Культивирование вирусов в ветеринарии

Основные методы культивирования вирусов:

1) биологический – заражение лабораторных животных. При заражении вирусом животное заболевает. Если болезнь не развивается, то патологические изменения можно обнаружить при вскрытии. У животных наблюдаются иммунологические сдвиги. Однако далеко не все вирусы можно культивировать в организме животных;

Выбор экспериментальных животных определяется целью работы и видовой чувствительностью к изучаемому вирусу. Для заражения используют обезьян, кроликов, морских свинок, хомячков, белых крыс и мышей.

Лабораторных животных заражают различными способами в зависимости от тропизма вируса к определенным тканям. Так, например, для культивирования нейротропных вирусов заражение производят преимущественно в мозг (вирусы бешенства, клещевого энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) – путем накожного и внутрикожного заражения. Наиболее часто используются накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное и внутримозговое заражение.

Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения вируса, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет поверхностного вирусного белка – гемагглютинина.

В настоящее время использование животных для культивирования вирусов ограничено.

2) культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах. Большинство известных вирусов обладают способностью размножаться в курином эмбрионе (рис.56). Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9–10-, осповакцины – в 12-, паротита – в 7-дневных куриных эмбрионах. Размножение вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса. Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании.

Существует несколько способов заражения развивающегося куриного эмбриона: на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную и амниотическую полости, желточный мешок, тело эмбриона.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку применяется для выделения и культивирования вирусов, образующих на оболочках бляшки (вирусы вакцины, натуральной оспы, простого герпеса). Перед заражением яйца просвечивают с помощью овоскопа, карандашом очерчивают границу воздушного пространства и хорионаллантоисной оболочки. Поверхность яйца над воздушным пространством и в месте заражения протирают спиртом, прожигают, обрабатывают йодом и делают отверстие в полости воздушного мешка. На месте заражения скорлупу удаляют так, чтобы не повредить подскорлупную оболочку, которую затем прокалывают короткой стерильной иглой, чтобы не повредить хорионаллантоисную оболочку. Воздух из полости воздушного мешка отсасывают. Вирусный материал (0,05–0,2 мл) наносят на хорионаллантоисную оболочку туберкулиновым шприцем с короткой иглой или пастеровской пипеткой. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или тем же выпиленным кусочком скорлупы и по краям заливают расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы располагают на подставке горизонтально и инкубируют в термостате. Вскрытие эмбрионов производится не раньше 48 ч инкубации. На зараженной оболочке обнаруживаются беловатые непрозрачные пятна разной формы (бляшки).

Заражение в аллантоисную полость. Вирус, введенный в аллантоис, размножается в эндодермальных клетках, переходя затем в аллантоисную жидкость. Заражение осуществляют следующим способом: в скорлупе над воздушной камерой острием скальпеля или ножниц производят прокол, после чего через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу со шприцем, которая проходит через хорионаллантоисную оболочку и попадает в аллантоисную полость, материал вводится в объеме 0,1 мл и отверстие заливают парафином.

Заражение в желточный мешок. С этой целью используют эмбрионы 5–10-дневного возраста. Наиболее употребительны два метода заражения. По первому материал вводится через воздушное пространство. В центре яйца делают отверстие, помещают его на подставку тупым концом вправо и через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу, надетую на шприц, игла проходит через хорионаллантоисную оболочку, аллантоисную полость в желток. В желточный мешок можно ввести от 0,1 до 0,5 мл вируссодержащего материала. После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином, и эмбрион помещают в термостат. По второму методу на границе воздушного пространства с той стороны, где лежит желток (стороны, противоположной от эмбриона), делают прокол скорлупы, через который вводят инфекционный материал. Направление иглы должно быть к центру яйца.

Индикацию вирусов в курином эмбрионе осуществляют на основании специфических поражений оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния), а также в РГА.

В результате заражения могут происходить и появляться:

1) гибель эмбриона;

2) дефекты развития: на поверхности оболочек появляются образования – бляшки, представляющие собой скопления погибших клеток, содержащих вирионы;

3) накопление вирусов в аллантоисной жидкости (обнаруживают путем титрования);

4) размножение в культуре ткани (это основной метод культивирования вирусов).

21-й век - это век, совершающий семимильные шаги в области технологического прогресса, стремительно развиваются наука и медицина. Современный уровень прогресса позволяет претворить в жизнь то, что раньше казалось человеку невозможным. Постиндустриальная стадия развития человечества нацелена на высокие технологии, инновации во всех сферах.

Особенно быстро развивается медицина: большинство болезней, считавшихся ранее неизлечимыми, теперь таковыми не являются. Так, например, культивирование вирусов позволяет создавать профилактические препараты: вакцины и сыворотки, предотвращающие эпидемии чумы, оспы и других смертельно опасных болезней.

Что такое культивирование?

Культивирование (от лат. cultivo – возделывать) представляет собой процесс разведения и выращивания чего-либо в искусственных условиях. В медицине, а точнее в эпизоотологии – частном ответвлении от ветеринарной медицины, культивирование является основным процессом, позволяющим изучать воздействие вируса на живой организм.

На основании полученной информации фармацевты изготавливают противовирусные препараты, создают методики, позволяющие в будущем противодействовать выявленным микроорганизмам. Выделение вирусов из зараженного материала также позволяет сохранять их для дальнейшего использования.

История эпизоотологии

Еще в 1879 году французский ученый В. Гальтье впервые предпринял попытку культивировать вирус. Его выбор пал на такое заболевание, как бешенство: он выделил неклеточный агент этой болезни посредством заражения кролика кровью больной собаки.

В 1919 году у немца А. Левенштейна получилось заразить вирусом герпеса, взятым у человека, кролика. Годом позже его соотечественник В. Грютер подтвердил опыт своего коллеги и доказал, что подобная культивация на кроликах возможна.

В 1925 году двое ученых – Ф. Паркер и Б. Най – доказали, что вирус коровьей оспы в состоянии воспроизводиться в тканях организма животных. 6-ю годами позже Вудрафф и Э. Гудпасчер заявили, что культивация вируса оспы птиц может проводиться на оболочке куриных эмбрионов, тем самым открыв научному миру новый метод репродукции вирусов.

Процесс заражения клетки

Процесс культивирования вируса невозможен без наличия реагирующей на него клетки. Когда клетка найдена (это могут быть клетки куриных эмбрионов, части тканей, органов или даже целые животные), в нее вводится нуклеиновая кислота вируса, которая перепрограммирует генетическую информацию искомой клетки, заменяя ее своей. Обычно вредоносной частице удается поселиться в клетке, даже несмотря на систему противовирусной защиты и вырабатываемые организмом интерфероны.

После того как вирус проник через мембрану клетки, он начинает размножаться, проходя через 3 стадии. Сначала происходит транскрипция генома закрепившегося вируса, что означает перенос информации из системы ДНК в РНК, которая в последующем синтезируется в ускоренном темпе. Следующий этап – образование и созревание белков, которые послужат каркасом для дочерних вирусных тел.

На последней, заключительной стадии новосинтезированные вирусные тела увеличиваются в количестве. Когда их становится слишком много, разрывают мембрану и выходят из клетки, в которой изначально закрепился вирус. Стоит отметить, что образование вирионов (дочерних тел данного микроорганизма) не всегда приводит к гибели клетки-хозяина. Некоторые способны отпочковываться от мембраны, не вызывая ее разрыва, в то время как клетка продолжает производить вирусные тела.

Микробиология и ее методы

С течением времени биология, как наука, развивалась и впитывала в себя новые факты. Постепенно усложняясь, от нее стали отпочковываться разные направления: биомеханика, гидробиология, вирусология, космическая биология и многие другие. Такой раздел, как микробиология, изучает процессы жизнедеятельности микроорганизмов, в том числе и посредством заражения подопытного лабораторного животного вирусом. Таким образом, в микробиологии культивирование вирусов считается одним из основных способов получения информации, являясь ключевым инструментом биологического метода исследования.

Помимо биологического метода, суть которого заключается в исследовании действия вируса на организм животного и последующей его культивации, существуют и некоторые другие. Во многих случаях вредоносными микроорганизмами заражают куриные эмбрионы, поскольку довольно крупная доля вирусов, известных на сегодняшний день науке, способна реплицироваться именно в этой форме жизни. Однако чаще всего биологи в качестве рабочего материала используют тканевые культуры, поскольку они наиболее продуктивны в качестве метода культивирования.

Вирус и тканевые культуры

Тканевая культура представляет собой некую систему клеток в виде суспензии. Это слой определенного размера, обычно в одну клетку, который помещается на стекло сосуда. Чаще других используется первичная монослойная ткань. Добиться монослойности довольно трудно, сначала выбранную ткань (обычно это ткань сердца, плаценты или почек животных) нужно измельчить.

После измельчения биологи применяют расщепляющий белок фермент – трипсин, который разъединяет клетки ткани, уничтожая между ними межклеточную связь. После достижения разъединения клеток необходимо отмыть их от фермента и поместить в питательную среду, чтобы обеспечить рост получившейся клеточной культуры. Данной средой может послужить среда 199, которая характерна высоким содержанием глюкозы, солей и разных витаминов. Меняется питательная среда по прошествии 2–3 дней.

Кроме первичной ткани для культивирования вирусов также применяются так называемые перевариваемые ткани, которые, в свою очередь, делятся на нормальные и опухолевые. Они более стойкие, чем первичные, и способны длительно размножаться. Нормальными тканями могут послужить органы животных: почки барана, сердце обезьяны. В качестве опухолевых тканей обычно берут клетки HeLa, выделенные изначально из рака шейки матки, или клетки Hep-3, взятые из рака лимфы.

Вирус и куриные эмбрионы

Большинство известных науке вирусов можно выращивать в куриных эмбрионах. Они очень жизнеспособны и устойчивы к негативным внешним воздействиям. Срок, на котором заражается эмбрион, зависит от задач исследования и вида вируса, но обычно не превышает двух недель. Так, например, чтобы провести культивирование вируса гриппа, нужен 9-10-дневный эмбрион, а для того чтобы вырастить вирус паротита, достаточно и недельного эмбриона.

При работе с куриным эмбрионом все его зачатки тканей подвергаются заражению. Результативность культивации можно увидеть на финальной стадии: это может быть гибель эмбриона, а также дефекты развития в виде появления на оболочках эмбриона бляшек, состоящих из вирусных частиц – вирионов.

В любом случае данный метод культивирования и индикации вирусов имеет существенный недостаток, заключающийся в необходимости вскрытия эмбриона для захвата воспроизведенного вируса. Также полученная субстанция имеет в себе высокую концентрацию белка, который нужно удалить, чтобы вывести чистый инфекционный агент для дальнейшего производства медикаментов.

Вирус и организмы животных

В настоящее время использование лабораторных животных в качестве биологического материала в силу своей негуманности ограничено с 1986 года Европейской конвенцией о защите позвоночных животных. Несмотря на это, многие виды животных: мыши и крысы, хорьки и кролики, овцы, собаки и обезьяны – все равно используются в лабораторных работах и экспериментах, поскольку некоторые вирусы способы к репликации только в живых организмах.

Культивирование вирусов в организме животных проводится по-разному: для воспроизведения нейротропных вирусов (бешенство, энцефалит) заражается мозг животного, для создания респираторных (грипп) производится интраназальное заражение, для дерматотропных (оспа) – накожное и подкожное инфицирование.

Чаще прочих для культивации используются грызуны: мыши и крысы, сирийские хомячки, свинки. Их заражают нейротропными инфекционными агентами, аденовирусами, лимфоцитарным хориоменингитом посредством введения вредоносного микроорганизма в мозг или брюшную полость.

Некоторые вредоносные микроорганизмы гораздо быстрее развиваются в телах молодых особей, поэтому онкогенными вирусами заражаются в основном новорожденные крысы и сирийские хомячки. Без них также невозможно обойтись при культивации вирусов Коксаки. Стоит отметить, что биологический метод культивирования вирусов в микробиологии тоже имеет свои изъяны. Во-первых, организмы лабораторных животных загрязняются вирусами, в силу чего они испытывают недомогание. Во-вторых, чтобы получить чистый инфекционный агент, нужно провести его через другие культуры клеток, что увеличивает продолжительность исследования.

Показатели успеха заражения

Культивирование и индикация вирусов – два неразрывных процесса. Индикация позволяет понять, смог ли микроорганизм ужиться в зараженной клетке и получилось ли у него развиваться дальше. Говорить о факте репликации можно, если у животного наблюдаются основные признаки заболевания, а также если органы и ткани подверглись патоморфологическим изменениям. Часто в качестве индикации используется реакция гемагглютинации, которая показывает степень распространения вируса на основе выделяемого им белка гемагглютинина.

Современные особенности культивирования вирусов

Прогресс не стоит на месте, во всех научных сферах появляются инновационные методы, технологии. Микробиология и вирусология не являются исключением. Теперь вместо простого размещения клеточной культуры на сосудах применяется роллерный метод, при котором используемый материал находится на нескольких цилиндрических поверхностях, вращающихся по окружности и периодически омываемых питательной средой. Данный метод хорош тем, что он увеличивает число получаемых клеток и требует меньший расход питательного материала.

Общий вывод

Культивировать вирусы, то есть создавать их в искусственных средах, человек начал совсем недавно. Поначалу заражались организмы животных с целью изучения принципа действия инфекционных агентов и выработки препаратов против них. Благодаря микробиологии, вирусологии и эпизоотологии человечество избавилось от таких смертельной опасности таких заболеваний, как чума, туберкулез, бешенство, корь.

Сейчас для культивации вирусов в основном используются отдельные тканевые культуры и куриные эмбрионы. Посредством различных манипуляций живые клетки заражаются, в них происходит созревание вирусных тел, которые потом выходят за клеточное пространство. Созревшие вирусы собираются биологами для дальнейшего изучения.

Общая вирусология включает в себя: общую характеристику и систематику вирусов; взаимодействие вирусов с чувствительными клетками; культивирование, этиологию и генетику вирусов; патогенез вирусных инфекций; особенности противовирусного иммунитета и др..
Частная вирусология представлена в следующей последовательности: название семейства и вируса; основные свойства вируса; характеристика болезни; клиническая, эпизоотическая и лабораторная диагностика и др., то есть исследует особенности определённых групп вирусов животных и разрабатывает меры борьбы с вызываемыми этими вирусами болезнями.

ЧАСТЬ 1. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах…………………..5

1.1. История открытия…………………………………….……. 5
1.2. Характеристика культивирования ………………………………….………6
1.3. Способы заражения куриных эмбрионов……………….……. 7
1.4. Индикация вируса в курином эмбрионе…………………………. …. 10
1.5. Недостатки метода культивирования вирусов в куриных эмбрионах…..10

ГЛАВА II. Частная вирусология………………..…..…………………………..11

ЧАСТЬ 1. Вирус инфекционного гепатита собак …………………………….11

Kursovaya_rabota_Tarakanovoy_N_Yu.doc

Федеральное государственное обра бюджетное зовательное учреждение

высшего пРофессионального образования

российский государственный аграрный университет –

МСха имени К.А. Тимирязева
(ФГбОУ ВПО ргау - МСХА имени К.А. Тимирязева)

на тему: «Культивирование вирусов в куриных эмбрионах.

32 группы очной формы обучения

Иванова Наталья Алексеевна

доцент, к.б.н. Лужская Т.А.

ГЛАВА I. Общая вирусология………………………………………………. .….5

ЧАСТЬ 1. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах…………………..5

1.2. Характеристика культивирования ………………………………….………6

1.3. Способы заражения куриных эмбрионов……………….……. . 7

1.4. Индикация вируса в курином эмбрионе…………………………. …. 10

1.5. Недостатки метода культивирования вирусов в куриных эмбрионах…..10

ГЛАВА II. Частная вирусология………………..…..…………………… ……..11

ЧАСТЬ 1. Вирус инфекционного гепатита собак …………………………….11

1.3. Эпизоотологические данные …………………………………….………. 12

1.5.1. Реакция преципитации в геле……………………………………. 19

1.5.2. Иммунолюминесценция………… ………………………………. 20

1.5.3. Взаимоотношения с системой иммунитета………………………20

Вирусология ( от лат. virus – яд животного происхождения, logos - учение) — современная биологическая наука, занимающаяся изучением мельчайших микроорганизмов – вирусов. Как самостоятельная наука вирусология сформировалась сравнительно недавно. Несмотря на то, что заболевания вызываемые вирусами (оспа, бешенства и др.), были известны человечеству еще в глубокой древности, их изучение в основном началось только в конце 19 столетия.

Общая вирусология включает в себя: общую характеристику и систематику вирусов; взаимодействие вирусов с чувствительными клетками; культивирование, этиологию и генетику вирусов; патогенез вирусных инфекций; особенности противовирусного иммунитета и др..

Частная вирусология представлена в следующей последовательности: название семейства и вируса; основные свойства вируса; характеристика болезни; клиническая, эпизоотическая и лабораторная диагностика и др., то есть исследует особенности определённых групп вирусов животных и разрабатывает меры борьбы с вызываемыми этими вирусами болезнями.

Для количественного накопления вирусов наиболее удобную систему представляют культуры клеток. Первые попытки культивирования клеток животных вне организма относятся к концу прошлого столетия. Эти отрывочные наблюдения указывали на возможность сохранения жизнеспособности тканей и клеток в искусственных условиях и положили начало глубоким научным исследованиям тканевых культур. Большая заслуга в деле разработки методов культивирования тканей принадлежит Каррелю. Он впервые доказал возможность размножения клеток животных в искусственных условиях и тем самым продемонстрировал их “бессмертность” и сходство с одноклеточными свободноживущими организмами. Значительных успехов в этом направлении достигла группа исследователей под руководством Эрла. Они первые получили рост большого числа клеток на стекле и в жидкой перемешиваемой суспензии.

Тканевые культуры давно нашли применение для решения различных вопросов биологии и медицины. Однако лишь успехи в области вирусологии, достигнутые с помощью тканевых культур, явились мощным стимулом их развития до современного уровня. Культивирование вирусов помогает решить ряд теоретически проблем, связанных с изучением особенностей взаимодействия "вирус-клетка". Кроме того решение целого ряда прикладных задач, связанных с диагностикой и производством препаратов для профилактики вирусных инфекций невозможно без накопления вируссодержащего сырья.

В настоящее время существуют следующие методы культивирования вирусов:

• на восприимчивых домашних и лабораторных животных (телята, мыши, белые крысы, кролики, морские свинки, хомяки, цыплята);
• На развивающихся куриных эмбрионах, деэмбрионированных яйцах и эмбрионах других видов птиц;
• В культуре ткани и клеток.

В первой части подробно будет описан один из методов культивирования вирусов, а именно культивирование на куриных эмбрионах.

Во второй части подробно будет описана одна из болезней - заболевание вирусом инфекционной болезни гепатита собак, имеющее большое значения для предупреждения заболевания и осуществление общих ветеринарно-санитарные мероприятия: предупреждение заноса возбудителя; своевременное диагностирование гепатита; проведение мероприятий, направленных на ликвидацию болезни.

ГЛАВА I. Общая вирусология

ЧАСТЬ 1. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах

Культивирование вирусов помогает решить ряд теоретически проблем, связанных с изучением особенностей взаимодействия "вирус-клетка". Кроме того решение целого ряда прикладных задач, связанных с диагностикой и производством препаратов для профилактики вирусных инфекций невозможно без накопления вируссодержащего сырья.

Культивирование вирусов в куриных эмбрионах – наиболее совершенный метод. Впервые он был применен Раусом в 1911 году для выделения вируса саркомы белых мышей. Однако идея использования куриных эмбрионов для выращивания вирусов не была оставлена и вскоре получила реальное воплощение. Ведь использовать целый эмбрион гораздо удобнее, чем только часть его. Куриный эмбрион - это автономный, снабженный всем необходимым организм, защищенный яичной скорлупой, от природы наделенный всеми необходимыми защитными средствами от бактерий. Они дешевы и доступны, и их можно получать в необходимых количествах. И в 1931 году Вудраффом и Гудпасчером были проделаны опыты – они заразили хорионов-аллантоисную оболочку куриного эмбриона вирусом оспы птиц, и с этого времени культивирование вирусов стало такой же легкой процедурой, как и выращивание бактерий.

Вирусы, имеющие эпителиотропные свойства (оспа, оспа птиц, ларинготрахеит и др.), успешно развиваются на хорион-аллантоисной оболочке, вызывая макроскопически видимые изменения. Различные представители микровирусов (грипп А, В и С, Ньюкаслская болезнь, классическая чума птиц, эпидемический паротит, инфекционный бронхит птиц, вирусный гепатит утят, арбовирусы и др.) хорошо репродуцируются в курином эмбрионе при введении их в аллантоисную полость. Некоторые крупные вирусы культивируются в желточном мешке эмбриона, вакцинные штаммы вируса чумы КРС репродуцируются в эмбрионе при внутривенном его заражении.

В 1937 году выращивание вирусов в оплодотворенных куриных яйцах позволило практической медицине одержать крупную победу. Бактериологи Рокфеллеровского института постоянно вели поиски средств, способных оказать помощь в борьбе против вируса желтой лихорадки. Ведь уничтожить комаров полностью было невозможно, помимо этого постоянными носителями инфекции в тропиках были обезьяны. Южноафриканский микробиолог Макс Тейлер, работавший в Рокфеллеровском институте, поставил перед собой цель получить ослабленную культуру вируса желтой лихорадки. Он пассировал вирус, перепрививая его от одного животного к другому, от одного эмбриона к другому, для чего использовал 200 мышей и 100 куриных эмбрионов, пока не получил мутант, который вызывал лишь легкие симптомы желтой лихорадки, но зато способствовал развитию полной невосприимчивости к этой болезни. За эту работу Тейлер в 1951 году был удостоен звания лауреата Нобелевской премии в области медицины и физиологии.

Культивирование в куриных эмбрионах – наиболее доступный и удобный метод как для первичного выделения многих вирусов животных, так и для последующего культивирования их в лаборатории.

В основе метода лежит удаление эмбриона (деэмбринирование) до яйца в период, когда к его скорлупе изнутри полностью прилегает хорион-аллантоисная оболочка. Если внутрь такого яйца добавить питательную среду, то образуется своеобразная культура ткани, в которой может репродуцироваться вирус.

Метод обладает рядом преимуществ, так как позволяет получить более чистый вирус, чем в аллантоисно-амниотической жидкости, что важно для снижения аллергизирующих свойств вакцин, приготовленных из этого материала, а отсутствие желточного мешка и, следовательно, содержащихся в нем специфических антител способствует размножению некоторых видов вирусов.

Инкубацию проводят в гнездах штатива тупым концом яйца вверх в хорошо вентилируемых инкубаторах или термостатах при 37-37,5 о С,относительной влажности 63-65%. Для заражения отбирают 4-13 дневные эмбрионы с зараженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обрабатывают спиртом, обжигают и в области введения (чаще над воздушной камерой) смазывают 2% йодной настойкой. Материал или исследуемую культуру вводят, вскрывая или не вскрывая скорлупу, в желточный мешок (риккетсий), в аллантоисную или в амниотическую полости (большинство вирусов), наносят на хорион-аллантоисную оболочку. Реже культуру вводят в тело эмбриона или в/в. Зараженные КЭ помещают в термостат в условиях и на сроки, которые зависят от вида микроба и целей исследования. Некоторые данные о результатах заражения можно получить при внешнем осмотре КЭ под микроскопом (инъекция сосудов, потеря подвижности и др.). Однако в большинстве случаев КЭ вскрываю. Для этого после обработке спиртом и йодной настойкой скорлупу срезают выше границы воздушного мешка, пастеровской пипеткой или шприцем отсасывают сначала аллантоисную, а затем амниотическую жидкость, избегая повреждения сосудов и желточного мешка. Эмбрион и хорион-аллантоисную оболочку извлекают из скорлупы, помещают в стерильные чашки, промывают стерильной дистил. водой и осматривают. Дальнейший ход исследования эмбриона и его жидкостей зависит от вида микроба или вируса и целей опыта. На размножение вирусов в них существенное влияние оказывает температура инкубации, возраст эмбрионов, метод заражения и количество введенного вируса. Многое вирусы (чума птиц, гриппа, герпеса и др.) активно репродуцируются при температуре от 32 до 37 о С. Некоторые специально селекционированные штаммы удовлетворяет более низкая температура (23…28 о С), но скорость репродукции при этом значительно ниже. При температуре 39…40 о С вирусы размножаются быстрее, а при 41…42 о С, как правило, они не размножаются. Наиболее активно накапливается вирус при введении в эмбрион 1000…10000 инфекцированных доз.

Для заражения выбирают здоровые эмбрионы. Для этого проводят овоскопию. На скорлупе делают пометки карандашом - границы воздушной камеры и местоположение зародыша.

Существует несколько способов заражения:

1. Заражение в аллантоисную полость.

10-суточные эмбрионы зара-жают через отверстия, сделанные в скорлупе и подлежащих оболочках (см. выше). Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут:

1. Заражение на хорион-аллантоисную оболочку;

Обычно используют 10-12-суточные эмбрионы.

Применяется для выделения и культивирования вирусов, образующих на оболочках бляшки (вирусы вакцины, натуральной оспы, простого герпеса). Перед заражением яйца просвечивают с помощью овоскопа, карандашом очерчивают границу воздушного пространства и хорион-аллантоисной оболочки. Поверхность яйца над воздушным пространством и в месте заражения протирают спиртом, прожигают, обрабатывают йодом и делают отверстие в полости воздушного мешка. На месте заражения скорлупу удаляют так, чтобы не повредить подскорлупную оболочку, которую затем прокалывают короткой стерильной иглой, чтобы не повредить хорион-аллантоисную оболочку. Воздух из полости воздушного мешка отсасывают Вирусный материал (0,05 – 0,2 мл) наносят на хорион-аллантоисную оболочку туберкулиновым шприцом с короткой иглой или пастеровской пипеткой. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или тем же выпиленным кусочком скорлупы и по краям заливают расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы располагают на подставке горизонтально и инкубируют в термостате. Вскрытие эмбрионов производится не раньше 48 часов инкубации. На зараженной оболочке обнаруживаются беловатые непрозрачные пятна разной формы (бляшки).

Индикацию, т.е. обнаружение факта репликации вируса, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет поверхностного вирусного белка - гемагглютинина. В настоящее время использование животных для культивирования вирусов ограничено, в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных научных целях.

2. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах.

Большинство известных вирусов обладают способностью реплицироваться в курином эмбрионе. Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9-10, осповакцины - в 12, паротита - в 7-дневных куриных эмбрионах. Репродукция вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса. Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании.

3. Культивирование вирусов в тканевых культурах.

Клеточная культура– система клеток, получаемая из ткани, находящаяся в виде слоя клеток, прикрепленных к стеклу, или в виде суспензии.

Наиболее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток.

Сущность методов при приготовлении первичных культур тканей заключается в разрушении межклеточной ткани и разобщения клеток для последующего получения монослоя. Разобщение клеток проводится путём воздействияна ткань протеолитических ферментов (трипсина).

Для культивирования культуры клеток применяют синтетические питательные среды – 199, Игла, Хенкса, Эрла (эти среды имеют аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли). Смена питательной среды проводится через 2-3 дня.

первичные (трипсинизированные) культуры клеток – у которых межклеточные связи разрушают ферментами (трипсином, панкреатином) и получают монослой клеток на стекле.

а) нормальные (ПКБ – почки барана; СОЦ – сердце обезьяны циномольгус);

б) опухолевые – Hela– рак шейки матки;Hep–1 – эпидермоидный рак гортани; Дейтройт 6 – костный мозг больного раком легкого.

О наличии вирусав зараженной культуре клеток можно судить по цитопатическому действию (ЦПД) – патологические изменения морфологии клеток, вплоть до их гибели, возникающие в результате репродукции вирусов, и наблюдаемые под микроскопом:

дегенерация клеток (округление, изменение формы, разрушение);

появление включений (Липшются – вирус герпеса; Гварниери – вирус натуральной оспы) и телец (Бабеша-Негри – вирус бешенства);

разрушение пласта клеток (парамиксовирусы);

образование гигантских многоядерных клеток - симпластов (вирус кори).

Основные методы индикации вирусов в культуре тканей:

3.реакция нейтрализации вирусов в культуре тканей;

4.цветная реакция Солка.

Реакция гемагглютинации– склеивание эритроцитов при добавлении вирусосодержащего материала (есть вирус – эритроциты оседают в виде “зонтика”; нет вируса – в виде “диска”).

Реакция гемадсорбции– адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток и образуют характерные скопления (вирус гриппа– вызывает агглютинацию эритроцитов островкового типа).

Цветная реакция Солка– основана на изменении цвета питательной среды. В результате жизнедеятельности клеток в питательную среду выделяются продукты клеточного метаболизма и происходит сдвиг рН в кислую сторону, о чем свидетельствует изменение цвета среды из красного в желтый. Если вирус присутствует и реплицируется в культуре, то вследствие разрушающего действия вируса клетки дегенерируются, и подавляется их метаболизм, т.е. цвет средынеизменяется.

Основные пути передачи вирусов:

воздушно-капельный (вирус гриппа, вирус натуральной оспы);

пищевой (вирус полиомиелита, вирус гепатита А);

контактно-бытовой (вирус бешенства, герпесвирусы);

трансмиссивный (вирус клещевого энцефалита);

гематогенный (ВИЧ, вирус гепатита В, С).

Методы диагностики вирусных заболеваний.

Вирусоскопический– в исследуемом материале с помощью электронной микро-скопии обнаруживаются вирионы, а с помощью светооптической – внутриклеточные включения (недостаток светооптической микроскопии – не специфичность).

Вирусологический – выделение и идентификация вирусов с использованием клеточных культур или куриных эмбрионов, заражением лабораторных животных.

Методы идентификации вирусов:

нейтрализации цитопатического действия (ЦПД);

нейтрализация реакции гемадсорбции;

торможение реакции гемагглютинации;

нейтрализация в опытах на животных.

Для идентификации применяется типоспецифические сыворотки.

4. Серологические– для обнаружения как специфических Ат, так и вирусных Аг:

реакция гемагглютинации иммунного прилипания (Аг+Ат в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах);

Иммунофлуоресцентный метод(ускоренная диагностика).

Метод ДНК-зондов (гибридизация)в основе лежит способность однонитевых молекул нуклеиновых кислот вступать во взаимодействие с комплементарными нитями и образовывать двунитевые гибридные молекулы. Гибридизация осуществляется на нитроцеллюлозной мембране (твердая подложка). Исследуемую клеточную суспензию лизируют для высвобождения нуклеиновых кислот. ДНК денатурируют, а образовавшиеся одноцепочечные молекулы переносят на мембрану, где они ковалентно связываются с ДНК-зондом, который представляет собой меченные изотопом или ферментом денатурированные молекулы нуклеиновой кислоты. Гибридизация (спаривание) произойдет, если между зондом и нитью ДНК есть гомология.

9. ПЦР(полимеразная цепная реакция) - данный метод основан на выявлении в исследуемом образце специфического фрагмента ДНК возбудителя и на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное достраивание обеих нитей.

Трактовать морфологию и ультраструктуру вирусов.

Ознакомиться с классификацией вирусов.

Анализировать особенности взаимодействия вирусов с живыми системами.

Оценивать результаты репликации вирусов в живых системах.

Анализировать методы культивирования вирусов в лабораторных условиях.

Трактовать современные методы лабораторной диагностики вирусных заболеваний.

Проводить алгоритм репликации вирусов с различными типами взаимодействия их с живыми системами.

Оценить цветную пробу Солка, реакцию гемагглютинации и гемадсорбции.

Проводить микроскопию препаратов культуры клеток с разными видами ЦПД вирусов с помощью иммерсионного микроскопа.

1. Общая характеристика вирусов, их основные свойства.

Морфология и ультраструктура вириона.

Классификация вирусов. Принципы, положенные в основу.

Методы культивирование вирусов.

Методы индикации и идентификации вирусов (характер ЦПД в культуре ткани, реакция гемадсорбции и гемагглютинации и др.)

Современные методы лабораторной диагностики вирусных заболеваний.

Практические задания, которые выполняются на занятии:

1. Микроскопия интактных пробирочных культур фибробластов и пораженных различными вирусами клеток.

2. Овоскопия куриных эмбрионов.

3. Зарисовка демонстрационных препаратов с ЦПД вирусов в протокол занятия.

Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник /Под ред. А.А. Воробьёва.– М.: МИА, 2004.– 691с.: ил.

Букринская А.Г. Вирусология.– М.: Медицина, 1986.– 336 с.: ил.

Тимаков В.Д., ЛевашевВ.С., Борисов Л.Б. Микробиология /Учебник.-2-е изд., перераб. и доп.-М.:Медицина, 1983,- 512с.

Пяткин К.Д. Кривошеин Ю.С. Микробиология с вирусологией и иммунологией.- Киев: Вища школа, 1992.- 431с.

Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.- М.: ГЕОТАР-МЕД, 2001.- 768с.

Черкес Ф.К., Богоявленская Л.Б., Бельскан Н.А. Микробиология. /Под ред. Ф.К. Черкес.– М.: Медицина, 1986.– 512 с.

2. Тiтов М.В. Iнфекцiйнi хвороби.- К., 1995.– 321с.

3. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни.- М.: Медицина, 1990.- 559 с.

4. Павлович С.А. Медицинская микробиология в графах: Учеб. пособие для мед. ин-тов.– Мн.: Выш. шк., 1986.– 255 с.