Лаборатория биохимии вирусных рнк

Россия готовится к тотальному тестированию, новые тест-системы позволяют быстро провести масштабную проверку на вирус. К массовому выпуску приступил один из разработчиков нового продукта, два других начинают производство. Олег Гусев, ведущий научный сотрудник Научно-клинического центра прецизионной и регенеративной медицины Казанского федерального университета и института физико-химических исследований RIKEN (Япония) помог РБК Тренды разобраться в том, как устроено тестирование на коронавирус в России и в мире.

Что предлагает ВОЗ

Глава Всемирной организации здравоохранения Тедрос Гебреисус еще в середине марта призвал страны проводить как можно больше тестов на вирус, который вызывает заболевание SARS-CoV-2, даже людям без симптомов. Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Как говорится в рекомендациях, на сегодня это самый точный и надежный метод диагностики вирусной инфекции. Он позволяет определить даже очень небольшое количество РНК вируса в биологическом материале человека. Это помогает выявить болезнь в инкубационном периоде.

Изобретенный в 1983 году метод и сейчас считается фундаментальным в молекулярной диагностике. Американский ученый, который придумал способ значительного увеличения малых концентраций фрагментов ДНК в биологической пробе, получил за него Нобелевскую премию. Выявление ДНК/РНК методом ПЦР позволяет диагностировать такие заболевания, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие. Метод используют в археологии, криминалистике, генетике.

Как работает ПЦР-тест

Для анализа из физиологических жидкостей извлекают одноцепочечную РНК, моделируют на ее основе двуцепочечную ДНК и многократно дублируют с помощью специального фермента (полимеразы). Увеличение числа копий ДНК называется амплификацией. В результате концентрация определенных фрагментов ДНК/РНК в биологическом образце, изначально минимальная, значительно увеличивается. При исследовании копируется только необходимый для теста участок ДНК. И, конечно, дублирование происходит только в том случае, если искомый участок вирусной ДНК или РНК присутствует в исследуемом биоматериале. В случае с коронавирусом мазок для анализа берут из ротоглотки или носоглотки, поскольку в крови или в кале вирус появляется на более продвинутой стадии болезни.

Тест-система EMG — продукт совместной разработки российских и японских разработчиков, проводившейся с 2016 года, рассказывает Олег Гусев. На данный момент эти тесты включены в систему обязательного медицинского страхования в Японии.

В ближайшее время планируется производить до 2,5 млн. тестов и 1 тыс. портативных лабораторий в неделю. Сами тесты, как и многие реагенты производятся в России. Планируется, что цена на тесты EMG будет в среднем в пять раз меньше, чем на стандартные ПЦР-тесты в Европе.

Российско-японские тесты основаны на методе изотермальной молекулярной диагностики SmartAmp, превосходящем метод ПЦР по скорости работы в восемь раз, а переносная лаборатория позволяет тестировать до 20 пациентов в час, говорит Гусев.

Ключевое отличие теста EMG в том, что многие тесты, которые производятся сейчас, это тесты ИФА (имунноферментный анализ), а не ПЦР. Данные системы определяют антитела, которые организм начинает вырабатывать не ранее, чем через неделю после заражения. Российско-японская разработка позволяет получать результат уже за 30 минут, с точностью, равной почти 100%. Кроме того, тест EMG позволяет определить наличие вируса уже на самых ранних стадиях, в то время как другие системы диагностики короновируса обладают меньшей чувствительностью и не могут выявлять вирус на ранней стадии инфицирования.

Принцип технологии российско-японского теста, по сути, не отличается от классической ПЦР — это наращивание количества целевых фрагментов ДНК и их детекция. Однако в изотермической амплификации, в отличие от классической ПЦР, где необходимы циклы нагрева и охлаждения, все происходит при одной температуре. Это позволяет многократно увеличивать скорость реакции. Метод SmartAmp был изобретен более 15 лет назад (как и LAMP — другая популярная технология изотермальной амплификации, предшествующая SmartAmp). Впервые для инфекционных заболеваний эту технологию применили в 2009 году для быстрого выявления пандемического гриппа (H1N1) в Японии.

Повторные тесты необходимы при любом методе. Отрицательный тест на COVID-19 не гарантирует, что человек не заразится этим вирусом на следующий день. Поэтому, например, в японских лабораториях персонал тестируют каждые несколько дней. Повторный тест нужен и для того, чтобы подтвердить, что человек излечился.

Эта тест-система будет использоваться для диагностики COVID-19 не только в России и Японии. 40 тыс. тестов закупила Австрия, поступили заказы из других стран Европы, Ближнего Востока, и Латинской Америки. Подана заявка в Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) для поставок в эту страну.

На данный момент в России прошли регистрацию еще три теста на коронавирус.

По некоторым данным, в Москве проводится около 700 тестов на коронавирус в сутки. В планах у московских властей увеличить этот показатель до 10 тыс. тестов в сутки, а затем довести его до 25—28 тыс. тестов ежедневно.

Новые разработки за рубежом

Компания Bosch выводит на рынок свой тест на коронавирус, который сначала будет доступен в Германии, а вскоре появится в других странах. В его основе лежит диагностический аппарат Vivalytic, который, по словам изготовителей, станет первым автоматизированным тестом на COVID-19. Тест распознает не только коронавирус, но еще шесть респираторных заболеваний, например, вирусы гриппа А и B. Во время лабораторных испытаний аппарата его точность составила 95%.

Как пишет издание ZME Science, анализ может проводиться прямо в стационаре или медицинском центре — не нужно отправлять образцы в лабораторию и ждать, пока придет ответ. Врачи смогут быстрее идентифицировать и изолировать зараженных, а пациентам не придется пребывать в неизвестности несколько дней. Тест прост в обслуживании и не требует специальной подготовки. Медперсоналу нужно только взять мазок из носа или горла пациента, нанести его на картридж, содержащий реагент, и вставить картридж в анализатор. Каждый аппарат может выполнять до десяти анализов за 24 часа.

Еще более оперативный тест на COVID-19 разработали в Великобритании. Он позволяет выявить COVID-19 всего за 30 минут. Чтобы провести его, достаточно портативного оборудования стоимостью около $120 и набора полосок для мазков из носа и горла по $5 каждая. Одновременно проходить тест могут до шести человек.

FDA в экстренном порядке одобрило сверхбыстрый тест на коронавирус, разработанный калифорнийской компанией Cepheid. С его помощью диагноз можно будет поставить всего за 45 минут. Как отмечает Business Insider, для обработки результатов теста не требуется специальное обучение. Нужен лишь доступ к системе Cepheid GeneXpert — в США их 5 тыс., а по всему миру — 23 тыс.

Начало тотального тестирования людей на COVID-19 во всем мире — хорошая новость как для людей, так и для национальных органов здравоохранения. До сих пор в мире нет четкого представления о том, сколько людей заражены коронавирусом и выявление тех, у кого он уже есть: их госпитализация или отправка на домашний карантин позволит быстрее оценить масштаб угрозы и вовремя принять правильные меры.

Заведующий - д.б.н. Андрей Александрович Замятнин

ведущий научный сотрудник, к.б.н. Гороховец Неонила Васильевна
ведущий научный сотрудник, к.б.н. Лукашев Александр Николаевич
ведущий научный сотрудник, к.х.н. Макаров Владимир Алексеевич
старший научный сотрудник, к.х.н. Савватеева Людмила Владимировна
аспиранты Балакирева А.В., Балдин А.В., Кузнецова Н.В., Чепикова О.Е.

Основные направления научной деятельности:
- исследование свойств цистеиновой протеиназы из пшеницы, обладающей глютеназной активностью и разработка на ее основе прототипа лекарственного средства, эффективного при терапии целиакии (глютеновой энтеропатии);
- исследование распространенности глютен-зависимых заболеваний в российской популяции и разработка нового биотехнологического подхода для получения безглютеновых продуктов;
- исследование эффектов и механизмов регуляции метастазирования клеточными факторами при раке почки;
- исследование и разработка иммунотерапевтических препаратов на основе рекомбинантных белков теплового шока HSP70, эффективных при некоторых онкозаболеваниях;
- исследование подавления репликации аденовирусов при помощи РНК-интерференции и разработка прототипа лекарственного средства на основе малых интерферирующих РНК для терапии вирусных инфекционных заболеваний глаз;

Сотрудничество:
- НИИ Физико-Химической биологии имени А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова
- Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова

Основные публикации (2015-2016 гг.):

Balakireva AV, Zamyatnin AA. Properties of Gluten Intolerance: Gluten Structure, Evolution, Pathogenicity and Detoxification Capabilities. Nutrients. 2016 Oct
18;8(10). pii: E644. Review.
Lukashev AN, Zamyatnin AA Jr. Viral Vectors for Gene Therapy: Current State and Clinical Perspectives. Biochemistry (Mosc). 2016 Jul;81(7):700-8. doi: 10.1134/S0006297916070063. Review.
Zamyatnin AA Jr. Special Issue: Genome Editing and Gene Therapy. Biochemistry (Mosc). 2016 Jul;81(7):651-2. doi: 10.1134/S0006297916070014.
Zamyatnin AA Jr. Plant Proteases Involved in Regulated Cell Death. Biochemistry (Mosc). 2015 Dec;80(13):1701-15. doi: 10
.1134/S0006297915130064. Review.
Savvateeva LV, Zamyatnin AA. Prospects of Developing Medicinal Therapeutic Strategies and Pharmaceutical Design for Effective Gluten
Intolerance Treatment. Curr Pharm Des. 2016;22(16):2439-49.
Golovastova MO, Tsoy LV, Bocharnikova AV, Korolev DO, Gancharova OS, Alekseeva EA, Kuznetsova EB, Savvateeva LV, Skorikova EE, Strelnikov VV, Varshavsky VA, Vinarov AZ, Nikolenko VN, Glybochko PV, Zernii EY, Zamyatnin AA Jr, Bazhin AV, Philippov PP. The cancer-retina antigen recoverin as a potential biomarker for renal tumors. Tumour Biol. 2016 Jul;37(7):9899-907. doi: 10.1007/s13277-016-4885-5.
Zernii EY, Baksheeva VE, Iomdina EN, Averina OA, Permyakov SE, Philippov PP, Zamyatnin AA, Senin II. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2016;15(3):267-91.
Savvateeva LV, Schwartz AM, Gorshkova LB, Gorokhovets NV, Makarov VA, Reddy VP, Aliev G, Zamyatnin AA Jr. Prophylactic Admissi
on of an In Vitro Reconstructed Complexes of Human Recombinant Heat Shock Proteins and Melanoma Antigenic Peptides Activates Anti-Melanoma Responses in Mice. Curr Mol Med. 2015;15(5):462-8.
Rudchenko MN, Zamyatnin AA Jr. Prospects for using self-assembled nucleic acid structures. Biochemistry (Mosc). 2015 Apr;80(4):391-9. doi: 10.1134/S000629791504001X. Review.
Savvateeva LV, Gorokhovets NV, Makarov VA, Serebryakova MV, Solovyev AG, Morozov SY, Reddy VP, Zernii EY, Zamyatnin AA Jr, Aliev G. Glutenase and collagenase activities of wheat cysteine protease Triticain-α: feasibility for enzymatic therapy assays. Int J Biochem Cell Biol. 2015 May;62:115-24. doi: 10.1016/j.biocel.2015.03.001.
Baksheeva VE, Nazipova AA, Zinchenko DV, Serebryakova MV, Senin II, Permyakov SE, Philippov PP, Li Y, Zamyatnin AA, Zernii EY, Aliev G. Ca2+ -myristoyl switch in neuronal calcium sensor-1: a role of C-terminal segment. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2015;14(4):437-51.
Herrera AS, Del C A Esparza M, Md Ashraf G, Zamyatnin AA, Aliev G. Beyond mitochondria, what would be the energy source of the cell? Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 2015;15(1):32-41. Review.
Iomdina EN, Khoroshilova-Maslova IP, Robustova OV, Averina OA, Kovaleva NA, Aliev G, Reddy VP, Zamyatnin AA Jr, Skulachev MV, Senin II, Skulachev VP. Mitochondria-targeted antioxidant SkQ1 reverses glaucomatous lesions in rabbits. Front Biosci (Landmark Ed). 2015 Jan 1;20:892-901.

Подготовка к исследованию:

Взятие биоматериала из ротоглотки рекомендуется проводить не ранее чем через 3 часа после последнего приема пищи (не полоскать рот, не пить воду);
перед взятием биоматериала необходимо убедиться в правильной маркировке транспортного контейнера - проверить фамилию и инициалы пациента;
вращательными движениями при помощи зонд-тампона получить материал с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки;
поместить рабочую часть зонда, содержащую исследуемый материал, в пробирку с бесцветной транспортной средой, обломить зонд, прикрывая крышкой пробирки.
оставленный в пробирке зонд плотно закрыть крышкой

Внимание! Недопустимо использование ножниц для обрезания рабочей части зонда! Это может привести к перекрёстной контаминации клиническим материалом и, как следствие, получению ложноположительных результатов.

Условия подготовки пациента при исследовании аспирата из трахеи, мокроты, бронхоальвеолярного лаважа определяет лечащий врач.

Пробирку с биоматериалом поместить в прозрачный полиэтиленовый пакет с застежкой zip-lock. Пакет герметично закрыть. Хранить и транспоровать не более 72 часов при температуре +2+8 о С.

Срок исполнения: до 5 к.д.

Метод исследования: Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Аналитическая чувствительность составляет 1*10^3 ГЭ/мл.

Коронавируы – это большая группа РНК содержащих вирусов, которые могут вызывать различные заболевания как у людей, так и у животных.

Изучение коронавирусов началось в 1960е годы XX века, когда была доказана их связь с развитием респираторных инфекций. Заболевания, вызванные обычными сезонными коронавирусами, не имеют особенных клинических проявлений и ничем не отличаются от других ОРВИ.

В первые месяцы 2020 года мир охватила пандемия, вызванная новым коронавирусом SARS-CoV-2. У 20% заболевших наблюдается развитие пневмонии с формированием дыхательной недостаточности. Наиболее тяжелые случаи требуют проведения респираторной поддержки, искусственной вентиляции легких и интенсивной терапии. Заболевание, вызванное новым коронавирусом, получило собственное название: CoronaVirus Disease 2019 (COVID-19).

Показания к назначению исследования:

диагностика инфекции COVID-19, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2

сдать биологический материал на обследование могут только лица, не имеющие признаков простудных заболеваний и не контактировавшие с людьми, инфицированными COVID-19;
при заказе услуги обязательно предъявление паспорта; при обследовании детей до 14 лет – паспорта законного представителя (родителя, опекуна) и свидетельства о рождении ребенка;
исследование НЕ может быть проведено на условиях анонимности;
при оформлении заказа на выполнение исследования обязателен сбор эпидемиологического анамнеза пациента (сведений о посещении зарубежных стран, о возможных контактах и прочее)

Обследование пациентов, имеющих симптомы простудных заболеваний, осуществляют в рамках системы государственной и муниципальной программ обязательного медицинского страхования в соответствии с действующими нормативными документами. Если у Вас или у Ваших близких повышена температура, появился кашель, боли в мышцах, возникло чувство заложенности в грудной клетке и стало трудно дышать, незамедлительно обратитесь за медицинской помощью!

Референсные значения (вариант нормы):

Параметр	Референсные значения
РНК SARS-CoV-2 (COVID-19)	Не обнаружено

Выявление РНК SARS-CoV-2 свидетельствует о наличии возбудителя.

Мы принимаем на исследование биоматериал, собранный пациентом самостоятельно. Оформление заказа происходит на странице сайта, документы и наборы для самостоятельного взятия сотрудник лаборатории доставит к вам домой. Вы самостоятельно произведете взятие мазка из зева, заполните необходимую документацию и бесконтактно передадите пробы в лабораторию.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

! Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Лаборатория регуляции синтеза белка (рук. Иван Шатский) исследует механизмы трансляции у эукариот и их регуляцию. Официально зарегистрированная тема исследования “Изучение структуры информационных РНК и их комплексов с рибосомами”. До 1989 года группа занималась структурой бактериальных рибосом, но начиная с 1989 года начала работать в области инициации трансляции и ее регуляции у эукариот.

Основные научные результаты
Шатский и его коллеги, задолго до успехов рибосомной кристаллографии, впервые установили в 1983 году, что мРНК делает U-поворот, когда она проходит через рибосому.
Он и его коллеги в 1996 году предложили новый in vitro метод для расшифровки механизмов инициации трансляции в клетках млекопитающих. Он основан на реконструкции комплексов инициации трансляции из индивидуальных очищенных компонентов, соединенной с методами тупринтинга или RelE-принтинга. Используя этот подход, в 1996-2004 годах были выяснены механизмы Внутренней Инициации Трансляции, которые используются геномными РНК пикорнавирусов.
Пестова и др. (1998) и Теренин и др. (2008) нашли, что РНК вируса гепатита С может использовать упрощенный, подобный бактериальному способ инициации трансляции и может обходиться без “обязательного” инициирующего фактора eIF2.
Дмитриев и др. открыл в 2010 году новый фактор трансляции, получивший название eIF2D, который в отличие от всех известных факторов трансляции, приносящих тРНК, не зависит от гуанозинтрифосфата. Его функция в живой клетке остается пока таинственной, но предварительные данные указывают на то, что он может быть вовлечен в гаметогенез.
В 2011 г., Андреев и др. сделали удивительное наблюдение, что РНК полиовируса и, вероятно, всех других членов рода энтеровирусов и рода риновирусов образуют высоко специфичный комплекс с глицил-тРНК синтетазой. Это взаимодействие необходимо для активации инициации трансляции на этих вирусных РНК.
На основании результатов, полученных при изучении нескольких мРНК с длинными структурированными лидерами, предложена новая модель кеп-независимой инициации трансляции, не использующей внутреннюю посадку рибосомы. Структуры мРНК, обеспечивающие кеп-независимость при одновременно требовании к наличию свободного 5'-конца, получили название CITE (cap-independent translational enhancers).
Наконец, Лаборатория недавно инициировала поиск специфических клеточных мРНК, использующих неканонические механизмы инициации трансляции при различных стрессовых условиях, с помощью глубокого сиквенирования, включая рибосомный профайлинг, предложенный недавно Инголия и др. [Science, 2009].

Международное сотрудничество
Лаборатория сотрудничает с коллегами из США, Германии, Великобритании, Испании, Дании, Ирландии, а также с несколькими отечественными лабораториями из Москвы, Новосибирска и Пущино. Особенно тесные связи с лабораториями ак. А.С. Спирина (Институт белка РАН, Пущино), лабораторией Г.Г. Карповой (Институт фундаментальной медицины СО РАН) и лабораторией М.Нипмана (M.Niepmann), Институт Биохимии университета г. Гиссена, Германия.

Статьи

Chichkova N.V., Galiullina R.A., Mochalova L.V., Trusova S.V., Sobri Z.M., Gallois P., Vartapetian A.B. (2018) Arabidopsis thaliana phytaspase: identification and peculiar properties. Functional Plant Biology, >>

Chichkova N., Galiullina R., Beloshistov R., Trusova S., Stintzi A., Schaller A., Vartapetian A. (2017) Plant protease phytaspase: overtaking targets of various locations. FEBS Journal, >>

Trusova S.V., Volik P.I., Chichkova N.V., Vartapetian A.B. (2018) Abscisic acid-induced re-localization of phytaspase. FEBS open bio, >>

Чичкова Н.В., Галиуллина Р.А., Белошистов Р.Е., Трусова С.В., Вартапетян А.Б. (2017) Фитаспазы: апоптотические протеазы растений с субстратной специфичностью каспаз. Acta Naturae (англоязычная версия), >>

Trusova SV, Golyshev SA, Chichkova NV, Vartapetian AB (2019) Sometimes they come back: endocytosis provides localization dynamics of a subtilase in cells committed to cell death. Journal of Experimental Botany, >>

Trusova Svetlana V., Teplova Anastasia D., Golyshev Sergei A., Galiullina Raisa A., Morozova Ekaterina A., Chichkova Nina V., Vartapetian Andrey B. (2019) Clathrin-Mediated Endocytosis Delivers Proteolytically Active Phytaspases Into Plant Cells. Frontiers in plant science, >>

Smirnova Victoria V., Terenin Ilya M., Khutornenko Anastasia A., Andreev Dmitri E., Dmitriev Sergey E., Shatsky Ivan N. (2016) Does HIV-1 mRNA 5’-untranslated region bear an internal ribosome entry site?. Biochimie, >>

Terenin Ilya M., Smirnova Victoria V., Andreev Dmitri E., Dmitriev Sergey E., Shatsky Ivan N. (2017) A researcher’s guide to the galaxy of IRESs. Cellular and Molecular Life Sciences, >>

O’Connor Patrick B.F., Andreev Dmitry E., Baranov Pavel V. (2016) Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nature communications, >>

Andreev DE, O'Connor PB, Loughran G., Dmitriev SE, Baranov PV, Shatsky IN (2017) Insights into the mechanisms of eukaryotic translation gained with ribosome profiling. Nucleic Acids Research, >>

Zhdanov A.V., Andreev D.E., Baranov P.V., Papkovsky D.B. (2017) Low energy costs of F1Fo ATP synthase reversal in colon carcinoma cells deficient in mitochondrial complex IV. Free Radical Biology and Medicine, >>

Akulich Kseniya A., Andreev Dmitry E., Terenin Ilya M., Smirnova Victoria V., Anisimova Aleksandra S., Makeeva Desislava S., Arkhipova Valentina I., Stolboushkina Elena A., Garber Maria B., Prokofjeva Maria M., Spirin Pavel V., Prassolov Vladimir S., Shat (2016) Four translation initiation pathways employed by the leaderless mRNA in eukaryotes. Scientific reports, >>

Nikonova EY, Mihaylina AO, Lekontseva NV, Nikonov OS, Klyashtorny VG, Kravchenko OV, Andreev DE, Shatsky IN, Garber MB (2016) Determination of the Minimal Fragment of the Poliovirus IRES Necessary for the Formation of a Specific Complex with the Human Glycyl-tRNA Synthetase. Biophysics, >>

Andreev Dmitry E., Terenin Ilya M., Dmitriev Sergey E., Shatsky Ivan N. (2016) Pros and cons of pDNA and mRNA transfection to study mRNA translation in mammalian cells. Gene, >>

Terenin Ilya M., Akulich Kseniya A., Andreev Dmitry E., Polyanskaya Sofya A., Shatsky Ivan N., Dmitriev Sergey E. (2016) Sliding of a 43S ribosomal complex from the recognized AUG codon triggered by a delay in eIF2-bound GTP hydrolysis. Nucleic Acids Research, >>

Tzani I., Ivanov IP, Andreev DE, Dmitriev RI, Dean KA, Baranov PV, Atkins JF, Loughran G. (2016) Systematic analysis of the PTEN 5' leader identifies a major AUU initiated proteoform. Open biology, >>

Makeeva Desislava S., Lando Andrey S., Anisimova Aleksandra, Egorov Artyom A., Logacheva Maria D., Penin Alexey A., Andreev Dmitry E., Sinitcyn Pavel G., Terenin Ilya M., Shatsky Ivan N., Kulakovskiy Ivan V., Dmitriev Sergey E. (2019) Translatome and transcriptome analysis of TMA20 (MCT-1) and TMA64 (eIF2D) knockout yeast strains. Data in Brief, >>

Andreev DE, Dmitriev SE, Loughran G., Terenin IM, Baranov PV, Shatsky IN (2018) Translation control of mRNAs encoding mammalian translation initiation factors. Gene. Gene, >>

Shatsky IN, Terenin IM, Smirnova VV, Andreev DE (2018) Cap-Independent Translation: What's in a Name. Trends in Biochemical Sciences, >>

Andreev Dmitry E., Arnold Maxim, Kiniry Stephen J., Loughran Gary, Michel Audrey M., Rachinskii Dmitrii, Baranov Pavel V. (2018) TASEP modelling provides a parsimonious explanation for the ability of a single uORF to derepress translation during the integrated stress response. eLife, >>

Gerresheim GK, Bathke J., Michel AM, Andreev DE, Shalamova LA, Rossbach O., Hu P., Glebe D., Fricke M., Marz M., Goesmann A., Kiniry SJ, Baranov PV, Shatsky IN, Niepmann M. (2019) Cellular Gene Expression during Hepatitis C Virus Replication as Revealed by Ribosome Profiling. International Journal of Molecular Sciences, >>

Yordanova Martina M., Loughran Gary, Zhdanov Alexander V., Mariotti Marco, Kiniry Stephen J., O’Connor Patrick B.F., Andreev Dmitry E., Tzani Ioanna, Saffert Paul, Michel Audrey M., Gladyshev Vadim N., Papkovsky Dmitry B., Atkins John F., Baranov Pavel V. (2018) AMD1 mRNA employs ribosome stalling as a mechanism for molecular memory formation. Nature, >>

Akulich Kseniya A., Sinitcyn Pavel G., Makeeva Desislava S., Andreev Dmitry E., Terenin Ilya M., Anisimova Aleksandra S., Shatsky Ivan N., Dmitriev Sergey E. (2019) A novel uORF-based regulatory mechanism controls translation of the human MDM2 and eIF2D mRNAs during stress. Biochimie, >>

Susorov D., Zakharov N., Shuvalova E., Ivanov A., Egorova T., Shuvalov A., Shatsky IN, Alkalaeva E. (2018) Eukaryotic translation elongation factor 2 (eEF2) catalyzes reverse translocation of the eukaryotic ribosome. Journal of Biological Chemistry, >>

Young David J., Makeeva Desislava S., Zhang Fan, Anisimova Aleksandra S., Stolboushkina Elena A., Ghobakhlou Fardin, Shatsky Ivan N., Dmitriev Sergey E., Hinnebusch Alan G., Guydosh Nicholas R. (2018) Tma64/eIF2D, Tma20/MCT-1, and Tma22/DENR Recycle Post-termination 40S Subunits In Vivo. Molecular Cell, >>

Smirnova Victoria V., Shestakova Ekaterina D., Bikmetov Dmitry V., Chugunova Anastasiya A., Osterman Ilya A., Serebryakova Marina V., Sergeeva Olga V., Zatsepin Timofei S., Shatsky Ivan N., Terenin Ilya M. (2019) eIF4G2 balances its own mRNA translation via a PCBP2-based feedback loop. RNA, >>

Ivanov Alexander, Shuvalova Ekaterina, Egorova Tatiana, Shuvalov Alexey, Sokolova Elizaveta, Bizyaev Nikita, Shatsky Ivan, Terenin Ilya, Alkalaeva Elena (2019) PABP-interacting proteins, PAIP1 and PAIP2, affect translation termination. Journal of Biological Chemistry, >>

При выборе лаборатории стоит обращать внимание на уровень сервиса и ценовую политику.

Некоторые лаборатории предоставляют возможность срочного выполнения части исследований.

Прием некоторых лекарств может повлиять на результаты анализов. Узнайте, как подготовиться к сдаче биоматериала на анализ.

Сдать биоматериал для исследования можно не выходя из дома.

Специальные предложения, скидки и акции помогут существенно сэкономить на медицинском обследовании.

За звучной аббревиатурой ПЦР скрывается сложная и не слишком понятная для рядового пациента расшифровка — полимеразная цепная реакция. Что же такое ПЦР-диагностика, на чем она основана и почему в последнее время ее стали считать самой перспективной технологией в постановке диагнозов, касающихся инфекционных и вирусных заболеваний? Мы расскажем о преимуществах ПЦР-метода, его особенностях и этапах проведения.

ПЦР-диагностика: что это такое?

Диагностика методом ПЦР существует чуть более 30 лет. Значительно эволюционировав за это время, она зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. В основе метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Цикл образования новой молекулы ДНК занимает всего около 3 минут, а тридцати-сорока циклов вполне достаточно, чтобы получить количество молекул, необходимое для достоверного визуального определения методом электрофореза.

Кроме амплификации, то есть простого увеличения числа копий молекулы ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это позволяет использовать ПЦР не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

ПЦР-диагностика проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. На сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов рибонуклеиновой кислоты (РНК). В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Это не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше увеличивает точность исследования методом ПЦР.

В клинической медицине ПЦР-диагностика является одним из наиболее востребованных методов анализа в самых разных сферах:

Прямое определение возбудителя инфекции. Некоторые традиционные методы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), выделяют только белки-маркеры, которые являются продуктом жизнедеятельности возбудителей инфекции, а потому только косвенно указывают на присутствие микроорганизмов. Наличие специфического участка в ДНК, выявленное с помощью ПЦР, безошибочно или почти безошибочно указывает на присутствие конкретной инфекции.
Высокая специфичность метода. Она обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется фрагмент ДНК, характерный только для конкретного возбудителя инфекции. Специфичность исключает возможность ложных результатов анализа, тогда как в иммунологических методах исследований ошибки вполне вероятны из-за перекрестной реакции антигенов.
Высокая чувствительность. При помощи ПЦР-диагностики можно выявить присутствие в организме даже единичных клеток вирусов или бактерий в тех случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. ПРЦ определяет наличие всего 10–100 клеток в пробе, тогда как иммунологическими и микроскопическими тестами можно определить наличие инфекции при количестве клеток не менее 103–105.
Универсальность. Сходство состава всех ДНК или РНК дает возможность применять универсальные методы лабораторных исследований, диагностируя сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы.
Скорость получения результатов. Поскольку для проведения ПЦР-диагностики не нужен посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени на нее не требуется. Весь цикл — от забора биоматериала до получения результатов — занимает 4–5 часов.
Диагностика латентных инфекций. ПЦР-методом диагностируются трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, встречающиеся в тех случаях, когда заболевание протекает в скрытой форме.

Методом ПЦР можно выявлять возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания.

Тем не менее не стоит думать, что ПЦР-диагностика не имеет недостатков. У нее есть свои ограничения, но их количество настолько незначительно, что не может отрицательно повлиять на популярность и эффективность метода:

Вероятность амплификации ДНК не только живого, но и погибшего микроорганизма. При проведении ПЦР-диагностики для контроля эффективности лечения необходимо соблюдать определенные требования. В частности, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1–2 месяца), за который происходит полное исчезновение возбудителя инфекции в организме.
Возможность возникновения перекрестной реакции. Подбор фрагментов ДНК (праймеров) осуществляется на основе знаний о генетическом строении конкретного микроорганизма. Но теоретически такой же фрагмент может присутствовать и у других микроорганизмов, геном которых на сегодняшний день еще не расшифрован. Их присутствие в пробе может привести к ложноположительному результату анализа.
Изменчивость микроорганизмов. Эта способность возбудителей к мутации иногда приводит к тому, что некоторые их штаммы становятся неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Чтобы уменьшить риски, разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

ПЦР-диагностика проводится в специальной лаборатории в несколько этапов.

Забор биоматериала. Процедура, предшествующая непосредственному анализу, которая осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Забор делается с помощью стерильного оборудования только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть:
- Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек: из уретры, из цервикального канала, со слизистой дыхательных путей и зева, из конъюнктивы. Забор проводится с помощью специального ершика, при этом недопустимо попадание в материал следов крови.
- Моча. Собираются первые 50 г утренней мочи в стерильную емкость. Материал используется для диагностики мочеполовых инфекций.
- Мокрота. Используется для ПЦР-диагностики туберкулеза и респираторных форм микоплазмоза и хламидиоза. Мокроту собирают в стерильный флакон в количестве 15–20 мг.
- Кровь, сыворотка, плазма. С их помощью диагностируются гепатиты, герпес, ВИЧ-инфекция. Для анализа используется венозная кровь (1–1,5 мл), собранная у пациента натощак в стерильную пробирку. Хранить биоматериал можно не более суток при температуре 4°С. Замораживать кровь категорически запрещается.
- Биологические жидкости. К ним относятся слюна, сок простаты, околоплодная, плевральная, спинномозговая, суставная жидкости. Собираются при помощи пункции с использованием стерильного инструментария в количестве 0,1–1,5 мл в стерильные пробирки.
- Биоптаты, т.е. материалы, полученные путем биопсии. Обычно на анализ отправляют биоптаты двенадцатиперстной кишки или желудка, чтобы выявить хеликобактерную инфекцию. Объем материала 2–3 мм 3 .
Хранение и транспортировка биоматериала. Хранить образцы можно при комнатной температуре не более 2 часов. Если необходимо длительное хранение, то пробы помещают в холодильник с температурой 2–8°С на срок не более одних суток. Допустимо хранение некоторых биоматериалов в течение двух недель в замороженном виде при температуре -20°С. Оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если она необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах с соблюдением всех правил хранения и перевозки биоматериалов.
Выделение ДНК из образца. Способ выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца. Если, например, анализируется соскоб эпителиальных клеток, используется так называемый метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении в образец специального вещества, концентрации ДНК на сорбенте и его многократной отмывке буферным раствором.
Проведение ПЦР. Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляется амплификационная смесь, имеющая сложный состав, в объеме 25 мл. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическом режиме проводится амплификация. Время ее проведения зависит от заданной программы и составляет 2–3 часа. Одновременно с опытными пробами проводятся контрольные — положительные, включающие в себя контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя, и отрицательные, не содержащие исследуемую ДНК. Количество циклов амплификации варьирует от 30 до 40, более 40 циклов проводить не рекомендуется, так как это способствует увеличению количества неспецифических продуктов в пробе.
Регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества — бромистого этидия. Его соединение с фрагментами ДНК дает светящиеся полосы при облучении ультрафиолетовым излучением. Образец помещают в камеру для электрофореза и в течение 35–40 минут проводят разделение продуктов амплификации. После этого образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие оранжевой светящейся полосы свидетельствует о положительном результате.
Интерпретация результатов исследования. Результат ПЦР-диагностики может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции, причем именно в данный момент времени. Количественный результат ПЦР-анализа оценить может только врач, они индивидуальны для разных типов инфекций. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Цена ПЦР-диагностики зависит от того, на какую конкретно инфекцию пациент планирует проверяться, от вида анализируемого материала, методики тестирования — качественной или количественной. Цена за определение одной инфекции составляет от 200 до 800 рублей в разных клиниках. Кроме того, к стоимости анализа добавится и плата за забор биоматериала — около 400 рублей. Средняя стоимость ПЦР-диагностики разных видов приведена в таблице 1.

Таблица 1. Примерные цены на анализы ПЦР в Москве

Название анализа	Цена, руб.
Определение ДНК хламидия	750
Определение ДНК микоплазмы хоминис	540
Определение микоплазмы гениталиум	350
Определение ДНК уреаплазмы	350
Гонококк, определение ДНК	350
Определение ДНК герпеса (разные типы)	350–600
Определение ДНК кандиды	570
Вирус краснухи, определение РНК	800
Дифференцированное определение ДНК ВПЧ (разные типы)	350–1900 [1]

Читайте также: