Инфицирующая доза d50 для вирусов
Этот метод более универсален. Количество вируса (титр вируса) при этом измеряется в эффективной 50% дозе – ЭД50.
1 ЭД50 = доза вируса, способная вызывать инфекционный эффект у 50% зараженных тест-объектов.
Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект - лабораторные животные (обычно белые мыши), куриные эмбрионы или культура клеток. Инфекционный эффект или действие вируса на разных тест-системах может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. У лабораторных животных и куриных эмбрионов действие вируса оценивается в летальной и инфекционной дозах:
1 ЛД50 - доза вируса, убивающая 50% лабораторных животных;
I ЭЛД50 - доза вируса, убивающая 50% куриных эмбрионов;
1 ИД50 - доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50% зараженных лабораторных животных;
1 ЭИД50 - доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50% зараженных куриных эмбрионов.
В культуре клеток действие вируса оценивается по цитопатическому эффекту или действию (ЦПД):
1 ЦПД50 - доза вируса, вызывающая цитопатический эффект в 50% пробирок с зараженной культурой клеток.
Количество ЭД50 (ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50 и ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, будет выражением титра вируса в этом материале. Так, запись Т = 103.48 ЦПД50/0,1 мл означает, что в каждом 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 103.48 доз, каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50% пробирок с культурой клеток.
Метод титрования вирусов по 50% инфекционному действию пригоден для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую тест-систему. Недостатком является трудоемкость, длительность и необходимость статистического расчета.
Методика определения титра вируса в единицах 50% инфекционного действия (ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50 и ЦПД50) заключается в том, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала. Это и будет титр вируса. Для этого:
1) из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. Количество разведений необходимо делать больше (т.е. столько, чтобы последнее наиболее высокое уже не давало инфекционного эффекта совсем). Для 10 последовательных разведений в каждую из 10 стерильных пробирок наливают по 9 мл стерильного физиологического раствора, а затем в первую вносят ровно 1 мл исследуемой суспензии. Перемешивают содержимое первой пробирки, набирают 1 мл смеси и вносят во вторую пробирку, перемешивают содержимое и 1 мл из второй пробирки - в третью, и т. д,
2) одинаковыми объемами каждого разведения вируссодержащего материала заражают чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов. В каждой их группе требуется не менее 4-6 тест-объектов (для статистической достоверности);
3) по истечении времени учитывают результат действия вируса на зараженные объекты (гибель, заболевание, патологоанатомические изменения или цитопатический эффект). Гибель лабораторных животных, КЭ впервые 48 часов считают неспецифической. Учет заканчивают через 2 -3 суток после прекращения падежа;
4) определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Действие вируса определяют в ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50 и ЦПД50. Считают, что доза в этом разведении соответствует 1 ЭД50. Дозу вируса подсчитывают различными методами (по Риду и Менчу, Керберу).
Для проведения титрования из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных десятикратных разведений от 1:10, т.е. 10 -1 до 1:10.000.000, т. е. 10 -7 , и более (10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 и т.д.). Количество разведений зависит от предполагаемого титра вируса, их нужно готовить столько, чтобы последнее (наиболее высокое) разведение уже не давало бы инфекционного эффекта. Инфекционное действие вируса (величина инфекционного эффекта) с каждым разведением убывает пропорционально логарифму разведения (или дозы). То есть при разведении 1:100 (10 -2 ) инфекционное действие уменьшается в два раза, если 1:1000 (10 -3 ) в три раза и т. д.
Каждым разведением исследуемого вируссодержащего материала в определенном одинаковом объеме заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (лабораторных животных, куриные эмбрионы, культуры тканей). При этом учитывают тропизм и дозы вируса, общепринятые для данного способа введения материала. В каждой группе должно быть не менее 4-6 тест-объектов, т. к. при меньшем количестве статистическая обработка материала будет иметь слишком большую погрешность.
Однако, при определении титра вируса очень трудно подобрать такие разведения, чтобы одно из них в точности вызывало бы гибель 50% зараженных животных. Часто при титровании количество живых и павших животных бывает неравным. В этом случае для более точного определения титра широко используют в вирусологии метод, предложенный Ридом и Менчем. Они рекомендуют при титровании брать в опыт большое количество групп по 4-6 чувствительных моделей в каждой группе. Отклонение от истинной величины ЛД50, обусловленное применением малого количества подопытных животных в группе, исправляется тем, что при исчислении процента летальности оперируют данными кумулятивной летальности (кумуляция - накопление).
