Культуры клеток и тканей методы культивирования вирусов вирусологические методы исследования
Вирусологический метод включает культивирование вирусов, их индикацию и идентификацию. Материалами для вирусологического исследования могут быть кровь, различные секреты и экскреты, биоптаты органов и тканей человека. Исследование крови часто проводят в целях диагностики арбовирусных заболеваний. В слюне могут быть обнаружены вирусы бешенства, эпидемического паротита, простого герпеса. Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителя гриппа, кори, риновирусов, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов. В смывах с конъюнктивы обнаруживают аденовирусы. Из фекалий выделяют различные энтеровирусы, адено-, рео- и ротавирусы.
Для выделения вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы, иногда лабораторных животных.
Источник получения клеток — ткани, извлечённые у человека при операции, органы эмбрионов, животных и птиц. Используют нормальные или злокачественно перерождённые ткани: эпителиальные, фибробластического типа и смешанные. Вирусы человека лучше размножаются в культурах клеток человека или почечных клеток обезьян.
Большинство патогенных вирусов отличает наличие тканевой и типовой специфичности. Например, полиовирус репродуцируется только в клетках приматов, что определяет необходимость подбора соответствующей культуры. Для выделения неизвестного возбудителя целесообразно одномоментное заражение 3-4 культур клеток, так как одна из них может оказаться чувствительной.
Вирусы культивируют на биологических моделях: в организме лабораторных животных, в развивающихся куриных эмбрионах и культурах клеток (тканей).
Лабораторных животных (взрослых и новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян и др.) заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами. Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения вирусов, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет имеющегося на поверхности вириона особого белка гемагглютинина. Реакцию проводят вне организма — в пробирках (in vitro), по сути она не является иммунологической реакцией. Использование животных для культивирования вирусов в диагностических целях в настоящее время весьма ограничено.
Развивающиеся 5—12-дневные куриные эмбрионы заражают путем введения исследуемого материала в различные полости и ткани зародыша (рис.3.3). Индикацию вирусов осуществляют на основании специфических поражений оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния), а также в РГА. Методику культивирования вирусов в развивающихся эмбрионах птиц широко используют при промышленном выращивании вирусов.
Культуры клеток. Классификация клеточных культур. Питательные среды для культур клеток. Методы индикации вирусов в культуре клеток.
Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.
Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.
Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.
Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.
Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур[6][7]. Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и др[8]. Факторы роста, используемые в питательных средах, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами.
Сайт СТУДОПЕДИЯ проводит ОПРОС! Прими участие :) - нам важно ваше мнение.
Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты. Они размножаются в живых клетках и не растут на искусственных питательных средах, поэтому методы культивирования вирусов отличаются от методов культивирования бактерий.
1. На лабораторных животных. Заражают животных (подкожно, внутримышечно, внутрибрюшино), которые чувствительны к определенным вирусам: хорьков - вирусом гриппа, кроликов - вирусом бешенства, обезьян - вирусом полиомиелита. Индикация (обнаружение) вируса проводится по признакам заболевания. Недостаток метода - не все вирусы можно культивировать на животных, например, животные невосприимчивы к вирусам человека.
2. В куриных эмбрионах. Заражают куриный эмбрион (аллонтоисная полость, хорион-аллонтоисная оболочка, амниотическая полость, желточный мешок, сам эмбрион). Куриный эмбрион – очень удобен. Он защищен от попадания других микробов (стерильный), техника работы с ним проста, можно накопить большое количество вирусов. Индикация: а) по специфическим поражениям на хорион-аллантоисной оболочке, по гибели эмбриона, б) по реакции склеивания эритроцитов – реакции гемагглютинации (РГА). Недостатки метода: а)не все вирусы (вирус полиомиелита, вирус ящура) можно вырастить в куриных эмбрионах; б) невозможно обнаружить микроб без вскрытия эмбриона; в) в нем много загрязняющих белков и других соединений.
3. В тканевых культурах. Тканевые культуры или клеточные культуры – клетки, выращенные вне организма на искусственных питательных средах. Для их приготовления используют чаще всего эмбриональные и опухолевые ткани. Метод тканевых культур разработан Дж. Эндерсом в 50-е годы. Большинство вирусов способно размножаться в культурах клеток. Для каждого вируса можно подобрать наиболее чувствительную культуру клеток.
Бывают культуры растущих тканей и переживающих тканей (утративших способность к росту).
Существуют три типа растущих тканевых культур:
а) однослойныетканевые культуры – клетки прикрепляются и растут в виде сплошного монослоя по поверхности стекла лабораторной посуды;
б) культуры суспензированных клеток – клетки растут и размножаются во взвешенном состоянии;
в) органные культуры - кусочки органов животных и человека, выращиваемые вне организма.
Однослойные культуры – основные культуры. Различают: а) первичные – клетки этой культуры делятся один раз, поэтому каждый раз необходимо вновь получать культуру ткани; чаще всего используют эмбриональные ткани и опухолевые ткани взрослого человека;
б) полуперевиваемые – клетки делятся до 50 раз, сохраняя диплоидный набор хромосом; их можно перевивать несколько раз; используют диплоидные клетки человека (фибробласты человеческого эмбриона, диплоидные клетки легких человека);
в) перевиваемые – клетки культуры постоянно делятся в условиях in vitro (вне организма), поэтому их можно перевивать непрерывно; их готовят из линий клеток, которые хорошо размножаются в течение многих лет; чаще всего эти культуры получают из опухолевых клеток. Получено около 200 штаммов таких клеток: штамм L (из культуры мышиных фибробластов), штамм HeLa (из карциномы шейки матки), штамм Hep-3 (из лимфоидной карциномы) и т.д.
Первичные и перевиваемые линии клеточных культур могут быть загрязнены неизвестными вирусами, в том числе онкогенными, это ограничивает их применение, особенно в производстве вакцин.
Все работы с культурами клеток требуют строжайшего соблюдения правил асептики. К культуре клеток добавляют антибиотики против бактериального загрязнения.
Способы обнаружения (индикации) вирусов в тканевой культуре.
Вирусы можно обнаружить следующим образом.
1. По цитопатическому действию (ЦПД). В результате размножения вирусов в клетках происходят морфологические изменения клеток (вакуолизация цитоплазмы, деструкция митохондрий, округление клеток). Часть клеток погибает и отслаивается от стекла. Вместо сплошного монослоя остаются отдельные клеточные островки. ЦПД обнаруживают под микроскопом (´8). По ЦПД можно не только обнаружить, но и идентифицировать вирусы. Например, вирус полиомиелита вызывает мелкозернистую деструкцию клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений клеток в виде виноградных гроздьев; вирус кори вызывает образование симпластов – многоядерных клеток.
2. Пообразованию включений. Включения - скопления вирусов в клетках. Они имеют различную форму и размеры. Их окрашивают по Романовскому-Гимзе или флюорохромами и наблюдают под микроскопом.
3. Погемадсорбции. Клетки, зараженные вирусами, могут адсорбировать эритроциты. Вирусы выходят на поверхность клеток и связывают эритроциты. Эритроциты добавляют к культуре и через некоторое время промывают физиологическим раствором. На поверхности клеток под микроскопом видны прилипшие эритроциты в виде разнообразных фигур;.
4. Пореакция гемагглютинации. Гемагглютинация - склеивание эритроцитов под влиянием вирусов. Эритроциты добавляют к культуральной жидкости. Если в ней есть вирусы, то эритроциты склеиваются.
5. По"цветной" реакции. Клетки культуры выращиваются на жидкой среде с индикатором (метиленовым красным). Индикатор изменяет цвет (с красного на желтый) под действием кислых продуктов метаболизма при росте нормальных клеток. Если клетки заражены вирусом, то нормальный метаболизм нарушается, кислые продукты не образуются и индикатор не изменяет цвет. Таким образом, признаком размножения вирусов в клетках культуры является сохранение красного цвета среды.
Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет
Вирусологи́ческие методы исследования
Методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции.
Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).
В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры. Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных. Суспензию клеток в питательной среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разведениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную среду, обычно без сыворотки.
Клетки большинства первичных культур могут быть пересеяны, такая культура называется вторичной. При дальнейшем пассировании клеток формируется популяция фибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет исходный набор хромосом. Это так называемые диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными. Однослойные культуры растут в виде сплошного слоя на поверхности стекла, суспензионные — в виде суспензий в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств. Существует более 400 линий клеток, полученных от 40 различных видов животных (в т.ч. от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и человека.
В искусственных питательных средах можно культивировать кусочки отдельных органов и тканей (органные культуры). Эти типы культур сохраняют структуру ткани, что особенно важно для выделения и пассирования вирусов, которые не репродуцируются в недифференцированных тканевых культурах (например, коронавирусы).
В зараженных клеточных культурах вирусы можно обнаружить по изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.
Выделение вирусов является трудоемким и длительным процессом. Его осуществляют с целью определения циркулирующего среди населения типа или варианта вируса (например, для идентификации сероварианта вируса гриппа, дикого или вакцинного штамма вируса полиомиелита и т.д.); в случаях, когда это необходимо для проведения срочных эпидемиологических мероприятий; при появлении новых типов или вариантов вирусов; при необходимости подтверждения предварительного диагноза; для индикации вирусов в объектах окружающей среды. При выделении вирусов учитывают возможность их персистирования в организме человека, а также возникновения смешанной инфекции, вызванной двумя и более вирусами. Генетически однородная популяция вируса, полученная от одного вириона, называется вирусным клоном, а сам процесс получения его — клонированием.
Для выделения вирусов применяют заражение восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект), образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2—3 пассажей вируса.
Для выделения ряда вирусов, например вирусов гриппа, используют куриные эмбрионы, для выделения некоторых вирусов Коксаки и ряда арбовирусов — новорожденных мышей. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов.
При работе с вирусами определяют их титр. Титрование вирусов проводят обычно в культуре ткани, определяя наибольшее разведение вируссодержащей жидкости, при котором происходит дегенерация ткани, образуются включения и вирусоспецифические антигены. Для титрования ряда вирусов можно использовать метод бляшек. Бляшки, или негативные колонии вирусов, представляют собой очаги разрушенных под действием вируса клеток однослойной культуры ткани под агаровым покрытием. Подсчет колоний позволяет провести количественный анализ инфекционной активности вирусов из расчета, что одна инфекционная частица вируса образует одну бляшку. Бляшки выявляют путем окрашивания культуры прижизненными красителями, обычно нейтральным красным; бляшки не адсорбируют краситель и поэтому видны как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл.
Очистку и концентрацию вирусов обычно осуществляют путем дифференциального ультрацентрифугирования с последующим центрифугированием в градиентах концентраций или плотности. Для очистки вирусов применяют иммунологические методы, ионно-обменную хроматографию, иммуносорбенты и т.д.
Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; выделение вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории. Современная диагностика вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная микроскопия, а также иммунофлюоресценция, метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др.
Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (10 5 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.
Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных. Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций. Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ и др.
Антитела класса lgM появляются раньше, чем антитела класса G (на 3—5-й день болезни) и исчезают через несколько недель, поэтому их обнаружение свидетельствует о только что перенесенной инфекции. Антитела класса lgM выявляют методом иммунофлюоресценции или с помощью иммуноферментного анализа, используя анти- μ-антисыворотки (сыворотки против тяжелых цепей lgM).
Серологические методы в вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях (см. Иммунологические методы исследования): реакции связывания комплемента, торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа. Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются. Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую — через 2—3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно.
Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител к ним в сложных смесях без предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг. Метод сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом. Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет выявлять индивидуальные пары антиген — антитело. Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции иммуноферментного анализа обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков. Идентификация антител в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет определять стадию заболевания, а при анализе популяций — изменчивость вирусных белков. Иммуноблоттинг при ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител к ним. При анализе популяций метод используют для определения изменчивости вирусных белков. Большая ценность метода заключается в возможности анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.
Библиогр.: Букринская А.Г. Вирусология, М., 1986; Вирусология, Методы, под ред. Б. Мейхи, пер. с англ., М., 1988; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М.О. Биргера, М., 1982.
В медицине разработаны специальные методы исследования для диагностики заболеваний с вирусной природой. Это необходимо, чтобы идентифицировать вирус, изучить его биологию и способность воздействовать на клетки животного и человека. Таким образом, появляется возможность понять патогенез вирусных заболеваний и, соответственно, правильно выбрать методику лечения.
В чем заключается диагностика?
Вирусы размножаются в живых клетках. Чтобы его исследовать, необходимо культивирование на уровне подопытного организма или культуры клеток. Для этого в медицинской практике и микробиологии в целом проводятся вирусологические методы исследования, которые имеют следующие основные подходы:
Вам будет интересно: Пенализация и депенализация - это. Понятие, определение и виды в уголовном праве
Материал могут исследовать непосредственно на наличие нуклеиновых кислот, вирусного антигена или, например, изолировать и идентифицировать вирус из клинического материала.
Кроме возможности установить этиологию заболевания, мониторинга терапевтического эффекта, вирусологические методы исследования играют большую роль в противоэпидемических мероприятиях. Для выделения и культивирования вируса используют куриные эмбрионы, лабораторных животных или культуры клеток.
Как исследуют?
Самый быстрый – это прямой метод. Он позволяет обнаружить вирус, антиген или НК (нуклеиновую кислоту) в самом клиническом материале. Занимает время от двух часов до суток.
В чем смысл исследований?
Вам будет интересно: Куда направлен вектор импульса тела? Чему сонаправлен вектор импульса тела?
Для успешного выделения вирусов клинический материал берут в соответствии с патогенезом и как можно раньше. Часто этот процесс требует проведения нескольких пассажей, прежде чем применить определенные вирусологические методы исследования.
Микробиология изучает микроскопические существа. И ее область – это не только медицина. Она является основополагающей наукой для сельского хозяйства, ветеринарии, космической и технической промышленности, геологии.
Но безусловно все создано для человека и его развития на этой прекрасной планете. Поэтому очень важно вовремя обнаружить опасность и нейтрализовать ее. Вирусы отличны от бактерий. Это структуры, попадающие в организм и вызывающие образование нового поколения. Они похожи на кристаллы и направлены на управление процессом своего размножения, хотя сами не питаются, не растут и не выделяют продуктов обмена.
Вирус способен вызвать тяжелое заболевание у любого живого организма, в который он попал. К тому же он может эволюционировать. Именно поэтому вирусологические методы исследования в микробиологии должны развиваться и совершенствоваться, так как под угрозой может быть человеческая цивилизация в целом.
Материалы
Для обнаружения и идентификации вирусов в медицине, как правило, берутся:
- носоглоточный смыв (респираторные инфекции);
- смыв и фекалии (энтеровирусные инфекции);
- соскобы, содержимое пузырьков (поражения кожи, слизистых оболочек, как герпес, ветряная оспа);
- смывы (экзантемные инфекции, как корь, краснуха);
- кровь, спинномозговая жидкость (арбовирусные инфекции).
Все этапы вирусологического метода исследования включают в себя:
- забор материала;
- выбор, получение тест-системы, определение ее жизнеспособности;
- заражение тест-системы;
- индикация вируса;
- определение типа вируса.
В основном, патогенные вирусы отличаются наличием тканевой и типовой специфичности. Взять, к примеру, полиовирус, который репродуцируется только у приматов (в их клетках). Соответственно, для выделения определенного вируса используют определенную культуру ткани. Если речь идет о неизвестном возбудителе, то целесообразно будет одномоментно заразить три, а лучше четыре культуры клеток.
Таким образом, возможно, одна из них окажется чувствительной. Чтобы определить наличие вируса в зараженных культурах, смотрят на развитие специфической дегенерации клеток, внутриклеточные включения, выявление специфического антигена, положительные реакции гемагглютинации и гемадсорбции.
Все вирусологические методы исследования (прямые и непрямые, серологические) должны быть выбраны, как наиболее подходящие для конкретного случая предполагаемого инфицирования.
Непрямые методы основываются на выделении и идентификации вируса. Они трудоемкие, длительные, но точные.
Серодиагностика
Под такой диагностикой подразумевается метод, основанный на реакции антиген-антитело. Чаще всего используют парные сыворотки крови, взятые с интервалом в несколько недель. Если нарастание титра антител в 4 и больше раз, реакцию считают за положительную. Чтобы определить типоспецифичность вируса, применяют реакцию вируснейтрализации. Для определения группоспецифичности нужно получить реакцию связывания комплемента.
Широко используют различные варианты иммуноферментного анализа, реакции торможения гемагглютинации, пассивной гемагглютинации, обратной пассивной гемагглютинации, РИФ. Еще в генной инженерии был разработан метод получения моноклональных антител. Преодолеть узкую специфичность моноклонов можно применением нескольких моноклональных антител к различным вирусным детерминантам. Таким образом, была повышена специфичность и чувствительность исследования с определением антигенов.
Некоторые особенности
Сегодня создано много разных тест-систем для иммунологической диагностики инфекций, возникших вследствие попадания вируса в живой организм.
Таким образом, вирусологические методы исследования – это способы выделения вирусов, изучение их свойств и установление их этиологической связи с определенными заболеваниями.
Что касается животных, используемых в этих исследованиях, то они должны быть достаточно восприимчивы к определенной вирусной инфекции, они не должны являться носителями латентной инфекции и каких-то паразитов. Значение также имеет вид животного, его возраст, порода, вес тела, упитанность, половая принадлежность и условия содержания. В опыте участвуют животные одного вида, возраста, с одинаковыми условиями содержания. Иногда могут быть использованы разные виды животных, с различной чувствительностью к одному и тому же вирусу. Это помогает выявить все разнообразие инфекционных форм.
Читайте также: