почти все страны Юго-Восточной Азии и один из штатов США и нанесла огромный экономический ущерб. От кур заразилось и погибло 22 человека. Для ликвидации этой вспышки были предприняты самые жесткие и решительные меры: строгий карантин, ликвидация всего поголовья птиц во всех очагах, госпитализация и изоляция больных и всех людей с повышенной температурой, а также лиц, находившихся в контакте с больными, запрет импорта куриного мяса из указанных выше стран, строгий медицинский и ветеринарный надзор за всеми пассажирами и транспортными средствами, прибывающими из этих стран. Широкого распространения гриппа среди людей не произошло потому, что не было реассоциации генома вируса куриного гриппа с геномом вируса гриппа человека. Однако опасность такой реассоциации остается реальной. Это может привести к появлению нового опасного пандемического вируса гриппа человека.

В названии выявляемых штаммов вирусов гриппа указывают серотип вируса (А, В, С), вид хозяина (если им не является человек), место выделения, номер штамма, год его выделения (последние 2 цифры) и фенотип (в круглых скобках). Например: "А/Сингапур/1/57 (h3N2), А/утка/СССР/695/76 (H3N2)".

[24], [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32], [33], [34]