Метод Рида и Менча основан на логической предпосылке о том, что животные (и другие модели), погибшие при заражении каким-либо разведением вируса, например 10 -5 , погибнут и при заражении более низким разведением (10 -4 , 10 -3 ) вируса. Если же животное не пало при данном разведении, то останется живым и при заражении более высоким разведением (10 -6 , 10 -7 ). На этом основании полученные результаты подвергают интерполяции и выражают их в виде кумулятивных данных, на основании которых рассчитывают % летальности.
При вычислении кумулятивных данных мышей, павших от более высокого разведения, прибавляют к числу погибших от более низкого разведения. Мышей, оставшихся живыми от более низкого разведения, прибавляют к числу животных, не погибших от более высокого разведения (направление показано стрелкой). После получения кумулятивных данных определяют % летальности. Процент летальности для каждого разведения вычисляют по формуле:
%летальности = Кол-во павших (кумулятивные данные)/Кол-во зараженных (кумулятивные данные) х 100
Разведения, при которых % летальности приближаются к 50%, называют высшей и низшей критической дозой.
ЛД50 определяют по формуле:
,
где ЛД50 - искомое разведения вируса; В - разведение, вызывающее гибель более 50% животных; b - процент летальности, соответствующий разведению В; а - процент летальности, соответствующий разведению, дающему гибель менее 50% животных; d - коэффициент разведения.
Титр вируса, выраженный числом с дробным показателем степени, обычно в таком виде и оставляют. Его можно легко превратить и в абсолютную величину с помощью таблицы антилогарифмов (4-х значные математические таблицы Брадиса). По таблице антилогарифмов находят абсолютное значение разведения, соответствующее 1 ЛД50.
Дата добавления: 2014-12-17 ; просмотров: 8056 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ
Титр – это количество вируса, содержащегося в единице объема материала. Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки и оспины на ХАО КЭ. Если имеются данные обратные то инфекционная активность вируса может быть измерена в бляшкообразующих единицах (БОЕ) или оспообразующих единицах (ООЕ) 1БОЕ = дозе вируса, способной вызвать образование одной бляшки, а одна ООЕ – одной оспины. Методы: заражают несколько КК или КЭ на ХАО. Высчитывают среднеарифметическое количество оспин или бляшек. Оно = БОЕ или ООЕ вируса. Рассчитывают сколько БОЕ или ООЕ приходится на единицу объема вируссодержащего материала. Это и есть титр. Т=n/Va, где n-сред арифметическое бляшек или оспин, а –разведение материала, V – введенная доза. Метод 50%-ного инфекционного действия. За единицу количества вируса принимается доза, которая способна вызвать инфекционный эффект у 50% зараженных. Число таких доз в единице материала и будет выражать титр вируса в этом материале. Готовят 10 кратное разведение исследуемого материала, затем одинаковыми дозами заражают равные группы живых тест объектов. Учитывают результат действия и находят в каком разведение вирус проявил свое действие на 50%. Если сразу такое разведение не найдено то оно рассчитывается по формуле Т=lgB – (b-50)/(b-a) *lgd, где В – разведение дающие инфекционный эффект более 50%, b – процент дающий инфекционный эффект более 50%, а – менее 50% d – кратность разведения. За 1ГАЕ принимается такая доза вируса, которая способна агглютинировать примерно 50% эритроцитов содержащихся в том же, что и вирус объеме 1% суспензии отмытых эритроцитов. Готовят ряд последовательных кратных разведений материала и к каждому разведению добавляют 1% суспензию. Реакция оценивается в крестах. Реакция с 2 крестами содержит 1ГАЕ, которая умножается на кратность разведения.
Титр вируса — это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. п.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие.
Размерность этих единиц зивисит от соотношения полноценных и неполноценных вирионов в используемой суспензии, объекта, способа титрования и других факторов. В практике нашли применение три типа единиц количества вируса: 1-й — инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту; 2-й — инфекционные единицы 50%-ного действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически; 3-й — гемагглютинирующие единицы.
Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки в зараженных культурах клеток (островки мертвых клеток в слое живых) и оспины (некротические узелки) на ХАО куриных эмбрионов, зараженных оспенными и некоторыми другими вирусами. В случаях такого проявления инфекционной активности вирусов количество вируса может быть измерено в бляшкообразующих единицах (БОЕ) или оспообразующих единицах (ООЕ). Одна БОЕ равна дозе вируса, способной вызвать образование одной бляшки, а одна ООЕ — одной оспины.
Наиболее универсален метод определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50 % зараженных тест-объектов. Она обозначается как ЭД50— эффективная 50%-ная доза. Число таких доз вируса в единице объема материала и будет выражать титр вируса в этом материале.
Виды единиц количества вирусов при определении по 50%-ному инфекционному действию
| Тест-объекты | Виды инфекционного действия вирусов | Единицы количества вирусов | |
| названия единиц | сокращение обозначения | ||
| Лабораторные | Гибель | 50%-ная летальная | ЛД50 |
| животные | доза | ||
| То же | Клинические симп- | 50%-ная инфекци- | ИД50 |
| томы или патоло- | онная доза | ||
| гоанатомические | |||
| изменения | |||
| Куриные эмбри- | Гибель | 50%-ная эмбриональ- | элд50 |
| оны | ная летальная | ||
| доза | |||
| То же | Патологоанатоми- | 50%-ная эмбриональ- | эид50 |
| ческие изменения | ная инфекционная | ||
| доза | |||
| Культуры клеток | Цитопатический | 50%-ная цитопати- | ЦПД50 |
| эффект | ческая доза |
В качестве тест-объектов в лабораториях обычно используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфекционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест-объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД50 принимает один из следующих видов, приведенных в таблице 6.
1 ЛД50—это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);
1 ИД50—доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;
1 ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;
1 ЭИД50—доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;
1 ЦПД50— доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток).
Количество ЭД50 (ЛД50, ИД ЭЛД50, ЭИД50 или ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=10 3,48 ЦПД50/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 10 3 ' 48 доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 10 3,48 =3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.
Названные единицы 50%-ного инфекционного действия вируса (ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) используются в случаях оценки инфекционного действия вируса со статистически оцениваемым эффектом, имеющим место, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клиническим симптомам, патологоанатомическим изменениям или цитопатическому действию.
Титрование вирусов по 50%-ному инфекционному действию — наиболее универсальный прием, пригодный для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую систему (текст-объект). Однако этот метод титрования вирусов довольно трудоемкий, длительный и требует статистических расчетов.
Задача определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия (ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) сводится к тому, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра вируса в этом материале.
Чтобы решить эту задачу, сначала из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. 10-кратные разведения берут по двум причинам:
во-первых, как видно из графика зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса (рис. 35), кривая этой зависимости вблизи точки, соответствующей ЭД50, на значительном отрезке приближается к прямой.
Рисунок 35. График зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса
Это означает, что в определенных пределах, центр которых в точке ЭД50, между логарифмом дозы (разведения) вируса и инфекционным эффектом существует прямолинейная зависимость, т. е. величина инфекционного эффекта пропорциональна логарифму дозы вируса (или его разведения), в области малых и особенно больших доз эта зависимость нарушается;
во-вторых, при 10-кратном разведении облегчаются последующие расчеты.
Одинаковыми объемами каждого из 10-кратных разведений исследуемого вируссодержащего материала заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (мышей, куриных эмбрионов или культур клеток). При этом в каждой группе должно быть не менее 4—6 тест-объектов, так как при меньшем количестве статистически рассчитываемая величина титра вируса будет иметь слишком большую погрешность (статистическая величина тем точнее, чем на большем количестве исходных данных она основана).
После заражения учитывают результат действия вируса (гибель, клинические симптомы, патологоанатомические изменения или ЦПЭ) на зараженные объекты и определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Разведение, дающее 50%-ный эффект, рассчитывают методом прямолинейной интерполяции. Когда такое разведение нашли, то считают, что в заражающем объеме вируса, разведенного в найденное (соответствующее 50%-ному эффекту) число раз, содержится 1 ЭД50. В таком же объеме исходного (неразведенного) вируссодержащего материала таких доз (ЭД50) содержится больше во столько раз, во сколько был разведен материал, давший 1 ЭД50. Затем пересчитывают, сколько таких единиц 50%-ного инфекционного действия вируса содержится в единице объема (мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в данном материале.
Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.
Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).
Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.
Эксперты рассказали об инфицирующей дозе коронавируса. Проще говоря, человеческий организм должен столкнуться с определенным количеством вирусных частиц, чтобы заразиться COVID-19. Отмечается, что существует целый ряд факторов, определяющих для того или иного человека минимальную дозу. Разбираемся, какие условия необходимы для ее достижения.
"Эффективная" доза
Фото: Москва 24/Антон Великжанин
Врач и телеведущий Евгений Комаровский рассказал, что у коронавируса есть так называемая инфицирующая доза. Речь идет о минимальном количестве вирусных частиц, которые точно заразят человека, если попадут ему на слизистые оболочки. По словам специалиста, "успешность" контакта вируса с потенциальным носителем зависит от целого набора факторов.
В частности, встречался ли организм с инфекцией прежде, при каких обстоятельствах это произошло в тот или иной раз и так далее. Комаровский пояснил, что в случае с COVID-19 людям достаточно небольшой инфицирующей дозы, чтобы заболеть, поскольку до настоящего момента человечество никогда не сталкивалось с коронавирусом нового типа.
Ранее немецкие ученые сообщили, что заражение SARS-CoV-2 с наибольшей вероятностью происходит при вдыхании капель с инфекцией во время тесного общения с больным. А вот риск заболеть после контакта с предметами крайне мал, предполагают специалисты.
"Когда мы брали образцы с дверных ручек, телефонов или туалетов, то не смогли на их основе культивировать вирус в лаборатории", – пояснил один из авторов исследования Хендрик Штреек.
Тем не менее заражение возможно, хоть и не очень распространено таким способом. Например, если пациент с COVID-19 кашлянет в руку, затем дотронется ею до какого-то предмета, а следом за ним здоровый человек прикоснется к этой вещи, после чего потянется к своему лицу. Кроме того, по мнению ученых, коронавирус подвержен высыханию, поэтому не передается по воздуху.
Какова инфицирующая доза у коронавируса?
Фото: ТАСС/Ахметов Вадим
Вирусолог и профессор Анатолий Альтштейн рассказал Москве 24, что очень заразным вирусам для инфицирования организма достаточно бывает даже одной частицы – вириона. Менее опасным инфекциям частиц нужно больше, чтобы они сработали.
"Если вирусных частиц будет мало, то в силу таких статистических причин они могут не дойти до нужной клетки, не смогут зацепиться, не смогут размножиться. И инфекция не возникнет", – пояснил специалист.
По словам эксперта, максимальную дозу вируса люди получают при непосредственном контакте с больным COVID-19.
"Конечно, самую большую дозу человек получит, если на него кашлянул и чихнул инфицированный пациент, в организме которого размножается вирус. Путь, когда инфекция попадает на руки, а потом в слизистые оболочки, тоже важный. Но концентрация вируса там значительно меньше", – подчеркнул Альтштейн.
Заведующий отделом Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени Гамалеи Минздрава РФ Александр Бутенко в разговоре с Москвой 24 добавил, что точно определить инфицирующую дозу коронавируса получится только в лабораторных условиях, экспериментируя на мышах или клеточных культурах.
"Можно предполагать, что у тех, кто заразился минимальной дозой, будет бессимптомная болезнь", – сказал он.
Фото: РИА Новости/Илья Питалев
Кроме того, по его словам, влияние на организм того или иного объема дозы зависит от состояния самого человека. В частности, пожилые люди, у которых иммунная система ослаблена и больше сопутствующих заболеваний, тяжелее переносят болезнь, однако, как оказалось, заражаются они не чаще, чем остальные.
Вирусолог также рассказал, что самым опасным предметом с точки зрения заражения является пол. Например, в больницах все вирусы оседают именно там, а затем из заразной зоны медперсонал на обуви разносит то, что сконцентрировалось на поверхности. Поэтому, по его словам, медикам, которые перемещается из инфекционного отделения, нужно тщательно дезинфицировать подошвы обуви. Подобные правила также действуют и в домашних условиях.
Читайте также: